JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:57 min • April 30th, 2023
- Limfocyty T, klasa limfocytów, odgrywają aktywną rolę w zwalczaniu infekcji. Wraz z wieloma innymi typami krwinek, immunokompetentne limfocyty T są obecne w śledzionie i węzłach chłonnych myszy. Aby selektywnie wyizolować limfocyty T, należy pobrać mysią śledzionę i węzły chłonne, a następnie zmacerować je na sitku do komórek. Przepłukać tkankę odpowiednim podłożem, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
Dodaj chlorek amonu potasu lub bufor ACK, aby zlizować czerwone krwinki. Odwirować w celu oddzielenia nienaruszonych krwinek od lizatu. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim buforze. Zawiesinę należy potraktować mieszaniną biotynylowanych przeciwciał mysich do docelowych komórek krwi, takich jak granulocyty, limfocyty B, komórki NK i wszelkie pozostałe erytrocyty. Limfocyty T nie są celem i dlatego pozostają nieoznakowane.
Następnie dodaj do zawiesiny mikrokulki magnetyczne antybiotyny. Wszystkie komórki znakowane biotyną wiążą się z mikrogranulkami. Pod wpływem silnego pola magnetycznego magnetycznie znakowane komórki przylegają do ścianki rury. Nieznakowane limfocyty T pozostają w zawiesinie. Zbierz niezwiązane, wzbogacone limfocyty T do świeżej probówki zbiorczej. W poniższym protokole pokazujemy izolację limfocytów T od śledziony i węzłów chłonnych myszy, wykorzystując technikę separacji magnetycznej.
- Połącz węzły chłonne i śledzionę w sitku o porach o wielkości 40 mikrometrów i użyj tłoka strzykawki, aby macerować tkanki przez filtry, aby uwolnić komórki. Umyć sitko i tłok pożywką RPMI uzupełnioną 1% FBS, aby zebrać wszystkie komórki i osadzać komórki przez odwirowanie. Dodaj 5 mililitrów buforu do lizy ACK do osadu komórkowego.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zatrzymaj reakcję za pomocą 5 mililitrów pożywki uzupełnionej 1% FBS i zagnieźdź białe krwinki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach buforu MACS w celu zliczenia i rozcieńczyć komórki do stężenia 2 razy 10 do 8 komórek na mikrolitr w świeżym buforze MACS. Dodaj odpowiednie stężenie przeciwciał anty-erytroidalnych, anty-granulocytowych, anty-komórek B i anty-NK-cell debili na 1 razy 10 do 6 komórek na 15-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przemyć komórki 10 milimetrami lodowatego buforu MACS i ponownie zawiesić osad w stężeniu 1 razy 10 do 8 komórek na mililitr w świeżym buforze MACS. Następnie dodaj 0,22 mikrolitra mikrogranulek antybiotyny na 1 razy 10 do 6 komórek mieszając przez 15-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przemyć komórki 10 mililitrami lodowatego buforu MACS i zebrać niezwiązane wzbogacone limfocyty T przez separację kulek magnetycznych za pomocą ekspresowego separatora MACS zgodnie ze standardowymi protokołami izolacji kulek. Pod koniec separacji osadnić limfocyty T przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach świeżego buforu MACS do liczenia.