Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

- Komórki dendrytyczne lub DC są kluczowymi komórkami prezentującymi antygen, które aktywują limfocyty T. U pacjentów z białaczką komórki te słabo wyrażają antygen związany z nowotworem i nie wywołują specyficznej dla antygenu odpowiedzi immunologicznej. Komórki dendrytyczne są obfite w szpiku kostnym. W związku z tym szpik kostny jest preferowanym miejscem ich izolacji, aby pomóc w badaniu ich roli w raku.

Aby uzyskać komórki dendrytyczne, należy pobrać szpik kostny z kości udowej lub piszczelowej myszy poddanej eutanazji za pomocą strzykawki wypełnionej pożywką, aby go wypłukać. Odwirować i ponownie zawiesić osad w buforze amonowo-chlorkowo-potasowym lub ACK w celu lizy erytrocytów. Teraz dodaj pożywkę hodowlaną, aby zatrzymać lizę i odwirować. Zawiesić osad w pożywce hodowlanej zawierającej antybiotyk. Dodać czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów lub GM-CSF i przenieść zawiesinę komórkową na płytkę Petriego.

Inkubuj płytkę przez żądany czas. GM-CSF pomaga komórkom progenitorowym różnicować się w komórki dendrytyczne. Na koniec aktywuj komórki za pomocą lipopolisacharydów lub LPS, które wiążą się z receptorem powierzchniowym komórek dendrytycznych, w wyniku czego powstają w pełni dojrzałe i immunogenne komórki dendrytyczne szpiku kostnego. W tym protokole zademonstrujemy wytwarzanie komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy.

- Aby wytworzyć komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego, należy wyizolować szpik kostny z kości udowych myszy typu dzikiego lub myszy z nokautem czynnika B, jak pokazano, i poddać lizie czerwone krwinki w 5 mililitrach buforu do lizy ACK, zatrzymując reakcję za pomocą 10 mililitrów RPMI, uzupełnionych 1% FBS po pięciu minutach.

Po zebraniu pełnych komórek krwi przez odwirowanie, ponownie zawieś osad w 10 mililitrach pożywki hodowlanej do stężenia 2 razy 10 do 6 komórek na mililitr i dodaj 20 nanogramów na mililitr GM-CSF do komórek, przed wysianiem 10 mililitrów komórek na pojedyncze szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez sześć dni. Szóstego dnia aktywuj hodowle komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą 25 mikrogramów na mililitr LPS na płytkę.