Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

- Najpierw umieść jajka na szalce Petriego i dodaj roztwór Danieau, aby zachować świeżo zebrane jajka. Dodaj fenylotiomocznik, aby zahamować pigmentację i inkubować przez kilka dni. Po inkubacji odkorówkować zarodki za pomocą ostrych kleszczy i pozwolić im dalej rosnąć.

Następnie wysiewaj pożądaną liczbę komórek rakowych w kolbie hodowlanej i inkubuj przez noc. Teraz dodaj związki przeciwnowotworowe i kontynuuj inkubację. Po inkubacji dodaj fluorescencyjny barwnik śledzący komórki, który zwiąże się z błoną komórkową i zabarwi komórki.

Następnie dodaj trypsynę w celu dysocjacji komórek i rozcieńcz komórki w roztworze PBS czerwieni fenolowej przed zabiegiem oceny pH. Zamontuj znieczulone zarodki danio pręgowanego na płytce agarowej. Teraz załaduj mikrokapilę zawiesiną komórek rakowych i wstrzyknij ją do woreczka żółtkowego zarodków.

Przenieść zarodki na płytki hodowlane zawierające roztwór Danieau i kontynuować inkubację. Następnie przenieś kilka zarodków na szkiełko i dodaj metylocelulozę, aby je unieruchomić. Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo rozmiar guza za pomocą oprogramowania.

Związki przeciwnowotworowe zwykle hamują zdolność komórek nowotworowych do tworzenia nowotworów. W poniższym protokole zbadamy wpływ hydroksykumaryny wraz z mimetykiem BH3 na powstawanie nowotworów u danio pręgowanego in vivo.

- Po wysianiu komórek A549 i inkubacji ich ze związkami zgodnie z protokołem tekstowym, na 24 godziny przed zakończeniem zabiegu, dodaj cztery mikromole barwnika do śledzenia komórek fluorescencyjnych CM-Dil w celu wybarwienia komórek i inkubuj je przez dwie godziny.

Po inkubacji użyj 0,05% trypsyny EDTA do trypsynizacji komórek. Następnie rozcieńczyć od 10 do 6 komórek w 50 mikrolitrach roztworu PBS czerwieni fenolowej przed wstrzyknięciem. Aby przeprowadzić mikroiniekcję komórek rakowych, należy wyciągnąć szklaną kapilarnę o średnicy 1,0 milimetra, korzystając z następujących ustawień programu.

Użyj strzykawki, aby przeciąć kapilarę, aby uzyskać ostrą krawędź. Następnie załaduj mikrokapilę 20 mikrolitrami roztworu czerwieni fenolowej komórki. Po znieczuleniu danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym wstrzyknij od 100 do 200 komórek do woreczka żółtkowego, wstrzykując od 6 do 10 nanolitrów za pomocą trzech do pięciu wstrzyknięć.

- Mikroiniekcje powinny być wykonywane bardzo ostrożnie i precyzyjnie, aby zapewnić wstrzyknięcie odpowiedniej objętości komórek, a obrażenia spowodowane wstrzyknięciem były minimalne, a ciśnienie dwutlenku węgla powinno być optymalne, aby uniknąć śmiertelności ryb.

- Po wstrzyknięciu należy pozostawić rybę do regeneracji przez 10 do 30 minut w 5 mililitrach świeżego roztworu Danieau zawierającego PTU. Przenieś ryby do 24-dołkowych płytek z jednym mililitrem roztworu PTU Danieau i inkubuj je w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po inkubacji, po znieczuleniu ryb zgodnie z protokołem tekstowym, unieruchamić je na szkiełku podstawowym z kroplą 3% metylocelulozy.