JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 4:47 min • April 30th, 2023
- Kardiomiopatia to stan, w którym mięsień sercowy słabnie i traci zdolność pompowania krwi. Ten stan można powtórzyć u danio pręgowanego. Najpierw rozcieńczyć podstawowy roztwór leku odpowiedzialnego za kardiotoksyczność w zrównoważonym roztworze soli Hanksa, aby przygotować kilka stężeń roboczych. Następnie umieść znieczuloną rybę znieczuloną tricainą, brzuszną stroną do góry, na gąbce podtrzymującej pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść igłę między płetwami brzusznymi pod kątem 45 stopni od poziomu.
Teraz delikatnie wepchnij igłę na 1 do 2 milimetrów do jamy otrzewnej i powoli wstrzyknij roztwór leku. Odczekaj pięć sekund przed wyciągnięciem igły, aby zapobiec wyciekaniu roztworu. Natychmiast przenieś rybę do czystego zbiornika zawierającego świeżą wodę systemową. Rejestruj liczbę ryb umierających każdego dnia z powodu ciężkiej kardiotoksyczności, uszkodzenia mięśnia sercowego. Lek wiąże się z receptorami śmierci obecnymi na błonie komórkowej kardiomiocytów i wyzwala apoptozę, powodując ciężką kardiotoksyczność.
Utwórz krzywą przeżycia, wykres przedstawiający prawdopodobieństwo przeżycia w czasie dla każdego stężenia leku. W tym przykładzie wstrzykniemy doksorubicynę lub DOX, aby wywołać kardiomiopatię u dorosłego danio pręgowanego na dwa sposoby.
Przed wstrzyknięciem rybie DOX należy pościć rybę przez 24 godziny. Następnie pogrupuj ryby. Podczas znieczulania użyj czystej bibuły filtracyjnej, aby wysuszyć każdą rybę i zmierzyć jej masę ciała. Twórz grupy ryb, które znajdują się w granicach 10% tej samej masy ciała, tak aby każdej grupie można było wstrzyknąć tę samą dawkę DOX. Następnie należy obliczyć stężenie robocze DOX dla każdej grupy, tak aby każdej grupie wstrzyknięto pięć mikrolitrów roztworu i otrzymała taką samą dawkę DOX w przeliczeniu na masę ciała.
Następnie rozcieńczyć zapas DOX w 1x HBSS. Wymieszaj rozcieńczenie z wirem, a następnie pulsacyjnie wiruj rozcieńczenie, aby utrzymać je razem w probówce. Do wstrzyknięcia należy przygotować platformę do wstrzykiwań. Na czystej 100-milimetrowej szalce Petriego umieść gąbkę. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego wytnij wgłębienie w gąbce, aby pomieścić jedną rybę, zwykle działają cztery centymetry.
Następnie na igłę o rozmiarze 34 przymocuj mikrostrzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów. Następnie przepłucz igłę 1x HBSS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki lub bloki ze strzykawki i rurki. Teraz krótko znieczul dorosłą rybę tricainą. Następnie zanurzyć gąbkę w wodzie zarodka z tricainą i przenieść rybę na gąbkę brzuchem do góry w celu wstrzyknięcia. Teraz wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór DOX, szybko wprowadzając igłę pod kątem 45 stopni w linię środkową między płetwami miednicznymi na głębokość około 1 do 2 milimetrów.
Następnie powoli uwolnij cały roztwór DOX. Przed wycofaniem igły należy odczekać pięć sekund. Alternatywnie rybę można ustawić z boku z wnętrzem po prawej stronie. Następnie wstrzyknął linię boczną nad płetwą miedniczną ze skosem skierowanym do góry w kierunku godziny 7 pod kątem 45 stopni i na głębokość od 3 do 4 milimetrów. Jeśli którakolwiek z metod wstrzyknięcia była skuteczna, na brzuchu pojawi się czerwony odcień.
Po wstrzyknięciu należy szybko przenieść rybę do czystego zbiornika przeprawowego wypełnionego świeżą wodą systemową, gdzie może dojść do siebie. Następnie przepłukać igłę HBSS i przystąpić do wstrzykiwania następnej ryby. Później należy zwrócić wstrzyknięte ryby do systemu z działającym obiegiem, ale oddzielonego od głównego systemu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Przez następne 24 godziny kontynuuj poszczenie ryb. Przez pierwszy tydzień, po wstrzyknięciu, należy codziennie sprawdzać rybę i usuwać wszelkie martwe ryby.