Pobieranie próbek krwi za oczodołem: metoda izolowania komórek jednojądrzastych z zatoki zadoczodołowej myszy

- Najpierw trzymaj znieczuloną mysz za szyję i wystaw oko. Włóż cienką rurkę kapilarną do przyśrodkowej kantu oka. Pozwól krwi przepływać przez działanie kapilarne do probówki. Przenieś krew do probówki pokrytej EDTA i utrzymuj ją na lodzie. EDTA wiąże jony wapnia, zapobiegając krzepnięciu krwi. Niższa temperatura zmniejsza aktywność glikolityczną komórek i ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego.

Następnie rozcieńczyć krew buforem zawierającym EDTA i dobrze wymieszać. Ostrożnie dodać warstwę odpowiedniego roztworu oddzielającego na dno, nie naruszając krwi. Odwirować zawiesinę. Polimer w roztworze rozdzielającym agreguje czerwone krwinki i osady na dnie. Komórki jednojądrzaste i płytki krwi, będąc lżejsze od polimeru, osadzają się powyżej gradientu polimerowego.

Usunąć górną warstwę zawierającą osocze i zebrać nieprzezroczysty biały pierścień zawierający komórki jednojądrzaste. Rozcieńczyć komórki za pomocą PBS i odwirować w celu usunięcia resztek osocza i płytek krwi. Użyj izolowanych komórek jednojądrzastych do dalszej analizy. Poniższy protokół zademonstruje izolację komórek jednojądrzastych od myszy kongenicznej, której wstrzyknięto białaczkę z linii komórkowej C1498.

- Włóż rurkę kapilarną do przyśrodkowej kantu oka znieczulonego zwierzęcia białaczkowego. Od 100 do 200 mikrolitrów krwi zostanie pobranych z zatoki oczodołowej do rurki kapilarnej. Wyjmij rurkę i zatamuj krwawienie, delikatnie nakładając sterylną gąbkę z gazy na oko. Następnie przenieś krew do probówki EDTA i przechowuj probówkę na lodzie do czasu izolacji komórki jednojądrzastej.

Aby wyizolować jednojądrzaste komórki krwi, najpierw dodaj PBS uzupełniony 1 milimolowym EDTA do końcowej objętości 500 mikrolitrów. Następnie przenieś próbkę do probówki mikrowirówkowej. Następnie za pomocą 1-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 ostrożnie ułóż 500 mikrolitrów roztworu oddzielającego pod krwią, uważając, aby nie wymieszać warstw.

Oddzielić komórki przez odwirowanie i za pomocą pipety przenieść nieprzezroczystą białą warstwę komórek jednojądrzastych do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie umyj komórki odpornościowe w 1 mililitrze PBS. Odwirować je i ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach buforu FACS w celu barwienia i analizy za pomocą cytometrii przepływowej.