JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:31 min • April 30th, 2023
- Czasami komórka macierzysta lub progenitorowa ulega mutacjom, w wyniku których powstaje białaczkowa komórka macierzysta. W tych komórkach niektóre białka są regulowane w górę, a stosowanie związków przeciwnowotworowych przeciwko takim białkom może pomóc w kontrolowaniu wzrostu komórek. Działanie tych związków przeciwnowotworowych można analizować za pomocą testu CFU, monitorując liczbę i wielkość tworzonych kolonii.
Zacznij od pobrania komórek progenitorowych od myszy chorej na białaczkę i rozcieńczenia ich w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Dodaj tę zawiesinę komórkową wraz z odpowiednim związkiem przeciwnowotworowym do metylocelulozy zawierającej cytokiny specyficzne dla myszy i wlej ją na szalkę Petriego. Inkubuj tę mieszaninę, aż pojawią się kolonie. Metyloceluloza jest chemicznie obojętną, półstałą matrycą, która zapobiega migracji komórek, podczas gdy cytokiny stymulują komórki progenitorowe do różnicowania się i tworzenia kolonii zawierających rozpoznawalne potomstwo.
Następnie wybarwić kolonie za pomocą chlorku jodonitrotetrazolowego lub INT i inkubować przez noc, aż kolonie zmienią kolor na ciemnoczerwonawo-brązowy. Enzymy mitochondrialne redukują żółty barwnik INT do czerwonawo-brązowego barwnika formazanu. Na koniec zidentyfikuj i policz kolonie obecne na talerzu. W poniższym protokole przeprowadzimy test CFU, aby przetestować wpływ związków przeciwnowotworowych na komórki YFP-dodatnie.
- Najpierw rozmrozić metylocelulozę za pomocą cytokin dla myszy w temperaturze pokojowej. Następnie podniec 3 mililitry metylocelulozy w probówce FACS. Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z odpowiednimi inhibitorami do 3 mililitrów metylocelulozy. Następnie wiruj zawiesinę na wysokich obrotach przez 10 do 30 sekund.
Po ucieczce większości pęcherzyków powietrza użyj strzykawki o pojemności 1 mililitra, aby umieścić 1 mililitr pożywki na trzech powtórzonych płytkach. Umieść płytki na dużej szalce Petriego wraz z jednym otwartym naczyniem zawierającym sterylną wodę. Następnie przykryj dużą szalkę Petriego i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Przygotować plamę chlorku jodonitrotetrazoliowego, rozpuszczając 10 miligramów chlorku jodonitrotetrazolu w 10 mililitrach wody. Filtr sterylizuje roztwór barwiący za pomocą strzykawki Luer-Lok wyposażonej w filtr 0,2 mikrometra.
W kapturze do hodowli tkankowej dodać kroplami 100 mikrolitrów roztworu barwiącego wokół płytki CFU. Następnie inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych. Na koniec, po tym, jak kolonie zmienią kolor na ciemnoczerwono-brązowy, użyj białego tła w sterylnym kapturze do hodowli tkanek, aby zrobić zdjęcia poplamionej płytki CFU.