Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

- Test strumienia zewnątrzkomórkowego pomaga badać metabolizm komórkowy poprzez pomiar dwóch głównych szlaków energetycznych - glikolizy i oddychania mitochondrialnego. Podczas glikolizy komórki metabolizują glukozę i wydzielają mleczan do przestrzeni zewnątrzkomórkowej wraz z protonami, co określa się za pomocą pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego lub ECAR. Podczas oddychania mitochondrialnego komórki wykorzystują tlen do produkcji ATP, mierzonej poprzez określenie wskaźnika zużycia tlenu lub OCR.

Komórki rakowe wykazują wysoki wychwyt glukozy, ponieważ zmieniają swoje tempo przemiany materii, aby przystosować się i utrzymać nieuregulowaną proliferację komórkową. Aby przeanalizować metabolizm w komórkach rakowych, najpierw zmontuj mikropłytkę do analizy strumienia zawierającą przylegającą monowarstwę komórek rakowych i uwodniony wkład czujnika. Przenieś zespół płyt do analizatora strumienia. Wewnątrz analizatora sondy czujnika opadają, tworząc przejściową mikrokomorę. Aby zmierzyć strumień zewnątrzkomórkowy, port iniekcji wprowadza związki testowe do mikropłytki w określonych punktach czasowych.

W zależności od metabolizmu komórkowego zmienia się stężenie dostępnego tlenu i protonów uwalnianych w mikrokomorze. Dwa fluorofory osadzone u podstawy wkładu jednocześnie wykrywają i mierzą poziom tlenu i protonów, wskazując odpowiednio na oddychanie mitochondrialne i glikolizę. W poniższym protokole zademonstrujemy test strumienia zewnątrzkomórkowego w celu zmierzenia aktywności metabolicznej pierwotnych komórek białaczkowych.

- W międzyczasie, aby przygotować płytki do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego, dodaj 12,5 mikrolitra roztworu kleju komórkowego do każdej studzienki dwóch 8-dołkowych płytek analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Po 20 minutach odessać klej komórkowy i umyć każdą studzienkę dwa razy 200 mikrolitrami sterylnej wody na pranie.

Po drugim umyciu pozostaw płytki w okapie, aż studzienki wyschną, a wkład czujnika umieść do góry nogami na stole laboratoryjnym. Oddziel płytkę użytkową i wkład czujnika analizatora strumienia i napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej 200 mikrolitrami kalibru, a każdą fosę na zewnątrz studzienek 400 mikrolitrami kalibru.

Włóż wkład czujnika do tabliczki znamionowej, która teraz zawiera kaliber, i umieść zespół wkładu w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez CO2 na noc. Następnie włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego i pozwól mu ogrzać się do 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego ranka przenieś komórki z kolby do 50-mililitrowych stożkowych probówek w celu odwirowania i ponownie zawieś granulki w 1 mililitrze odpowiedniej pożywki doświadczalnej do liczenia. Ponownie zawiesić komórki w proporcjach 4 razy 10 do 6 komórek w 400 mikrolitrach stężenia pożywki doświadczalnej i dodać 50 mikrolitrów komórek do studzienek od B do G płytki analizatora strumienia i 180 mikrolitrów pożywki eksperymentalnej do studzienek A i H jako studzienek kontrolnych w tle.

Po odwirowaniu powoli i ostrożnie dodać 130 mikrolitrów pożywki doświadczalnej do studzienek od B do G i wizualnie potwierdzić stabilne przyleganie komórek do dna każdej studzienki pod mikroskopem. Następnie włóż płytkę do analizy strumienia do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez CO2 na 30 minut.

Na 20 minut przed zakończeniem inkubacji załadować związki do odpowiednich portów wtryskiwaczy wkładu zgodnie z protokołem doświadczalnym, jak wskazano w tabeli. Następnie skonfiguruj odpowiedni program do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Uruchom program i po wyświetleniu monitu zastąp płytkę kalibru płytką testową.