JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 2:56 min • April 30th, 2023
- C. elegans jest stosowany jako eksperymentalny model zakażenia patogenami jelitowymi, które wywołują chorobę, częściowo poprzez przerwanie bariery jelitowej, zwiększając jej przepuszczalność. Aby określić ilościowo integralność bariery po ekspozycji na bakterie lub związek chemiczny będący przedmiotem zainteresowania, zbierz robaki, zmywając je z ich talerzy.
Następnie umieść te robaki na płytkach agarowych z oznakowaną żywnością składającą się z zabitych termicznie E. coli zmieszanych z dekstranem FITC, polisacharydem o wysokiej masie cząsteczkowej ze znacznikiem fluorescencyjnym.
Pozwól robakom zjeść oznaczone bakterie. Osoby z nienaruszonymi barierami jelitowymi szybko usuwają pokarm, podczas gdy u robaków z bardziej przepuszczalnymi jelitami marker fluorescencyjny przeniknie poza światło narządu.
Przenieś robaki do roztworu formaldehydu, aby naprawić zwierzęta. Po 1 do 2 minutach zastąp formaldehyd mediami montażowymi.
Na koniec zobrazuj robaki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Należy pamiętać, że granulki jelitowe C. elegans są autofluorescencyjne, więc będzie sygnał tła. Ale ogólnie rzecz biorąc, większa fluorescencja jelitowa wskazuje na wyższą przepuszczalność.
W przykładowym protokole oznaczymy wpływ leczenia biomolekułą DIM na przepuszczalność jelit robaków zakażonych chorobotwórczymi bakteriami Pseudomonas aeruginosa.
- Przygotuj płytki uzupełnione dekstranem FITC, mieszając 2 mililitry inaktywowanej termicznie E. coli z 4 miligramami dekstranu FITC. Dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny do każdej z 20 świeżych płytek agarowych NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia na godzinę na czystym stole laboratoryjnym. Po 48 godzinach od zabiegu umyj robaki S Buffer. Przenieść je na płytki z dodatkiem FITC-dekstranu i na płytki NGM bez FITC-dekstranu i inkubować płytki przez noc.
Następnego dnia umyj robaki buforem S i pozwól im czołgać się w świeżej płytce agarowej NGM przez godzinę. Dodaj 50 mikrolitrów 4% formaldehydu do każdej studzienki czarnej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem i przenieś około 50 robaków do każdej studzienki. Po 1 do 2 minutach usuń cały formaldehyd i dodaj 100 mikrolitrów podłoża montażowego do każdej studzienki.
- Formaldehyd jest toksyczną substancją chemiczną i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
W niniejszym badaniu wykorzystano C. elegans jako organizm modelowy do analizy przepuszczalności jelit w odpowiedzi na infekcje patogenne. Metodyka obejmuje ilościowe określanie integralności bariery po ekspozycji na bakterie lub związki chemiczne.
Ilościowe określanie przepuszczalności jelit u C. elegans poprzez podawanie dekstranu FITC zapewnia solidny, skalowalny odczyt integralności bariery w odpowiedzi na ekspozycję bakteryjną lub chemiczną. Analiza ta umożliwia wczesne ograniczanie ryzyka mechanistycznego i wspiera pewność prognostyczną w walidacji celu dla funkcji bariery jelitowej. Metoda ta jest przeznaczona do segregacji portfela projektów, w których przepuszczalność jelit stanowi kluczowy punkt końcowy w badaniach translacyjnych.
Ten test podawania dekstranu znakowanego FITC wpisuje się w kontinuum badań nad barierą jelitową — od etapu odkryć po badania przedkliniczne — wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026