Test XTT: test kolorymetryczny do oceny żywotności komórek i aktywności mitochondriów

- Fale ultradźwiękowe o niskiej częstotliwości prowadzą do selektywnej lizy ludzkich komórek białaczkowych, a test XTT pomaga określić stopień tego uszkodzenia. Test działa na zasadzie, że enzymy mitochondrialne zdrowych komórek przekształcają żółty barwnik XTT w pomarańczowy związek zwany formazanem. Aby rozpocząć test, należy potraktować komórki beta-cyklodekstryną metylową, środkiem zubożającym poziom cholesterolu, a następnie poddać komórki sonifikacji o niskiej mocy, aby wywołać uszkodzenie komórek.

Wirować w celu granulowania komórek i dodać świeże podłoże do wzrostu komórek do osadu. Umieść komórki w pożądanym stężeniu na wielodołkowej mikropłytce i inkubuj ją przez noc. Teraz dodaj aktywowany roztwór XTT do komórek i inkubuj, aż w dołkach mikropłytki rozwinie się pomarańczowy kolor. Umieść płytkę w spektrofotometrze. Zmierz absorbancję przy 450 do 500 nanometrach, a następnie przy 630 do 690 nanometrach. Odejmij te dwie wartości, aby uzyskać dokładne wyniki. Wyższa wartość absorbancji w teście XTT wskazuje na wyższą aktywność enzymów mitochondrialnych i wyższą żywotność komórek.

W poniższym filmie zademonstrujemy zastosowanie testu XTT do określania skuteczności fal ultradźwiękowych o niskiej częstotliwości w celu uszkodzenia komórek w komórkach białaczkowych leczonych beta-cyklodekstryną metylową.

- Aby ocenić żywotność sonikowanych komórek za pomocą testu XTT, należy poddać sonikację komórek za pomocą zakresu od jednego do trzech jednosekundowych impulsów, w odstępie jednej sekundy, w celu wytworzenia zakresu uszkodzeń do oceny przez zestaw XTT. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś granulki na 1 razy 10 do piątych komórek na mililitr w świeżo przygotowanym podłożu wzrostowym. Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na studzienkę do pojedynczych płaskich 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych w trzech egzemplarzach, w tym trzech studzienkach kontrolnych zawierających 100 mikrolitrów samej kompletnej pożywki wzrostowej w celu odczytów absorbancji ślepej próby. Inkubuj komórki przez 24 godziny.

Rano w dniu testu delikatnie zamieszaj porcje odczynników XTT o temperaturze 37 stopni Celsjusza i odczynników aktywacyjnych, aż roztwory będą klarowne. Następnie dodaj 0,1 mililitra odczynnika aktywacyjnego do 5 mililitrowej porcji odczynnika XTT. Następnie dodaj 50 mikrolitrów aktywowanego roztworu XTT do każdej studzienki zaszczepionych płytek U937 i THP1 i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po dwóch godzinach delikatnie potrząśnij płytkami, aby równomiernie rozprowadzić pomarańczowy barwnik w dołkach dodatnich i zmierz absorbancję na czytniku płytek do mikromiareczkowania w zakresie od 450 do 500 nanometrów. Na koniec ponownie zmierz absorbancję wszystkich studzienek testowych w zakresie od 630 do 690 nanometrów.