Zastosowanie ultradźwięków o niskiej częstotliwości: metoda określania wpływu sonikacji na ludzkie komórki białaczkowe

- Na początek wysiewaj ludzkie komórki białaczki w świeżo przygotowanym pożywce hodowlanej i inkubuj przez żądany okres. Po inkubacji wybarwić niewielką ilość tej zawiesiny komórek błękitem trypanowym i ocenić żywotność komórek za pomocą szkiełka licznika komórek TC20. Martwe komórki są przepuszczalne i pobierają ujemnie naładowany barwnik, podczas gdy żywe komórki są nieprzepuszczalne.

Następnie dodaj beta-cyklodekstrynę metylową do kolby hodowlanej, aby wystarczająco zubożyć cholesterol w komórkach, czyniąc je podatnymi na ultradźwięki. Inkubuj komórki przez żądany okres. Napełnij system sonizacji komórek wodą dejonizowaną i odgazowuj go przez kilka minut, aby uniknąć pęcherzyków próżni. Przenieś żądaną ilość komórek do fiolki scyntylacyjnej i przymocuj fiolkę do urządzenia przytrzymującego system sonikacji komórek.

Umieść urządzenie przytrzymujące na górze klaksonu i ustaw żądaną wysokość od szczytu klaksonu. Ustaw wymagane impulsy na żądany czas, aby sonikować komórki. Dodaj błękit trypanowy do zawiesiny komórek i umieść go w liczniku komórek TC20, aby przeanalizować żywotność i uszkodzenie komórek. Komórki białaczkowe leczone beta-cyklodekstryną metylową, po wystawieniu na działanie ultradźwięków o niskiej częstotliwości, wykazują znaczną lizę komórek.

W poniższym protokole będziemy badać sonikację komórek i ocenę uszkodzeń ludzkich komórek białaczkowych.

- Aby przygotować komórki do sonikacji, najpierw wysiewaj je w ilości 4 razy 10 do czwartej komórki na mililitr w kolbie o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych przy użyciu świeżo przygotowanego podłoża. Po określeniu liczby żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego, inkubować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż kultura osiągnie pożądane stężenie. Gdy komórki są gotowe do sonikacji, użyj próżni i kolby Buchnera, aby odgazować objętość zjonizowanej wody destylowanej. Następnie użyj wody, aby napełnić róg kubka do 15 milimetrów powyżej górnej części klaksonu.

Uruchom system z odgazowaną wodą na około siedem minut, a następnie przenieś 3 mililitry komórek do szklanej 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej i przymocuj fiolkę do urządzenia podtrzymującego. Następnie przymocuj urządzenie przytrzymujące do górnej części rogu kubka i za pomocą mechanizmu przesuwnego ustaw urządzenie przytrzymujące na wysokość 15 milimetrów od górnej części klaksonu na powierzchni wody. Teraz poddaj komórki sonikacji za pomocą trzech jednosekundowych impulsów ultradźwiękowych z jednosekundowym odstępem między każdym z impulsów przy amplitudzie 33% i 50%.

Oceń żywotność komórek po sonikacji przez wykluczenie błękitu trypanowego. Aby ocenić uszkodzenie komórek, przepłucz otwór analizatora cząstek Z2 co najmniej 2 razy solą fizjologiczną. Następnie dodaj 100 mikrolitrów sonikowanych komórek do 20 mililitrów izotonicznego roztworu soli fizjologicznej i przenieś próbkę komórek do uchwytu licznika. Następnie podnieś platformę do otworu i przeanalizuj uszkodzenia ogniw, żywotność i zanieczyszczenia zgodnie z instrukcjami producenta.