Wstrzyknięcie morfolino: metoda obniżania docelowej ekspresji genów w celu zbadania funkcji u danio pręgowanego

- Jednym ze sposobów określenia funkcji genu jest obniżenie jego ekspresji i obserwacja efektu. Oligomery morfolino są często stosowane w badaniach nad powalaniem u danio pręgowanego. Morfolino to syntetyczna cząsteczka podobna do DNA o długości około 25 zasad, która hamuje ekspresję genów docelowych.

W celu leczenia morfoliną należy umieścić znieczuloną rybę z częściowo amputowaną płetwą ogonową na płytce iniekcyjnej i umieścić płytkę pod mikroskopem stereoskopowym. Wstrzyknąć tylko stronę grzbietową, podczas gdy niewstrzyknięta strona brzuszna działa jako kontrola. Morfolinosy mogą funkcjonować na dwa sposoby, w zależności od sekwencji, do której dążą. Po pierwsze, łączą się z miejscem rozpoczęcia translacji na mRNA i zapobiegają syntezie białek poprzez blokowanie translacji.

Po drugie, może wiązać się ze złączem intron-ekson na pre-mRNA i uniemożliwiać prawidłowe splicing, co skutkuje wadliwym transkryptem, który zostanie zdegradowany przez komórkę. Później zbadaj płetwy ogonowe pod kątem wyrostka. Różnice między odrastaniem regionów leczonych morfoliną i nieleczonych wskazują, że docelowe białko odgrywa rolę w regeneracji płetw. W tym protokole użyjemy morfolinosów w ramach testu regeneracji płetw ogonowych.

- Dzień przed wstrzyknięciem morfolino należy wykonać płytkę iniekcyjną z 2% agarozą, która ma wycięcie na jednym końcu dołka, co pomoże ustabilizować rybę do zabiegu iniekcji. Tuż przed wstrzyknięciem rozcieńczyć morfolino znakowane fluorosceiną w wodzie wolnej od RNAaz i DNAaz do odpowiedniego stężenia i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Załadować wcześniej przygotowaną igłę do wstrzykiwań i odciąć końcówkę pod kątem.

Następnie znieczulić rybę i umieścić ją na płytce iniekcyjnej. Usuń cały nadmiar płynu i umieść płytkę na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Ustaw igłę dystalnie w stosunku do promienia kostnego.

Delikatnie wbij igłę w tkankę regeneracyjną dystalnie do każdego promienia kostnego i wciśnij dystalnie, aż znajdzie się w blastemie. Gdy igła jest prawidłowo zlokalizowana, postępuj zgodnie ze wskazówkami systemu mikroiniekcji i wstrzyknij pięciolitrową kroplę morpholino na wstrzyknięcie. Przy każdym wstrzyknięciu można zauważyć żółte zaciągnięcie roztworem morfoliny, co pomaga zlokalizować wstrzyknięcie w blastemie. Pracując grzbietowo od linii środkowej, wstrzyknąć około 75 nanolitrów morfoliny na promień kostny po stronie grzbietowej, pozostawiając stronę brzuszną jako kontrolę tylko do elektroporacji.