Bioluminescencyjny ortotopowy model myszy raka trzustki: nieinwazyjna technika monitorowania progresji raka u myszy

- Obrazowanie bioluminescencyjne umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek nowotworowych w celu zbadania ich rozmieszczenia w zwierzęcych modelach nowotworowych. Aby wygenerować model myszy, weź znieczuloną mysz i wysterylizuj jej obszar brzucha. Wykonaj nacięcie chirurgiczne, aby zlokalizować śledzionę. Wyciągnij go z jamy brzusznej i odsłoń leżącą pod spodem trzustkę.

Następnie wstrzyknąć schłodzoną zawiesinę transdukowanych komórek raka trzustki zmieszanych w odpowiedniej matrycy hydrożelowej do trzustki myszy. Te genetycznie zmodyfikowane komórki wyrażają enzymy lucyferazy. Przytrzymaj strzykawkę na miejscu, aby zawiesina macierzy komórkowej zestaliła się, minimalizując wyciek.

Umieść narządy z powrotem w jamie brzusznej i zszyj nacięcie. Pozwól myszy na odzyskanie sprawności. Gdy guz się rozwinie, znieczul mysz i wstrzyknij bioluminescencyjny roztwór substratu do jej żyły ogonowej. Pozwól cząsteczkom dotrzeć do miejsca guza zawierającego komórki wyrażające lucyferazy.

W komórkach enzymy lucyferazy katalizują utlenianie cząsteczek substratu, co powoduje emisję światła. Umieść mysz w bioluminescencyjnej komorze obrazowania, aby uchwycić obrazy guza w celu zbadania dynamiki wzrostu guza. W poniższym protokole pokażemy generowanie bioluminescencyjnego ortotopowego modelu myszy raka trzustki poprzez wstrzyknięcie komórek raka trzustki wykazujących ekspresję lucyferazy.

- Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie przez skórę w odległości około 2 milimetrów w lewo, po bokach od linii środkowej. Następnie wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie w leżącym poniżej mięśniu brzucha. Następnie zlokalizuj śledzionę za pomocą sterylnych kleszczy i delikatnie usuń ją z jamy brzusznej. Zabezpiecz śledzionę wzdłuż sterylnego wacika, aby odsłonić leżącą pod spodem trzustkę. Następnie zlokalizuj ogon trzustki przylegający do śledziony.

Zawiesić zawiesinę komórkową Matrigel i wstrzyknąć 20 mikrolitrów w ogon trzustki. Po wstrzyknięciu należy przytrzymać strzykawkę na miejscu przez 30 do 60 sekund, aż Matrigel zdąży zastygnąć. Ten ważny krok minimalizuje wyciek komórek.

Po wyjęciu igły należy sprawdzić miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że nie doszło do wycieku. Następnie przywróć śledzionę i trzustkę do jamy brzusznej. Zamknij mięśnie brzucha myszy wchłanialnym, plecionym szwem 4-0 z okrągłą igłą za pomocą ciągłego ściegu.

Następnie zamknij zewnętrzną skórę niewchłanialnym, monofilamentowym szwem 6-0 z igłą tnącą za pomocą ciągłego ściegu i nałóż Betadine. Następnie wyjmij mysz z wziewnego środka znieczulającego i wstrzyknij od 0,05 do 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny, podskórnie, jako pooperacyjny środek przeciwbólowy. Pozwól myszy dojść do siebie w klatce umieszczonej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.

Kontynuuj uważne monitorowanie myszy przez pierwsze kilka dni po zabiegu. Jeśli mysz wykazuje oznaki bólu, takie jak garbienie się lub ograniczona ruchomość, buprenorfina może być podawana podskórnie co 12 godzin przez okres 36 godzin. Po zagojeniu się pola operacyjnego w ciągu 7 do 10 dni należy znieczulić mysz i usunąć szwy zewnętrzne.

Aby rozpocząć bioluminescencyjne śledzenie komórek raka trzustki, ponownie znieczul mysz za pomocą 2% do 3% wziewnego izofluranu i nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Po znieczuleniu wstrzyknij 150 miligramów na kilogram D-lucyferyny poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej i odczekaj od jednej do dwóch minut, aby lucyferyna przedostała się do komórek.

Umieść mysz na prawym boku w systemie obrazowania bioluminescencyjnego tak, aby guz był skierowany w stronę kamery. Tutaj używamy systemu obrazowania Lumina II. Następnie uchwyć obrazy w świetle białym i bioluminescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania, jak opisano wcześniej w innych artykułach JoVE. Po zakończeniu obrazowania wyjmij mysz z wziewnego środka znieczulającego i pozwól jej dojść do siebie w klatce domowej. Powtarzaj te kroki przez cały czas wzrostu guza, aby zbadać kinetykę wzrostu guza.