Barwienie immunofluorescencyjne BrdU: technika identyfikacji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego

- Bromodeoksyurydyna lub BrdU jest syntetycznym analogiem nukleozydu tymidyny. Podczas fazy syntezy cyklu komórkowego BrdU zastępuje tymidynę i integruje się z nowo zsyntetyzowanym DNA. Wbudowany BrdU umożliwia śledzenie postępu cyklu komórkowego. Aby wykryć wbudowany BrdU, najpierw utrwal i przepuszczalnie komórki, aby uczynić je przepuszczalnymi.

Następnie potraktuj komórki enzymem DNAza, aby rozszczepić nici DNA i odsłonić włączone BrdU. Następnie dodać odpowiednie znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-BrdU. Przeciwciało dostaje się do jądra i łatwo wiąże się z odsłoniętym BrdU obecnym w DNA.

Dodatkowo potraktuj komórki odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA. Barwnik wiąże się z DNA, umożliwiając ilościowe określenie całkowitej zawartości DNA. Użyj cytometrii przepływowej, aby wykryć fluorescencję zarówno ze znakowanego BrdU, jak i DNA.

Intensywność fluorescencji ze znakowanego DNA różnicuje komórki w różnych fazach cyklu komórkowego w oparciu o zmienność całkowitej zawartości DNA. Sygnał fluorescencyjny z BrdU identyfikuje aktualną pozycję komórek włączonych do BrdU w cyklu komórkowym.

W tym przykładzie przeprowadzimy barwienie immunofluorescencyjne BrdU komórek NALM-6 - ostrej białaczki limfoblastycznej.

- Przed barwieniem przeciwciał potraktuj komórki DNAzą. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach roztworu DNAzy i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać jeden mililitr buforu do płukania, odwirować komórki i wyrzucić supernatant. Barwienie przeciwciałami na obecność markerów wewnątrzkomórkowych innych niż BrdU może być wykonywane jednocześnie z barwieniem BrdU.

- Ważne jest, aby przygotować kontrole kompensacyjne składające się z niebarwionych komórek i komórek znakowanych każdym pojedynczym fluorochromem. Najlepiej użyć tych samych przeciwciał do kontroli kompensacji, co te używane w probówkach eksperymentalnych.

- Zawiesić komórki w 50 mikrolitrach buforu do przemywania z jednym mikrolitrem na 10 do 6 komórek przeciwciała BrdU. W przypadku stosowania przeciwciał przeciwko innym specyficznym antygenom wewnątrzkomórkowym należy je dodać w tym momencie. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po 20 minutach przemyj komórki jednym mililitrem buforu do mycia, jak pokazano wcześniej. Na koniec wybarwić DNA do analizy cyklu komórkowego. Poluzuj osad, przesuwając tubkę i dodaj 20 mikrolitrów roztworu 7-AAD. Bardzo ważne jest, aby używać stałej ilości 7-AAD na komórkę. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu barwiącego. Następnie wykonaj analizę cytometrii przepływowej.