Transdukcja za pośrednictwem retrowirusa: metoda wprowadzania genu docelowego do komórek rakowych

- Retrowirusy to wirusy RNA, które replikują się przy użyciu odwrotnej transkryptazy do przekształcania swojego genomu RNA w dwuniciowe DNA i trwale integrują się z genomem gospodarza. Nowe cząsteczki wirusa opuszczają komórkę i mogą infekować inne komórki. Terapia genowa nowotworów wykorzystuje wektory retrowirusowe do wprowadzania genów terapeutycznych do komórek docelowych za pomocą techniki zwanej transdukcją w celu obniżenia zmutowanego genu lub wyeliminowania komórek.

Aby uzyskać wektory retrowirusowe o wysokim mianie, należy przetransfekować komórki HEK 293 mieszaniną transfekcyjną zawierającą pożądany plazmid retrowirusowy, plazmid opakowaniowy i odpowiedni środek transfekcyjny. Inkubuj komórki. Środek transfekujący ułatwia dostarczanie obu plazmidów do komórek.

Plazmid retrowirusowy koduje genom wirusa za pomocą genu docelowego, podczas gdy plazmid pakujący koduje białka otoczki wirusa. Maszyneria komórkowa komórek pakujących tworzy cząstki retrowirusowe i uwalnia je do pożywki. Zebrać supernatant wirusa i odwirować w celu usunięcia komórek.

Przenieś pożądane stężenie cząstek wirusa i komórek rakowych na płytkę hodowlaną pokrytą fibronektyną, aby ułatwić wiązanie białek otoczki wirusa z komórkami. Inkubuj komórki. Zbierz komórki i wykonaj cytometrię przepływową, aby przeanalizować wydajność transdukcji. Protokół ten przeprowadzi transdukcję za pośrednictwem wirusa komórek szpiku kostnego myszy c-Kit-dodatnich.

- Najpierw połącz retrowirusowe plazmidowe DNA z plazmidem opakowaniowym, chlorkiem wapnia i wodą w 1,5-mililitrowej probówce. Następnie dodaj 500 mikrolitrów HBS do kolejnej 1,5 mililitrowej tubki. Dodawać mieszaninę transfekcji kroplami do probówki zawierającej HBS, jednocześnie mieszając z wirownikiem ustawionym na najniższe ustawienie.

Mieszaninę transfekcji inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut. W okresie inkubacji dodać chlorochinę do komórek HEK i trzymać je w inkubatorze. Po dodaniu mieszanki transfekcyjnej inkubuj komórki przez 8 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, zmieniając pożywkę komórkową, dodając bardzo powoli 14 mililitrów świeżej pożywki DMEM 10. Powolne dociskanie do ścianki naczynia pomaga zapobiec usuwaniu komórek HEK.

Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby zebrać supernatant wirusa. Następnie podłącz filtr strzykawkowy 0,45 mikrometra do strzykawki. Zanurz wirusowy supernatant w nowej probówce do pobrania. Zebrać supernatant wirusa około 16 godzin później.

Następnie dodaj 2 mililitry rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny w PBS do nietraktowanych 6-dołkowych płytek hodowlanych. Następnego dnia użyj pipety, aby usunąć fibronektynę z płytek. Zablokować płytki 2% BSA w PBS i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Użyj odkurzacza, aby usunąć BSA i umyj płytki PBS przed wyjęciem ich za pomocą odkurzacza. Następnie natychmiast dodaj przefiltrowany supernatant wirusowy i odwiruj płytkę przez dwie godziny. Użyj próżni, aby usunąć supernatant i ponownie obróć płytkę.

Następnie usunąć supernatant za pomocą odkurzacza i umyć pokryte wirusem studzienki PBS. Usuń PBS za pomocą odkurzacza. Dodaj wcześniej hodowane komórki myszy c-Kit + do dołków pokrytych wirusem. Po odwirowaniu inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. 48 godzin po transdukcji rozpuść komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś je w buforze FACS nr 1.