JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 2:05 min • April 30th, 2023
- Najpierw umieść znieczuloną rybę stroną grzbietową skierowaną do góry we wstępnie zwilżonej gąbce. Przed elektroporacją wstrzyknij materiał genetyczny do tkanki docelowej, w tym przypadku części przodomózgowia zwanej kresomózgowiem. Następnie nałóż niewielką ilość żelu ultradźwiękowego na głowę. Nałóż również żel na końcówkę elektrod, aby ułatwić wydajną pracę. Umieść elektrodę dodatnią po brzusznej stronie głowy, a elektrodę ujemną po stronie grzbietowej.
Teraz delikatnie dociśnij elektrody do głowy i podaj kilka impulsów prądu elektrycznego. Prąd tworzy tymczasowe pory w błonie plazmatycznej elektroporowanych ogniw i sprawia, że stają się one przepuszczalne. Prąd ułatwia również przemieszczanie się ujemnie naładowanych cząstek, takich jak plazmidy ekspresji DNA lub oligonukleotydy RNAi obecne w otoczeniu, do komórek. W poniższym przykładzie użyjemy elektroporacji do wprowadzenia rekombinowanego plazmidu do komórek wyściółki mózgowej, komórek macierzystych odpowiedzialnych za generowanie nowych neuronów.
- Przykryj rybę kresomózgowiem niewielką ilością żelu do ultradźwięków. W celu elektroporacji zwierzęcia, któremu wstrzyknięto plazmid, wyjmij gąbkę z zestawu do wyrzucania i zanurz wewnętrzną stronę końcówek elektrod w żelu ultradźwiękowym. Umieść głowę ryby między elektrodami, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się po brzusznej stronie głowy, a elektroda ujemna po stronie grzbietowej. Następnie, nadal trzymając ciało ryby w gąbce, delikatnie i precyzyjnie dociśnij elektrody do kresomózgowia i podawaj prąd za pomocą pedału nożnego, przytrzymując elektrody na miejscu, aż wszystkie pięć impulsów zostanie zakończonych.