Test immunoprecypitacji chromatyny: technika badania interakcji białko-DNA w komórkach

- Immunoprecypitacja chromatyny lub ChIP to technika stosowana do określania interakcji białko-DNA w komórkach. Białka wiążą się z określonymi miejscami na DNA i regulują ekspresję genów. Najpierw ustabilizuj kompleks DNA-białko za pomocą formaldehydu. Formaldehyd łączy białka z powiązaną sekwencją DNA, tworząc wiązania kowalencyjne.

Następnie użyj odpowiedniego buforu do lizy komórek w celu uwolnienia chromatyny zawierającej usieciowane kompleksy DNA-białko. Odwirować zawiesinę i poddać sonikacji supernatant w celu uzyskania fragmentów chromatyny. Następnie oznacz próbkę odpowiednim przeciwciałem, które wiąże się specyficznie z białkiem związanym z DNA.

Dodaj specjalistyczne kulki magnetyczne do próbki. Koralik rozpoznaje przeciwciało i wiąże się z nim. Użyj magnesu, aby zebrać kulki magnetyczne z kompleksem przeciwciało-białko-DNA. Przemyć próbkę w celu usunięcia niezwiązanej chromatyny lub przeciwciał. Dodaj bufor o wysokim stężeniu soli do kompleksu i inkubuj w wyższych temperaturach, aby odwrócić wiązania krzyżowe białek DNA.

Za pomocą magnesu zbierz supernatant zawierający DNA i białka. Dodaj enzym proteinazę K, aby zdegradować białka w próbce. Dodaj odpowiedni bufor do wytrącenia DNA i użyj go do dalszej analizy. Poniższy protokół zademonstruje immunoprecypitację chromatyny w komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej w celu identyfikacji docelowych genów NFAT2.

- Najpierw przygotuj 20 mikrolitrów kulek pokrytych białkiem A na każde wytrącenie w jednej 1,5 mililitrowej probówce. Pozwól koralikom osiąść na stojaku magnetycznym przez jedną minutę i usuń supernatant. Następnie umyj kulki 40 mikrolitrami 1x bufor ChIP 1 na każde 20 mikrolitrów kulek pokrytych białkiem A, pipetując w górę iw dół.

Pozwól koralikom osiąść na stojaku magnetycznym przez jedną minutę i usuń supernatant. Powtórz ten proces mycia jeszcze trzy razy przed ponownym zawieszeniem kulek w ich pierwotnej objętości 1x bufor ChIP 1. Dodaj BSA, inhibitor proteazy, 5x bufor ChIP i wodę klasy ChIP-seq do kulek. Następnie dodaj ściętą chromatynę.

Użyj 10 mikrogramów przeciwciała anty-NFAT2 do wychwycenia NFAT2 i 2,5 mikrograma przeciwciała IgG jako kontroli. Inkubować mieszaniny przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na kole obracającym się z prędkością sześciu obrotów na minutę. Następnego dnia obracaj probówki przez pięć sekund z prędkością 7000 razy g i inkubuj je na stojaku magnetycznym przez minutę.

Następnie odessać supernatant i przemyć kulki raz kolejno płuczącymi 1, 2, 3 i 4. Obracaj probówki przez pięć sekund z prędkością 7,000 razy g, a następnie inkubuj probówki na stojaku magnetycznym przez jedną minutę. Następnie usuń supernatant i dodaj następny bufor do mycia.

Po ostatnim praniu wiruj probówki przez pięć sekund z prędkością 7 000 razy g. Inkubuj probówki na stojaku magnetycznym przez jedną minutę. Usunąć supernatant i zebrać kulki w 100 mikrolitrach buforu elucyjnego 1. Następnie inkubuj probówki na obracającym się kole przez 30 minut.

Następnie krótko obróć rurki i umieść je na stojaku magnetycznym na minutę. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać 4 mikrolitry buforu elucyjnego 2. Aby utworzyć kontrolę wejściową, wymieszaj 1 mikrolitr ściętej chromatyny z 99 mikrolitrami pierwszego buforu elucyjnego i 4 mikrolitrami drugiego buforu elucyjnego. Następnie inkubować próbki przez cztery godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza, wstrząsając.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów 100% izopropanolu do probówek. Wirować i wirować próbki przez pięć sekund z prędkością 7,000 razy g. Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek magnetycznych do każdej próbki. Wirować i inkubować próbki na obracającym się kole w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie krótko obróć rurki i umieść je na stojaku magnetycznym na minutę. Odessać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 mikrolitrach pierwszego bufora do mycia. Odwróć probówki, aby je wymieszać i inkubować przez pięć minut na obracającym się kole w temperaturze pokojowej. Następnie krótko odwirować probówki. Umieść je w stojaku magnetycznym na jedną minutę i użyj pipety, aby usunąć supernatant.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do płukania dwa. Odwróć probówki, aby się wymieszać i inkubuj je przez pięć minut na obracającym się kole w temperaturze pokojowej. Następnie krótko odwiruj probówki i umieść je w stojaku magnetycznym na jedną minutę. Usunąć drugi bufor płuczący przez aspirację i ponownie zawiesić kulki w 55 mikrolitrach buforu elucyjnego.

Aby wymyć wytrącone DNA, należy inkubować próbki w obracającym się kole w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie krótko obróć rurki i umieść je w stojaku magnetycznym na jedną minutę. Na koniec przenieś supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 mililitra.