JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:41 min • April 30th, 2023
- c-Kit lub CD117 to transbłonowy receptor kinazy tyrozynowej wyrażany przez hematopoetyczne komórki macierzyste lub progenitorowe obecne w szpiku kostnym i krwi. Jest również markerem do wykrywania ostrej białaczki szpikowej.
Aby wyizolować komórki c-Kit dodatnie, zbierz kości nóg myszy i zmiażdż je, aby uwolnić szpik od wewnątrz. Przefiltrować zawiesinę szpiku kostnego, aby usunąć wszelkie fragmenty kości. Warstwę filtratu zawierającego komórki szpiku kostnego należy umieścić na pożywce o gradiencie gęstości i odwirować w celu oddzielenia komórek jednojądrzastych od innych frakcji.
Zebrać mętną warstwę komórek jednojądrzastych w probówce zawierającej mikrogranulki sprzężone z mysimi przeciwciałami anty-CD117. Inkubuj kompleksy przeciwciało-kulki, aby związać się z receptorami CD117 na komórkach c-Kit dodatnich. Przepuścić inkubowaną zawiesinę przez kolumnę magnetyczną umieszczoną w polu magnetycznym. Wszystkie dodatnie komórki c-Kit znakowane mikrokulkami magnetycznymi pozostają w kolumnie, podczas gdy nieznakowane komórki przechodzą przez nią.
Usuń kolumnę z pola magnetycznego i przepłucz zawartość za pomocą odpowiedniego buforu w celu elucji dodatnich komórek c-Kit. W poniższym protokole pokażemy izolację komórek c-Kit dodatnich ze szpiku kostnego myszy transgenicznej.
- Na początek zbierz kości nóg od myszy poddanej eutanazji. Oczyść tkanki z kości skalpelem. Następnie umieść kości w zimnym PBS na lodzie i zmiażdż kości tłuczkiem. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej rurki z nakrętką z 10-mililitrową pipetą. Umyj moździerz i tłuczek wiele razy zimnym PBS i dodaj zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej tubki.
Następnie odwirować szpik kostny i usunąć supernatant za pomocą pipety próżniowej i szklanej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach PBS. Za pomocą pipety powoli dodaj zawieszony szpik kostny do górnej części polisacharozy o temperaturze pokojowej.
Następnie wiruj polisarozę z prędkością 400 G przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu. Po cetrifugacji zbierz mętny całkowity interfejs komórek jednojądrzastych za pomocą pipety i przenieś go do nowej 15-mililitrowej probówki. Doprowadź objętość do 10 mililitrów za pomocą PBS i usuń 20 mikrolitrów do liczenia.
Po cetrifugacji wyrzucić supernatant i umieścić osad na lodzie. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w PBS za pomocą EDTA i BSA. Dodaj mikrogranulki CD117 do zawiesiny komórek i wiruj, aby wymieszać. Następnie inkubować zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie zwiększ objętość do 10 mililitrów za pomocą większej ilości PBS z EDTA i BSA i odwiruj przy 1200 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Użyj próżni, aby usunąć supernatant i zawiesić osad komórek w PBS z EDTA i BSA. Następnie dodaj trzy mililitry PBS z EDTA i BSA do stojaka magnetycznego z kolumną magnetyczną i pozwól mu spłynąć do probówki zbiorczej. Po zakończeniu przepływu buforu przez kolumnę, dodaj zawiesinę komórek i pozwól jej przepłynąć przez kolumnę do probówki zbiorczej.
Następnie dodaj 5 dodatkowych mililitrów PBS z EDTA i BSA do kolumny i natychmiast przepłucz ją tłokiem. Wyjąć tłok i powtórzyć płukanie przed policzeniem komórek. Po odwirowaniu komórek usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w pełnym IMDM do hodowli. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół izolacji komórek c-Kit-dodatnich z szpiku kostnego myszy, które są kluczowe dla badania hematopoetycznych komórek macierzystych oraz ostrej białaczki szpikowej. Metoda ta obejmuje rozdrabnianie kości kończyn, filtrowanie szpiku oraz zastosowanie technik separacji magnetycznej w celu wyizolowania pożądanych komórek.
Magnetyczna separacja komórek (MACS) w celu izolacji komórek c-Kit dodatnich umożliwia precyzyjne wzbogacenie populacji hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, co wspiera wczesną walidację celów w badaniach nad białaczką. Ten schemat postępowania stanowi podstawę mechanistycznego ograniczania ryzyka oraz funkcjonalnej analizy potencjalnych celów, takich jak c-Fos i Dusp1, w systemach istotnych dla przebiegu choroby. Niezawodny dostęp do oczyszczonych populacji komórek zwiększa pewność prognostyczną i pozwala na selekcję projektów w przedklinicznych potokach badawczych w onkologii.
Izolacja komórek c-Kit dodatnich z wykorzystaniem systemu MACS integruje etapy wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając walidację celów terapeutycznych w oparciu o hipotezy oraz badania mechanistyczne w nowotworach hematologicznych.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026