Wzbogacanie limfocytów T: technika izolowania limfocytów T z mieszanej populacji komórek za pomocą separacji magnetycznej
JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:57 min • April 30th, 2023
- Limfocyty T, klasa limfocytów, odgrywają aktywną rolę w zwalczaniu infekcji. Wraz z wieloma innymi typami krwinek, immunokompetentne limfocyty T są obecne w śledzionie i węzłach chłonnych myszy. Aby selektywnie wyizolować limfocyty T, należy pobrać mysią śledzionę i węzły chłonne, a następnie zmacerować je na sitku do komórek. Przepłukać tkankę odpowiednim podłożem, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
Dodaj chlorek amonu potasu lub bufor ACK, aby zlizować czerwone krwinki. Odwirować w celu oddzielenia nienaruszonych krwinek od lizatu. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim buforze. Zawiesinę należy potraktować mieszaniną biotynylowanych przeciwciał mysich do docelowych komórek krwi, takich jak granulocyty, limfocyty B, komórki NK i wszelkie pozostałe erytrocyty. Limfocyty T nie są celem i dlatego pozostają nieoznakowane.
Następnie dodaj do zawiesiny mikrokulki magnetyczne antybiotyny. Wszystkie komórki znakowane biotyną wiążą się z mikrogranulkami. Pod wpływem silnego pola magnetycznego magnetycznie znakowane komórki przylegają do ścianki rury. Nieznakowane limfocyty T pozostają w zawiesinie. Zbierz niezwiązane, wzbogacone limfocyty T do świeżej probówki zbiorczej. W poniższym protokole pokazujemy izolację limfocytów T od śledziony i węzłów chłonnych myszy, wykorzystując technikę separacji magnetycznej.
- Połącz węzły chłonne i śledzionę w sitku o porach o wielkości 40 mikrometrów i użyj tłoka strzykawki, aby macerować tkanki przez filtry, aby uwolnić komórki. Umyć sitko i tłok pożywką RPMI uzupełnioną 1% FBS, aby zebrać wszystkie komórki i osadzać komórki przez odwirowanie. Dodaj 5 mililitrów buforu do lizy ACK do osadu komórkowego.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zatrzymaj reakcję za pomocą 5 mililitrów pożywki uzupełnionej 1% FBS i zagnieźdź białe krwinki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach buforu MACS w celu zliczenia i rozcieńczyć komórki do stężenia 2 razy 10 do 8 komórek na mikrolitr w świeżym buforze MACS. Dodaj odpowiednie stężenie przeciwciał anty-erytroidalnych, anty-granulocytowych, anty-komórek B i anty-NK-cell debili na 1 razy 10 do 6 komórek na 15-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przemyć komórki 10 milimetrami lodowatego buforu MACS i ponownie zawiesić osad w stężeniu 1 razy 10 do 8 komórek na mililitr w świeżym buforze MACS. Następnie dodaj 0,22 mikrolitra mikrogranulek antybiotyny na 1 razy 10 do 6 komórek mieszając przez 15-minutową inkubację w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przemyć komórki 10 mililitrami lodowatego buforu MACS i zebrać niezwiązane wzbogacone limfocyty T przez separację kulek magnetycznych za pomocą ekspresowego separatora MACS zgodnie ze standardowymi protokołami izolacji kulek. Pod koniec separacji osadnić limfocyty T przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach świeżego buforu MACS do liczenia.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół izolacji limfocytów T ze śledziony i węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem technik separacji magnetycznej. Metoda ta zapewnia selektywne wzbogacenie frakcji limfocytów T przy jednoczesnym usunięciu innych typów komórek krwi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Neuronauka
Wstęp
- Limfocyty T są kluczowe dla odpowiedzi immunologicznej przeciwko infekcjom.
- Izolacja limfocytów T jest niezbędna do prowadzenia różnorodnych badań immunologicznych.
- Techniki separacji magnetycznej stanowią niezawodną metodę izolacji komórek.
- Zrozumienie zachowania limfocytów T może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do wydajnej izolacji limfocytów T.
- Zwiększenie czystości izolowanych limfocytów T na potrzeby dalszych zastosowań.
- Zapewnienie powtarzalnej metody dla badaczy w dziedzinie immunologii.
Zastosowane metody
- Maceracja śledziony i węzłów chłonnych w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
- Zastosowanie buforu ACK do lizy erytrocytów.
- Separacja magnetyczna z użyciem mikrokulek antybiotynowych w celu izolacji limfocytów T.
- Wirowanie i resuspensja limfocytów T do zliczenia i analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja limfocytów T o wysokiej czystości.
- Efektywne usunięcie populacji innych niż limfocyty T.
- Powtarzalność protokołu potwierdzona w wielu próbach.
- Izolowane limfocyty T wykazały oczekiwane cechy funkcjonalne.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w izolacji limfocytów T.
- Techniki separacji magnetycznej mogą usprawnić badania z zakresu immunologii.
- Dalsze zastosowania izolowanych limfocytów T mogą prowadzić do postępów w strategiach terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie czystych populacji limfocytów T jest kluczowe dla badań immunologicznych, walidacji celów oraz rozwoju modeli przedklinicznych w biofarmacji. Separacja magnetyczna umożliwia powtarzalne usuwanie populacji innych niż limfocyty T, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków. Technika ta zapewnia skalowalny, zestandaryzowany schemat pracy służący do generowania systemów istotnych dla danej choroby, wykorzystywanych w opracowywaniu testów i identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji limfocytów T w szlakach immunologicznych oraz walidację celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację nienaruszonych limfocytów T za pomocą selekcji negatywnej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie oczyszczonych zawiesin limfocytów T, odpowiednich do testów funkcjonalnych i przesiewu fenotypowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analiz dzięki spójnej izolacji komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera systemy istotne dla chorób w badaniach nad chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi oraz modulacją odpornościową.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalny materiał wejściowy dla modeli przedklinicznych wymagających zdefiniowanych populacji limfocytów T.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez opracowanie testów, aż po ocenę przedkliniczną – umożliwiając wiarygodne testowanie związków w potokach badawczych skoncentrowanych na immunologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację limfocytów T do analizy szlaków sygnałowych i walidacji funkcjonalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe preparaty komórek do przesiewania modulatorów odporności lub leków biologicznych.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie policzalnych, żywotnych populacji limfocytów T do późniejszej cytometrii przepływowej, profilowania cytokin lub testów cytotoksyczności.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do preklinicznych modeli schorzeń immunologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do izolacji limfocytów T w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję zmiennych zakłócających w testach odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia wysoką wydajność i powtarzalność wzbogacania limfocytów T przy minimalnym nakładzie czasu pracy manualnej.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w rozwoju immunoterapii dzięki wiarygodnym danym dotyczącym oddziaływań z celem terapeutycznym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów celujących w szlaki zależne od limfocytów T, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu immunologii oraz technik magnetycznej separacji komórek.
- Zależne od dostępu do separatorów kompatybilnych z systemem MACS, biotynilowanych przeciwciał oraz mikrokulek anty-biotynowych.
- Wymaga ustandaryzowanych warunków buforowych i protokołów inkubacji we wszystkich zespołach.
- Adaptacja do ludzkich systemów lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji panelu przeciwciał.
- Ograniczone przez jakość i żywotność tkanki wyjściowej po dysocjacji mechanicznej.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie: metoda izolowania komórek C-Kit dodatnich
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Oczyszczanie śródbłonkowych komórek prekursorowych CD31+ za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026