Kokultura 3D komórek raka płuc z CAF: system modelowy in vitro do badania progresji guza

- W kokulturach 3D wiele typów komórek jest hodowanych razem w matrycach, takich jak macierz błony podstawnej, która naśladuje naturalne mikrośrodowisko macierzy zewnątrzkomórkowej, ułatwiając interakcje komórka-komórka i komórka-macierz. Aby ustanowić osadzoną kokulturę 3D, przygotuj jednolitą zawiesinę fibroblastów związanych z rakiem lub CAF i komórek raka płuc pobranych w stosunku dwa do jednego, w macierzy błony podstawnej. Utrzymuj zawiesinę na lodzie, aby zapobiec krzepnięciu matrycy w temperaturze otoczenia.

Przenieść odpowiednią objętość zawiesiny na płytkę do hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez wymagany czas, aby wspólnie osadzić komórki w matrycy. Aby ustanowić nałożoną kokulturę 3D, należy przygotować zawiesinę komórek raka płuc w macierzy błony podstawnej, w pożądanej gęstości komórek. Utrzymywać zawiesinę na lodzie. Odpipetować odpowiednią objętość zawiesiny macierzy komórkowej do płytki do hodowli komórkowej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby skonfigurować osadzoną monokulturę komórek rakowych.

Następnie przenieś żądaną objętość CAF zawieszonych w preferowanych pożywkach hodowlanych na osadzone komórki rakowe. W kokulturach 3D CAF zwiększają tworzenie sferoidów komórek rakowych i przyciągają komórki rakowe, co skutkuje strukturami przypominającymi łzy. W tym protokole będziemy wspólnie hodować komórki raka płuc TUM622 i CAF w celu zbadania ich interakcji.

- Po przygotowaniu zawiesin komórkowych TUM622 i CAF, jak opisano wcześniej, policz gęstość komórek CAF, mieszając 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego. Dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do każdej z dwóch komór na hemocytometrze, aby policzyć i obliczyć gęstość komórek. Aby współosadzić komórki TUM622 i CAF w macierzy błony podstawnej, najpierw oblicz żądaną liczbę komórek używanych do posiewu na podstawie informacji o gęstości komórek. CAF są wysiewane w stosunku 2 do 1 komórek TUM622. Przenieś obliczoną objętość TUM622, a także zawiesinę komórek CAF, do tej samej probówki wirówkowej. Odkręć i zassaj całe medium. Zawiesić w macierzy membrany podstawnej i płytce 310 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki płytki 24-dołkowej. W celu immunofluorescencji przenieś 60 mikrolitrów mieszanin TUM622 i CAF do szkiełek komorowych, jak opisano wcześniej.

Aby współhodować TUM622 z nałożonymi CAF w macierzy błony podstawnej, najpierw ustaw monokulturę TUM622, jak opisano wcześniej. Przenieść dwukrotną ilość zawiesiny CAF do probówki wirówkowej i wirować z prędkością 300 razy "g" przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić CAF w jednym mililitrze pożywki hodowlanej 3D. Przenieś jednomililitrową zawiesinę CAF do studzienki zawierającej osadzone komórki TUM622.