Laserowe ranienie naskórka: wywoływanie miejscowych uszkodzeń w celu zbadania procesów naprawczych u C. elegans

- Na początek przenieś młode dorosłe robaki na świeżą podkładkę agarozową na szkiełku. Następnie dodaj kilka kropli 12-milimolowego roztworu lewamizolu, aby sparaliżować robaki. Przykryj robaki szkiełkiem nakrywkowym i odczekaj kilka minut. Umieść szkiełko pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem i skup się na bocznej zewnętrznej powierzchni robaka.

Naskórek dorosłego robaka jest cienką, jednowarstwową strukturą składającą się z wielojądrowych syncytii, które powstają w wyniku fuzji komórek. Wierzchołkowa powierzchnia naskórka wydziela elastyczny kolagenowy naskórek, podczas gdy powierzchnia podstawna pokryta jest cienką warstwą macierzy zewnątrzkomórkowej zwaną blaszką podstawną.

Następnie należy owinąć wierzchołkową powierzchnię naskórka za pomocą lasera. Cytoplazma z uszkodzonych komórek może wyciekać, pojawiając się jako pęcherzyk w miejscu rany.

Naświetlanie laserowe ma przewagę nad innymi technikami, takimi jak nakręcanie igłą, ponieważ powoduje miejscowe przerwanie naskórka i komórek naskórka, nie uszkadzając przy tym tkanek wewnętrznych. W przykładowym protokole zobaczymy proces ranienia laserowego u C. elegans.

- Aby precyzyjnie nawinąć nicienie, protokół ten wykorzystuje laser femtosekundowy przymocowany do mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Powinny również wystarczyć skany liniowe lub punktowe za pomocą laserów femtosekundowych, takich jak te w mikroskopach dwufotonowych.

- Zacznij od zebrania 10 młodych dorosłych na podkładce z agarem. Sparaliżuj je w dwumikrolitrowej kropli 12-milimolowego roztworu lewamizolu. Następnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym i odczekaj kilka minut, aż sparaliżują.

- Bardzo ważne jest, aby zwierzę było całkowicie sparaliżowane. 12-milimolowy lewamizol nie wpłynie na reakcję na ranę. Można jednak zastosować również inne metody unieruchomienia.

- Upewnij się, że moc lasera femtosekundowego jest ustawiona na 140 miliwatów, mierzona przed obiektywem, a częstotliwość powtarzania lasera wynosi 80 megaherców. Teraz zlokalizuj robaki pod mikroskopem konfokalnym z wirującym dyskiem. Używając obiektywu 100x z dużą aperturą numeryczną, skup się na bocznym przednim lub tylnym naskórku syncytialnym docelowego robaka.

Skupiając się na wierzchołkowej powierzchni komórki naskórka, świec laserem przez dwa 200 milisekundowe impulsy oddalone od siebie o 20 milisekund. Powinno to wystarczyć do zranienia naskórka. Poczekaj chwilę i obserwuj miejscowe rozerwanie cytoplazmy, które objawi się bulgotaniem. Jeśli obecny jest marker fluorescencyjny, można zaobserwować miejscowe wybielanie.