JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:59 min. • April 30th, 2023
- Aby przygotować się do wstrzyknięcia, użyj wykałaczki do robaków, aby położyć ślad oleju halowęglowego na podkładce agarozowej. Umieść robaki w oleju i unieruchamiaj je, delikatnie dociskając je do podkładki agarowej. Upewnij się, że olej całkowicie pokrywa zwierzęta. Umożliwia dotarcie tlenu do robaków, jednocześnie zapobiegając wysuszeniu. Następnie umieść podkładkę agarozową na mikroskopie iniekcyjnym i ustaw igłę prostopadle do robaka, celując w dystalny koniec ramienia gonady.
Delikatnie przepchnij igłę przez naskórek i wstrzyknij ramieniu gonady kwas nukleinowy lub związek będący przedmiotem zainteresowania. Każde ramię gonady zawiera syncytium linii zarodkowej, które rozwinie się w indywidualne oocyty. Materiał wstrzyknięty do gonady dystalnej zostanie włączony do tych oocytów i wpłynie na następne pokolenie.
Po wstrzyknięciu robaków należy wymienić olej na bufor M9. Gdy robaki zaczną się poruszać, przenieś je na płytkę agarową NGM z pokarmem bakteryjnym. W poniższym protokole metoda mikroiniekcji gonad jest stosowana do dostarczania kompleksu Cas9 w celu namierzenia i edycji genu dpy-10.
- Rozpocznij od przygotowania płatków C. elegans i agarozy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieścić nakładkę do wstrzykiwań z agarozą i szkiełko nakrywkowe na lunecie preparacyjnym. Użyj wykałaczki ślimakowej, aby ułożyć mały ślad oleju halowęglowego wzdłuż jednej krawędzi podkładki. Następnie użyj szpikulca pokrytego olejem, aby podnieść kilka robaków z płytki agarowej NG na ścieżkę oleju. Za pomocą cienkiego włoska przymocowanego do pipety, takiej jak wąs do rzęs lub kota, ustaw robaki równolegle, delikatnie wpychając robaki do podkładki agarozowej. Dopóki procedura mikroiniekcji nie jest wygodna, należy montować i wstrzykiwać tylko jednego robaka na raz.
Po ustawieniu się na miejscu i przymocowaniu do podkładki, pokryj robaki kolejnymi kilkoma kroplami oleju halowęglowego z końcówki kilofa. Umieścić szkiełko nakrywkowe z zamontowanymi ślimakami na mikroskopie iniekcyjnym. W małym powiększeniu ułożyć robaki prostopadle do igły iniekcyjnej, która została wypełniona roztworem RNP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Przełącz się na duże powiększenie i zmień położenie igły przylegającej do ramienia gonady, odpowiadając obszarowi w pobliżu jąder w środkowym lub późnym pachytenie. Za pomocą mikromanipulatora przysuń igłę do robaka, lekko dociskając naskórek. Następnie jedną ręką dotknij boku stolika mikroskopu, aby przebić igłę przez naskórek. Nacisnąć pedał lub przycisk wstrzykiwań, powoli napełnić ramię gonady mieszanką do wstrzykiwań i wyjąć igłę. Powtórz ten krok z drugim ramieniem gonady.
Po wstrzyknięciu robaków usuń szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej i umieść je pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej usunąć olej z robaków, pipetując na nie bufor M9. Wykonaj ten zabieg, aby uwolnić robaki z agaru. Po 10 minutach, gdy robaki będą się miotać w buforze, przenieś je na płytkę agarową NG z bakteriami OP50 za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej. Umieść płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin, aż robaki zregenerują się i zaczną się poruszać. Po odzyskaniu należy indywidualnie przenieść robaki na płytki agarowe NG za pomocą OP50 Następnie przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza.