Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

- Umieść jednego transgenicznego robaka eksprymującego GCaMP - białko wykrywające wapń - w komorze obrazowania wraz z pokarmem bakteryjnym dla robaka. Następnie uszczelnij naczynie pokrywką i folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu. Zobacz go pod mikroskopem złożonym wyposażonym w epifluorescencję szerokiego pola. Nagrywaj poklatkowe obrazy robaków, aby śledzić ich zachowanie i rejestrować fluorescencję za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Transgeniczne robaki wyrażają białko czujnika GCaMP pod kontrolą promotora, który napędza ekspresję GCaMP w określonym neuronie. Kiedy ten neuron jest aktywowany, wystrzeliwuje potencjał czynnościowy, który depolaryzuje błonę plazmatyczną. Po depolaryzacji w błonie plazmatycznej otwierają się bramkowane napięciem kanały wapniowe. Powoduje to napływ jonów wapnia do komórki, co powoduje pobudzenie neuronów.

GCaMP w wzbudzonym neuronie wiąże jony wapnia. Powoduje to, że GCaMP fluoryzuje, gdy robaki są obrazowane za pomocą światła wzbudzającego fluorescencji o niskiej intensywności. W przykładowym protokole użyjemy obrazowania wapnia do wizualizacji aktywności interneuronów AVA u transgenicznych C. elegans w mikrokomorach agarozy.

- Obrazowanie wapnia wykonuje się na mikroskopie złożonym wyposażonym w epifluorescencję szerokokątną. Aby ograniczyć ekspozycję na światło, należy użyć sygnału logicznego tranzystor-tranzystor, który wyzwala diodę LED, aby oświetlić próbkę w tym samym czasie, gdy kamera rejestruje klatkę.

Przez 24 godziny można odtwarzać film z serii obrazów, który obrazuje każdego robaka co 15–30 minut. Najpierw nagraj 20 sekund za pomocą DIC, następnie 20 sekund za pomocą fluorescencji GFP, a na końcu obraz sygnału mKate2 dla kontrolnych poziomów ekspresji.

Do wizualnej kontroli danych należy użyć mapy fałszywych kolorów, aby zwiększyć widoczność niewielkich zmian intensywności fluorescencji. Na koniec przeprowadź analizę danych dotyczących wapnia przy użyciu standardowych procedur.