Ocena ognisk uszkodzenia DNA: Identyfikacja ognisk uszkodzenia DNA wywołanych promieniowaniem w linii komórek nowotworowych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

- Promieniowanie jonizujące indukuje różne rodzaje uszkodzeń DNA, takie jak pęknięcia jednoniciowe lub SSB i pęknięcia dwuniciowe lub DSB. Pęknięcia pojedynczej nici lub SSB występują, gdy promieniowanie uszkadza zasady i rozszczepia szkielet DNA, podczas gdy pęknięcia dwuniciowe, DSB, rozwijają się, gdy dwa SSB występują na przeciwległych niciach DNA. Pierwszym etapem tworzenia DSB jest fosforylacja histonu H2AX, którą można uwidocznić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne, należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe do próbki utrwalonej na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na szalce Petriego. Przeciwciała wiążą się z fosforylowanym białkiem histonowym gamma-H2AX. Inkubować próbkę i przemywać ją PBS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Następnie dodaj przeciwciała drugorzędowe przenoszące fluorofory, które rozpoznają przeciwciała pierwszorzędowe i wiążą się z nimi. Dodaj żądaną ilość barwnika fluorescencyjnego DAPI, aby przeciwbarwić jądra.

Delikatnie zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym z medium montażowym i obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ogniska gamma-H2AX pojawiają się jako wyraźne