JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:45 min • April 30th, 2023
- Czynniki transkrypcyjne to białka zawierające domeny wiążące DNA. Wiążą się ze specyficznymi sekwencjami DNA i pomagają regulować ekspresję genów w komórkach. Aby wykryć ekspresję czynnika transkrypcyjnego w melanocytach związanych z łuskami, najpierw zbierz ciemne pigmentowane łuski grzbietowe od znieczulonego danio pręgowanego. Napraw łuski i potraktuj je roztworem przepuszczalnym, aby poszczególne melanocyty stały się przepuszczalne.
Potraktuj roztworem wybielacza, aby usunąć ciemne granulki pigmentu melaniny z komórek. Ten proces wybielania eliminuje ryzyko wystąpienia sygnałów tła związanych z pigmentem podczas kolejnych etapów barwienia. Inkubować z roztworem blokującym zawierającym białka w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania białek na powierzchni komórki.
Teraz potraktuj próbkę pożądanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi. Przeciwciała te wiążą się z docelowymi czynnikami transkrypcyjnymi w komórkach. Następnie oznacz próbkę znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami drugorzędowymi specyficznymi dla przeciwciał pierwszorzędowych. Dodatkowo potraktuj próbkę odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA w celu wybarwienia jąder komórkowych. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć jasne emisje fluorescencyjne z kompleksów czynnik transkrypcyjny-przeciwciało i jąder komórkowych.
W poniższym protokole pokażemy barwienie immunologiczne melanocytów związanych z łuską grzbietową eksprymujących czynnik transkrypcyjny A indukujący melanocyty lub mitfa u transgenicznego danio pręgowanego.
- Aby wykonać barwienie immunologiczne, znieczulij rybę w 0,17 miligrama na mililitr Trikainy. Przy padającym świetle pod mikroskopem preparacyjnym użyj ostrych kleszczy z cienką końcówką, aby wyrwać łuski grzbietowe, uważając, aby nie uszkodzić połowy łuski zawierającej melanocyty. Umieść łuski bezpośrednio z kleszczy w 1 mililitrze utrwalacza i inkubuj w temperaturze pokojowej, obracając, przez więcej niż 2 godziny. Przenieś rybę do wody dla ryb i monitoruj ryby, aby potwierdzić pomyślne wyzdrowienie.
Aby wybielić pigmentowane melanocyty, najpierw umyj utrwalone łuski w PBST dwa razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 1 mililitr świeżo przygotowanego roztworu wybielacza i przykryj parafilmem lub zakrętkami, aby zapobiec pękaniu rurek z gazem. Kontynuuj wybielanie, aż pigment zniknie. Następnie umyj w PBST cztery razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Inkubować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokowym. Następnie inkubować z około 400 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego w roztworze blokowym przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia umyj wagę trzy razy przez 30 minut w PBST w temperaturze pokojowej. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny do nocy w temperaturze pokojowej.
Po zabarwieniu DAPI nałóż kroplę vectashield na szklane szkiełko i zamontuj łuski tak, aby wklęsła strona łusek była skierowana w dół w stosunku do szkiełka. Na próbki nałożyć szklaną szkiełko nakrywkowe. Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym.