Test znakowania impulsowego bromodeoksyurydyny: technika pomiaru proliferacji komórek

- Zacznij od zawiesiny komórek białaczkowych zawierającej pożądaną gęstość komórek. Odwirować i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej zawierającej surowicę. Dodatek surowicy sprzyja ciągłemu wzrostowi komórek, a komórki poruszają się w różnych fazach cyklu komórkowego. Rozcieńczyć komórki w roztworze znakującym bromodeoksyurydynę lub BrdU i hodować je w warunkach fizjologicznych przez wymagany czas.

Komórki w fazie syntezy lub S pobierają BrdU - analog tymidyny - który zastępuje tymidynę podczas procesu replikacji DNA. Odwirować komórki, aby usunąć nadmiar BrdU i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim podłożu. Przenieś komórki na płytkę wielodołkową. Pozwól komórkom rosnąć w warunkach fizjologicznych przez różne okresy czasu.

W różnych okresach czasu komórki przechodzą przez pozostałą część faz S, G2, mitozy i G1 i wchodzą w następny cykl komórkowy, co pozwala na oszacowanie proliferacji komórek. Wykonaj barwienie przeciwciał, aby oznaczyć BrdU przeciwciałem fluorochromowym i zmierzyć proliferację komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Wewnątrz cytometru przepływowego fluorochromy pochłaniają energię lasera i fluoryzują. Liczba proliferujących komórek bezpośrednio koreluje z obserwowaną fluorescencją. W przykładowym protokole zademonstrujemy znakowanie impulsowe komórek ostrej białaczki limfoblastycznej.

- Protokół ten wykorzystuje linię komórkową ostrej białaczki limfoblastycznej NALM6, ale może być stosowany do dowolnej nieprzylegającej linii komórkowej. Utrzymuj komórki NALM6 w kolbach hodowlanych T-75 w pełnym RPMI w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w powietrzu. Po zebraniu komórek i przeprowadzeniu zliczania komórek, ponownie zawieś komórki w pełnym RPMI 2 razy 10 do 6 komórek na mililitr.

Rozcieńczyć komórki 1 w 2 za pomocą BrdU Complete RPMI, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 1 razy 10 do 6 komórek na mililitr. Z BrdU należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to potencjalny mutagen i teratogen. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 45 minut.

Następnie rozcieńczyć komórki 1 na 10 za pomocą Complete RPMI. Wirować w temperaturze 150 razy G przez pięć minut i ostrożnie wyrzucić cały supernatant. Ponownie zawieś komórki w małej objętości Complete RPMI, wykonaj liczenie komórek i dostosuj stężenie komórek do 1 razy 10 do 6 komórek na mililitr. Odpipetować 1 mililitr komórek do każdego dołka 48-dołkowej płytki.

Odpipetować 1 mililitr DPBS do wszystkich wolnych studzienek, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w powietrzu przez żądane punkty czasowe, w zależności od tego, co ma zmierzyć projekt eksperymentalny. Po zakończeniu inkubacji przenieś wszystkie komórki do probówek FACS.

Przepłucz każdą studzienkę sekwencyjnie 1 mililitrową objętością PBS do końcowej całkowitej objętości 5 mililitrów. Wirować przy 150 razy G przez pięć minut i ostrożnie usunąć cały supernatant. Komórki są teraz gotowe do barwienia, które należy wykonać natychmiast. Jeśli potrzebne jest barwienie powierzchni, należy je wykonać teraz, przed utrwaleniem.