Hodowla i zbiór klonów HSPC: metoda uzyskiwania pojedynczo sortowanych klonów HSPC

- Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe lub HSPC, mogą samoodnawiać się i różnicować w różne typy komórek krwi. HSPC stopniowo gromadzą mutacje DNA w ciągu życia, co może przyczyniać się do białaczki. Aby przeanalizować takie mutacje, HSPC są zwykle generowane ze szpiku kostnego.

Zacznij od dodania przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do komórek jednojądrzastych - dorosłych komórek macierzystych wyizolowanych ze szpiku kostnego - i inkubacji ich przez pożądany czas. Przeciwciała wiążą się ze specyficznymi markerami powierzchni komórek, takimi jak CD34. Teraz załaduj mieszaninę do cytometrii komórkowej aktywowanej fluorescencją lub maszyny FACS.

Przeciwciała sprzężone z fluoroforem fluoryzują po uderzeniu laserem. Poszczególne kropelki komórek przechodzą przez detektor, który mierzy intensywność fluorescencji, na podstawie której kropla posiada ładunek elektryczny. W obecności pól elektromagnetycznych dodatnio naładowane ogniwa przemieszczają się do pojemnika ujemnego i odwrotnie.

Teraz hoduj posortowane przez FACS CD34-dodatnie HSPC w odpowiednim podłożu przez żądany czas, aż pojawią się klony. Następnie usuń klony przez energiczne pipetowanie i odwirowanie, aby osadzać komórki. Przechowywać osad zawierający klonalne HSPC w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszej analizy. W poniższym protokole wygenerujemy klony HSPC z komórek jednojądrzastych.

- Rozpocznij tę procedurę od przygotowania materiału próbki i barwienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przygotuj 25 mililitrów pożywki hodowlanej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych lub HSPC. Napełnij 384-dołkową płytkę do hodowli komórkowej 75 mikrolitrami pożywki hodowlanej HSPC w każdym dołku. Aby zapobiec parowaniu pożywki w dołkach zewnętrznych, należy napełnić zewnętrzne studzienki 75 mikrolitrami sterylnej wody lub PBS i nie używać tych studzienek do sortowania komórek.

Prawidłowe sortowanie żywotnych sygnałowych HSPC jest najbardziej krytycznym krokiem w tym protokole. Ustaw bramki do sortowania HSPC na podstawie niebarwionej kontroli w 10 000 komórek z próbki barwienia. Bramkowanie pojedynczych komórek, rysując bramkę wokół liniowej wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do frakcji obszaru rozproszenia do przodu.

Użyj niebarwionej frakcji kontrolnej, aby narysować bramkę dla frakcji rodowodu. Narysuj bramki dla komórek CD34 dodatnich i dalej scharakteryzuj ten podzbiór, ustawiając specyficzną bramkę dla komórek CD38 ujemnych, CD45RA. Załaduj płytkę 384-dołkową na maszynę FACS i posortuj pojedyncze komórki. Jeśli ma to zastosowanie do komputera FACS, włącz opcję zachowywania danych sortowania indeksów, aby umożliwić ponowne śledzenie posortowanych komórek.

Aby wyhodować pojedynczo posortowane HSC, owinąć 384-dołkową płytkę hodowlaną z pokrywką w przezroczystą folię polietylenową. Przenieś 384-dołkową płytkę do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i trzymaj go w inkubatorze przez trzy do czterech tygodni, aż pojawią się widoczne klony. Po czterech tygodniach hodowli określ, które studnie mają zbieg 30% lub wyższy.

Dla każdego klonu należy wstępnie napełnić mikroprobówki o średnicy 1,5 milimetra 1 mililitrem 1% BSA w PBS i oznaczyć probówkę zgodnie z odpowiednim dołkiem. Wstępnie zwilż końcówkę pipety 1% BSA w PBS, aby zminimalizować liczbę komórek przyklejających się do końcówki pipety. Ostro pipetuj pożywkę w górę iw dół co najmniej pięć razy, jednocześnie skrobając dno studzienki pipetą o pojemności 200 mikrolitrów ustawioną na 75 mikrolitrów.

Zbierz zawiesinę komórkową w oznakowanej mikroprobówce, która odpowiada studzience. Powtórz pipetowanie w studzience z maksymalnie 75 mikrolitrami świeżych 1% BSA i PBS, aby zapewnić maksymalny pobór komórek. Komórki hodowane klonalnie mogą przyklejać się do dna studni. Sprawdź studzienki za pomocą standardowego mikroskopu ze światłem odwróconym, aby upewnić się, czy wszystkie komórki zostały zebrane.

Jeśli wszystkie studzienki o zbiegu większym niż 30% zostały zebrane, umieść płytkę 384-dołkową z powrotem w inkubatorze. Kultury klonalne mogą rozmnażać się do pięciu tygodni. Wirować zawiesinę komórek przez pięć minut w temperaturze 350 g. Powinna być widoczna mała granulka. Ostrożnie usunąć wszystkie z wyjątkiem około pięciu mikrolitrów supernatantu. Granulki komórkowe można zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i przechowywać przez wiele miesięcy przed izolacją DNA.