Name: Metoda izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj metodę izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis poprzez lizę osmotyczną i ultrawirówkę w gradiencie sacharozy. Technika ta umożliwia badanie białek błonowych i mechanizmów wirulencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany projekt został sfinansowany z grantów o numerach P01 AI055637 oraz U54 AI057156 przyznanych przez NIAID/NIH. Jego treść leży w wyłącznej odpowiedzialności autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnych opinii biura programowego RCE, NIAID lub NIH.

Dzień 1: Inokulacja płytek F. tularensis <ol> <li>Wysiać zamrożone kultury stokowe F. tularensis na agar Mueller-Hinton uzupełniony o 2,5% (vol/vol) surowicy z cieląt donora, 2% (vol/vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt/vol) glukozy oraz 0,025% (wt/vol) pirofosforanu żelaza. Hodować F. tularensis w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 przez około 24 h.</li> </ol> Dzień 2: Inokulacja F. tularensis w pożywce płynnej <ol> <li>Przygotować i wysterylizować w autoklawie 1 litr podłoża Mueller-Hinton z dostosowaną zawartością kationów (zawierającego 1,23 mM chlorku wapnia dwuwodnianego i 1,03 mM chlorku magnezu sześciowodnianego). Po ochłodzeniu do 37°C uzupełnić podłoże o 0,1% (mas/obj) glukozy, 0,025% (mas/obj) pirofosforanu żelaza oraz 2% (obj/obj) IsoVitaleX. Podłoże wysterylizować przez filtr (0,22 μ) i rozdzielić na dwie porcje po 500 ml.</li> <li>Odlać 12 ml uzupełnionego podłoża Mueller-Hinton i przenieść do sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml.</li> <li>Za pomocą sterylnej pętli szczepiącej o pojemności 10 μ pobrać znaczną ilość wzrostu F. tularensis z płytek agarowych (z Dnia 1) i przenieść bakterie do 12 ml podłoża Mueller-Hinton (patrz Krok 2). Kilkakrotnie pipetować roztwór, aby rozbić grudki i przygotować jednorodną zawiesinę bakteryjną. Nie używać wortexa.</li> <li>Za pomocą sterylnej pipety zaszczepić każde naczynie o pojemności 500 ml 5 ml zawiesiny bakteryjnej z Kroku 3. Hodować kultury w bulionie w temperaturze 37°C przez 14 do 18 h przy delikatnym wytrząsaniu (190-200 rpm na wytrząsarce New Brunswick serii Innova 2300).</li> </ol> Dzień 3: Sferoplastyka, liza osmotyczna i wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy <ol> <li>Uzyskać *F. tularensis* wyjmij kultury z inkubatora wytrząsowego i pobierz 1-ml alikwot z każdej 500-ml kultury w celu sprawdzenia odpowiednich gęstości optycznych. Optymalne wyniki ekstrakcji membranowej i izolacji uzyskano przy zastosowaniu *F. tularensis* komórki we wczesnej fazie logarytmicznej wzrostu, co koreluje z wartością OD600 od 0,2 do 0,4 (~107 do 108 CFU/ml). Kultury o OD600 wartość poniżej 0,2 nie zapewni wystarczającej ilości całkowitego materiału błonowego do późniejszego zastosowania w gradientach sacharozy. Z kolei hodowle o OD600 stwierdzono, że wartości powyżej 0,4 (zbliżanie się do fazy stacjonarnej) prowadzą do uzyskania mieszanych fuzji błon.</li> <li>Wirować hodowle z prędkością 7 500 x g przez 30 min w temperaturze 15°C w celu zebrania komórek. Zaleca się wirowanie kultur w czterech butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml, ponieważ ułatwia to późniejszą resuspensję osadu.</li> <li>Ostrożnie usuń nadsącz z pożywki z każdej butelki do wirowania, a następnie mocno uderz butelkami o materiał chłonny, aby usunąć nadmiar pożywki hodowlanej.</li> <li>W ciągu 10 min po zakończeniu wirowania każdy osad bakteryjny należy zawiesić w 8,75 ml 0,75 M sacharozy (w 5 mM Tris, pH 7,5). Wszystkie cztery osady bakteryjne powinny zostać zawieszone i przeniesione (łącznie 35 ml zawiesiny bakteryjnej) do sterylnej kolby o pojemności 250 ml (z małym mieszadełkiem magnetycznym) w ciągu 10 min.</li> <li>Podczas delikatnego mieszania zawiesiny komórkowej na mieszalce magnetycznej powoli dodaj 70 ml (2 objętości) 10 mM EDTA dwusodowego (w 5 mM Tris, pH 7,8) w ciągu 10 min. Roztwór EDTA należy dodawać tak, aby końcówka pipety znajdowała się poniżej poziomu zawiesiny komórkowej, aby uniknąć powstania wysokich lokalnych stężeń EDTA. Prędkość obrotowa mieszadła powinna być wystarczająca do dokładnego wymieszania zawiesiny komórkowej, lecz nie na tyle duża, aby doprowadzić do spienienia lub powstania pęcherzyków powietrza. Po dodaniu roztworu EDTA inkubuj go przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li> <li>Po 30-minutowej inkubacji powoli dodać 11 ml (1/10th objętość) roztworu lizozymu o stężeniu 2 mg/ml do końcowego stężenia 200 μg/mlKontynuuj mieszanie zawiesiny komórkowej podczas dodawania roztworu lizozymu. Jak wspomniano powyżej, dodawaj roztwór lizozymu tak, aby końcówka pipety znajdowała się poniżej poziomu cieczy zawiesiny komórkowej, aby uniknąć powstania wysokich lokalnych stężeń lizozymu. Roztwory stokowe lizozymu (2 mg/ml) można przygotować w jednorazowych alikwotach i przechowywać w temperaturze -20°C przez trzy do czterech miesięcy. Otrzymany roztwór inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li> <li>Podczas 30-minutowej inkubacji przygotować sterylną kolbę o pojemności 1 l z małym mieszadełkiem magnetycznym i 530 ml wody dH Cellgro Molecular Grade o temperaturze pokojowej.2O (4,5 obj.).</li> <li>Przeprowadzić lizę osmotyczną zawiesiny komórkowej (z kroku 6) poprzez powolne rozcieńczanie (przepływ około 11 ml/min) w 530 ml wody destylowanej klasy molekularnej (Molecular Grade dH2O).2O (z kroku 7) w ciągu 10 do 15 min przy łagodnym mieszaniu. Ze względu na większą objętość roztworu w tym kroku, należy zwiększyć prędkość mieszadła magnetycznego, aby zapewnić prawidłowe mieszanie. Mieszadło powinno obracać się z prędkością wystarczającą do całkowitego rozproszenia zawiesiny komórkowej po dodaniu jej do dH2W tempie umiarkowanym, jednak niewystarczająco szybkim, aby doprowadzić do spienienia lub powstania pęcherzyków. Należy dodać zawiesinę komórkową, opierając końcówkę pipety o dno kolby, w bezpośrednim sąsiedztwie magnesu mieszającego, aby ułatwić jednorodne rozcieńczenie zawiesiny. Stwierdzono, że na tym etapie najlepiej sprawdzają się pipety o pojemności 25 ml. Należy uważnie monitorować proces rozcieńczania i w razie potrzeby przerywać przepływ, aby rozproszyć lokalne skupiska komórek, aglomeraty oraz pasma komórkowe. Otrzymany roztwór inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że krok ten wydaje się być jednym z najtrudniejszych i najbardziej krytycznych dla ogólnego sukcesu eksperymentu.</li> <li>Po 30-minutowej inkubacji przenieś 40-ml aliquoty roztworu do lizy osmotycznej do 50-ml probówek stożkowych i wiruj przy 7500 x g przez 30 min w temperaturze 10°C aby usunąć nieuszkodzone komórki oraz debris.</li> <li>Po odwirowaniu należy ostrożnie pobrać od 27 do 30 ml supernatantu z każdej probówki stożkowej i połączyć supernatanty w sterylnej kolbie o pojemności 1L.</li><li>Przenieś po 25 ml połączonego supernatantu do 16 probówek do ultrawirowania i wiruj przy 200 000 x g (44 400 obr./min w wirniku do ultrawirówki FiberLite F50L-8x39) przez 2 h w temperaturze 4°CNależy pamiętać, że każdy wirnik mieści 8 probówek, zatem ten krok wymaga zastosowania dwóch wirników i dwóch ultrawirówek. Alternatywnie, drugi zestaw 8 probówek należy przechowywać w 4°C do momentu wirowania.</li> <li>W ciągu 10 min od zakończenia wirowania w ultrawirowarce należy przygotować zmodyfikowany bufor do resuspensji błon. Przenieść 8 ml buforu do suspensji błon (25% [masowych] sacharoza, 5 mM Tris, 30 mM MgCl2) do sterylnej probówki i dodać 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA oraz 375 U Benzonazy. Delikatnie wymieszać roztwór, aby rozpuścić tabletkę inhibitora proteaz.</li> <li>Po ultrawirowaniu ostrożnie zlej nadsączyny, odwróć probówki do ultrawirowania na materiale chłonnym i energicznie opukaj probówki, aby usunąć nadmiar nadsączyny. Zaznacz markerem miejsce każdego osadu błonowego, aby ułatwić jego wizualizację. Delikatnie resuspenduj osiem osadów błonowych w 600 μl każdego zmodyfikowanego buforu do resuspensji błon. Przenieś każdą resuspensję błon do kolejnego zestawu ośmiu probówek, delikatnie zresuspenduj te osiem pelletów, a następnie połącz otrzymane resuspensje błon w sterylnej probówce. Pellety błon są trudne do resuspensji, dlatego należy kontynuować przepuszczanie zmodyfikowanego buforu do resuspensji błon przez pellet, aż ten oddzieli się od ścianki probówki. Często konieczne jest użycie końcówki mikropipety do zeskrobania pelletu błony ze ścianki probówki i wspomagania procesu resuspensji. Podczas pipetowania należy unikać pienienia się lub tworzenia pęcherzyków powietrza. Należy zauważyć, że krok ten wydaje się być jednym z najtrudniejszych i krytycznych dla ogólnego sukcesu eksperymentu.</li> <li>Po resuspensji i usunięciu osadów błonowych ze wszystkich 16 probówek, przemyj każdą grupę czterech probówek za pomocą 600 μl zmodyfikowanego buforu do resuspensji błon. Płukanie powinno być skoncentrowane wokół zaznaczonego obszaru (osadu błonowego) w każdej probówce. Przenieś płuczkę do probówki z buforem do resuspensji błon. Powtórz etap płukania dla pozostałych trzech zestawów czterech probówek.</li> <li>Inkubować resuspensję membrany przez 30 min w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc naczyniem, aby zdegradować DNA i wspomóc redukcję materiału kłaczkowatego.</li> <li>Pobrać niewielką alikwot zawiesiny błon i przeprowadzić oznaczanie ilości białka w celu określenia całkowitej wydajności uzyskania błon. Zazwyczaj przygotowujemy próbki błon nierozcieńczone, rozcieńczone 1:1 (w 2,5% SDS) oraz rozcieńczone 1:3 (w 2,5% SDS), a następnie poddajemy próbki działaniu ciepła w temperaturze 90°C przez 10 min, a następnie należy użyć testu BioRad DC Protein Assay w celu ilościowego oznaczenia stężenia białek w resuspensji błon. Całkowita wydajność białka wynosi zazwyczaj od 1,0 mg/ml do 1,6 mg/ml. Zastosowanie ciepła oraz SDS jest niezbędne do uwolnienia białek błonowych zewnętrznych (OMP) z wyekstrahowanych błon, co pozwala na uzyskanie dokładniejszej wartości oznaczenia białka.</li> <li>Przygotuj liniowe gradienty sacharozy, nakładając kolejno po 1,8 ml roztworów sacharozy (masowych, przygotowanych w 5 mM EDTA, pH 7,5) do probówek do ultrawirówki Ultra-Clear o wymiarach 14 x 95 mm w następującej kolejności: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Nakładanie gradientów sacharozy jest najłatwiejsze przy użyciu pipety z gruszką, a nie pipety automatycznej.</li> <li>Na podstawie oznaczania ilości białka w resuspensji błon (krok 16), nanieś 1,5 mg resuspensji błon na górę każdego gradientu. Każda probówka do ultrawirówki o wymiarach 14 x 95 mm ma maksymalną pojemność 12,5 ml; biorąc pod uwagę, że 10,8 ml stanowią roztwory sacharozy z kroku 17, nie należy nanosić więcej niż 1,7 ml resuspensji błon na jeden gradient. Zważ każdą probówkę z gradientem sacharozy i ostrożnie skoryguj jej końcową masę (poprzez dodanie lub usunięcie resuspensji błon), tak aby wszystkie probówki miały taką samą masę (± 0,01 g).</li> <li>Przenieś gradienty sacharozy do rotora z ruchomymi koszyczkami SW-40Ti i wiruj przy 256 000 x g (38 000 obr./min) przez minimum 17 h w temperaturze 4°C.</li> </ol> Dzień 4: Pobieranie frakcji z gradientu sacharozy <ol> <li>Po 17 h wirowania zatrzymaj wirówkę i ostrożnie wyjmij gradienty sacharozy z rotora SW-40Ti.</li> <li>Ostrożnie przemyj dno probówki z gradientem sacharozy 70% etanolem, przebij dno probówki igłą 21g i zbierz sekwencyjne frakcje o objętości 500 μl z gradientu do sterylnych probówek do mikrowirówki. Powtórz czynność dla kolejnych gradientów. Należy pozwolić na spływanie gradientu pod wpływem siły grawitacji, aby nie zaburzyć struktury gradientu sacharozy. Jeśli jednak kapanie z dna probówki ustanie, można lekko nacisnąć górę probówki palcem.</li> <li>Wyznacz współczynnik załamania światła dla każdej frakcji gradientu sacharozy za pomocą refraktometru i przypisz współczynnik załamania do konkretnej gęstości w g/ml 1. Oceń lokalizację białek, przygotowując reprezentatywne frakcje gradientu sacharozy (przyrosty gęstości 0,01; od 1,11 g/ml do 1,26 g/ml) do rozdziału metodą SDS-PAGE, transferu na membranę nitrocelulozową i immunoblottingu.</li> </ol> Reprezentatywne wyniki Prawidłowo przeprowadzona procedura ta pozwala na całkowitą separację pęcherzyków błony wewnętrznej (IM) i zewnętrznej (OM) szczepów typu A (np. SchuS4) oraz typu B (np. LVS) F. tularensis. Jak pokazano na reprezentatywnych immunoblotach na Rysunku 1, białka błony zewnętrznej (OMPs) F. tularensis lokalizują się w zakresie gęstości od 1.17 do 1.20 g/ml. Dla porównania, białka błony wewnętrznej (IMPs) lokalizują się w zakresie gęstości od 1.13 do 1.14 g/ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Wyniki elektroforezy białek; prążki OMP FopA, OMP Mip, IMP SecY; markery masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Immunoblotting gradientów gęstości sacharozy F. tularensis. Kolejne frakcje zbierano z gradientów, a gęstości (g/ml) obliczano na podstawie współczynników załamania światła. Białka rozdzielano metodą SDS-PAGE, przenoszono na nitrocelulozę i poddawano immunoblottingowi w celu wykrycia frakcjonowania OMP i IMP. mw, wstępnie zabarwione standardy masy cząsteczkowej o wielkościach (w kDa) zaznaczonych po lewej stronie każdego blotu. LVS, lizaty całych komórek F. tularensis LVS. Odpowiadające im gęstości frakcji gradientu sacharozy są zaznaczone nad właściwymi ścieżkami. OMP i IMP, zaznaczone na lewym marginesie, wykryto za pomocą poliklonalnych, monospecyficznych antyser. Podobne wyniki uzyskano dla F. tularensis SchuS4.

<ol><li>Price, C. A. Centrifugation in density gradients. , Academic Press. 335-335 (1982).</li>
<li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+outer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li>
<li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li>
<li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li>
<li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li>
<li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li>
<li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li>
<li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+live+vaccine+strain%3A+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li>
<li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li>
<li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li>
<li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+proteome%3A+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje wariant „złotego standardu” sferoplastyzacji, lizy osmotycznej i wirowania w gradiencie gęstości sacharozy w celu fizycznej separacji i wzbogacania błon zewnętrznych (OM) bakterii Gram-ujemnych w odróżnieniu od innych składników komórkowych 2, 3, 4. Podczas gdy wcześniej opisaliśmy zastosowanie tej metody do izolacji OM z obu typów szczepów F. tularensis (typ A i typ B) 5, niniejsza prezentacja oferuje bardziej szczegółową i zoptymalizowaną procedurę izolacji OM. Stanowi to istotny postęp w identyfikacji potencjalnie eksponowanych na powierzchni i domniemanych czynników wirulencji tego śmiertelnego patogenu. Znaczenie tej procedury wykazano w badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium, które wykazały, że immunizacja myszy oczyszczonymi białkami błony zewnętrznej (OMP) zapewniła znaczną ochronę przed zakażeniem płuc wirulentnym szczepem F. tularensis typu A 6. Jak wspomniano powyżej, faza wzrostu komórek bakteryjnych, uważne monitorowanie podczas lizy osmotycznej oraz delikatne resuspensowanie osadów błonowych są krytycznymi krokami, które wydają się korelować z sukcesem lub niepowodzeniem tej procedury separacji błon. Chociaż ta zoptymalizowana metoda jest rygorystyczna i obarczona pewną zmiennością eksperymentalną, otrzymane błony zewnętrzne wydają się mieć znacznie wyższą czystość w porównaniu z błonami uzyskanymi przy użyciu detergentów, chlorku litu lub węglanu sodu 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>Surowica cielęca od dawcy</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana klasy molekularnej Cellgro dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Butelka poliwęglanowa 38,5 ml</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>Rotor do ultrawirówki F50L-8x39</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonukleaza</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirówki Ultra-Clear 14x95mm</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>Rotor z koszykami SW-40Ti</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Refraktometr stołowy Abbe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda izolacji błon zewnętrznych francisella tularensis

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensisjest Gram-ujemnym wewnątrzkomórkowym pałeczkowcem i czynnikiem etiologicznym tularemii, choroby odzwierzęcej. W porównaniu z innymi patogenami bakteryjnymi, niezwykle niska dawka zakaźna (&lt;10 CFU), szybki postęp choroby oraz wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności sugerują, że wirulentne szczepyFrancisellakodują nowe czynniki wirulencji. Wykazano, że cząsteczki eksponowane na powierzchni, a mianowicie białka błony zewnętrznej (OMPs), sprzyjają wiązaniu bakterii do komórek gospodarza, ich wnikaniu, przeżywalności wewnątrzkomórkowej, wirulencji oraz unikaniu odpowiedzi immunologicznej. Znaczenie badania OMPs jest dodatkowo podkreślane przez fakt, że mogą one służyć jako ochronne szczepionki przeciwko wielu chorobom bakteryjnym. Choć OMPs można ekstrahować z bakterii gram-ujemnych za pomocą technik masowej ekstrakcji błon, w tym sonikacji komórek z następującą po niej wirówką i/lub ekstrakcji detergentem, preparaty te są często zanieczyszczone białkami periplazmatycznymi i/lub zanieczyszczeniami z błony cytoplazmatycznej (wewnętrznej) (IM). Przez lata „złotym standardem” metody biochemicznej i biofizycznej separacji błon wewnętrznych (IM) i zewnętrznych (OM) bakterii gram-ujemnych było poddawanie bakterii sferoplastyce i lizie osmotycznej, a następnie wirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy. Po nałożeniu na gradient sacharozy, OM mogą zostać oddzielone od IM na podstawie różnic w gęstości wyporności, co prawdopodobnie wynika głównie z obecności lipopolisacharydu (LPS) w OM. W niniejszej pracy opisujemy rygorystyczną i zoptymalizowaną metodę ekstrakcji, wzbogacania i izolacjiF. tularensisbłony zewnętrzne oraz powiązane z nimi OMP.

Protokół oddzielania błon wewnętrznych i zewnętrznych Francisella tularensis poprzez sferoplastykę, lizę osmotyczną i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy.

Metoda izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis

Francisella tularensis to Gram-ujemny wewnątrzkomórkowy kokobacillus i czynnik etiologiczny tularemii, choroby odzwierzęcej. W porównaniu z innymi...

Izolacja pęcherzyków błony zewnętrznej Francis Cellis oraz związanych z nimi białek błony zewnętrznej rozpoczyna się od lizy osmotycznej komórek bakteryjnych. Bakterie w fazie logarytmicznej są sekwencyjnie traktowane hipertonicznymi roztworami sacharozy, EDTA i lizozymu, a następnie powoli rozcieńczane w wodzie dejonizowanej. Otrzymane lizaty bakteryjne poddaje się wirowaniu z niską prędkością w celu usunięcia szczątków komórkowych i nieuszkodzonych komórek, a następnie wirowaniu z wysoką prędkością w celu osadzenia pęcherzyków błonowych.Następnie całkowite pęcherzyki błonowe nanosi się na gradienty gęstości sacharozy w celu oddzielenia pęcherzyków błony wewnętrznej (IM) oraz pęcherzyków błony zewnętrznej (OM). Pęcherzyki OM można oddzielić od pęcherzyków IM na podstawie różnic w gęstości wyporności, które uważa się, że wynikają głównie z obecności lipopolisacharydu (LPS) w OM. Immunoblotting kolejnych frakcji z gradientów gęstości sacharozy wykazuje przestrzenną separację białek błony wewnętrznej od białek błony zewnętrznej. Dzień dobry, jestem dr Michael Norgaard, a to jest dr Jason Huntley z Katedry Mikrobiologii w UT Southwestern Medical Center w Dallas.Dzisiaj dr Huntley zaprezentuje procedurę ekstrakcji, wzbogacania i izolacji błon zewnętrznych komórek France cellis oraz powiązanych z nimi białek błonowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania cząsteczek zlokalizowanych w błonie zewnętrznej i potencjalnie eksponowanych na powierzchni tego wewnątrzkomórkowego patogenu bakteryjnego. Mamy dziś dużo pracy, więc zacznijmy.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować i wyhodować dwie 500 ml kultury bakterii FCIs zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Należy wyjąć kultury bakteryjne z inkubatora wytrząsowego i pobrać 1 ml z każdej kultury do pomiaru OD, aby uzyskać komórki lorenza we wczesnej fazie logarytmicznej wzrostu, co odpowiada wartości OD 600 między 0,2 a 0,4. Optymalne wyniki ekstrakcji i izolacji błon uzyskuje się, gdy kultury osiągną pożądaną wartość OD 600.Użyj czterech butelek wirówkowych o pojemności 250 ml, aby odwirować hodowle przy 7 500 ×g przez 30 minut w temperaturze 15 °C w celu zebrania komórek. Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz z każdej butelki wirówkowej i mocno uderz butelkami o materiał chłonny, aby usunąć nadmiar pożywki. W ciągu 10 minut od zakończenia wirowania zawieś każdy osad bakteryjny w 8,75 ml 0,75 M sacharozy w 5 mM Tris pH 7,5.Po zawieszeniu każdego osadu przenieś roztwór do sterylnej kolby o pojemności 250 ml, używając małego magnesu mieszającego. Powtórz czynność dla wszystkich czterech osadów bakteryjnych, aż całkowita objętość zawiesiny osadów bakteryjnych wyniesie 35 ml. Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową na mieszadle magnetycznym, unikając jednak zbyt wysokiej prędkości.Aby uniknąć pienienia się lub powstawania pęcherzyków podczas powolnego mieszania, dodaj 70 ml 10 mM EDTA do roztworu w ciągu 10 minut. Trzymaj końcówkę pipety poniżej poziomu zawiesiny komórkowej, aby uniknąć podwyższonych lokalnych stężeń EDTA. Po dodaniu EDTA inkubuj roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie, wciąż powoli mieszając, dodaj 11 ml roztworu lizozymu o stężeniu 2 mg/ml, aby uzyskać stężenie końcowe 200 µg/ml. Kontynuuj mieszanie zawiesiny komórkowej podczas dodawania roztworu lizozymu. Podobnie jak wcześniej, utrzymuj końcówkę poniżej poziomu zawiesiny komórkowej.Inkubować komórki z lizozymem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji przygotować sterylną kolbę o pojemności jednego litra z małym mieszadłem magnetycznym i 530 mililitrów dejonizowanej wody o stopniu czystości molecular grade w temperaturze pokojowej, odpowiedniej do hodowli komórek.Po zakończeniu inkubacji komórek, należy powoli rozcieńczyć osmotycznie lizowaną zawiesinę komórkową w wodzie w kolbie o pojemności 1 litra, używając pipety 25 ml umieszczonej na dnie kolby obok mieszadła magnetycznego; proces ten powinien trwać od 10 do 15 minut przy delikatnym mieszaniu. Krok ten jest trudny i ma krytyczne znaczenie dla całkowitego powodzenia eksperymentu. Mieszanie powinno być na tyle szybkie, aby dokładnie rozproszyć zawiesinę komórkową, ale nie zbyt intensywne, aby uniknąć spieniania lub powstawania pęcherzyków powietrza.Powoli zwiększaj obroty mieszadła magnetycznego, aby zapewnić właściwe mieszanie. Uważnie monitoruj proces rozcieńczania i w razie potrzeby dostosuj szybkość przepływu lub obracaj kolbą, aby rozproszyć lokalne skupiska komórek, agregaty oraz pasma komórkowe. Po dodaniu wszystkich komórek inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej; po zakończeniu inkubacji przenieś 40 ml aliquotów roztworu do lizy osmotycznej do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wiruj przy 7 500 G przez 30 minut w temperaturze 10 °C.Aby usunąć nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia po wirowaniu, należy ostrożnie odpiąć od 27 do 30 ml supernatu z każdej probówki stożkowej i połączyć go w sterylnym kolbie o pojemności jednego litra. Przenieś 25 ml połączonego supernatu do każdej z 16 probówek do ultrawirowania i wiruj przy 200 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsiusza. 10 minut przed zakończeniem wirowania.Przygotować zmodyfikowany bufor do resuspensji błon. Po odwirowaniu lizowanych komórek, w sterylnej probówce połączyć osiem mililitrów buforu do zawiesiny błon z jedną tabletką koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA oraz 375 jednostek Benzonase, a następnie delikatnie wymieszać. Przejść do odzyskiwania osadu błonowego.Po zakończeniu ultrawirowania lizowanych komórek ostrożnie zlej nadsącz, a następnie odwróć probówki do góry dnem na materiale chłonnym i mocno nimi uderz. Aby usunąć nadmiar nadsączu, zaznacz markerem miejsce każdego osadu błonowego, co ułatwi jego wizualizację. Delikatnie resuspenduj osiem osadów błonowych w 600 µL zmodyfikowanego buforu do resuspendowania błon.Ponowne zawieszenie osadów błony jest utrudnione. Należy zatem delikatnie przepłukiwać osad zmodyfikowanym buforem do resuspensji błon (Resus suspension Buffer), aż oddzieli się on od ścianki probówki. Jest to kolejny etap, który jest wymagający i krytyczny dla ogólnego sukcesu eksperymentu.W razie potrzeby należy użyć końcówki mikropipety, aby zdrapać osad błoniasty ze ścianki probówki. Podczas pipetowania należy unikać spieniania lub tworzenia pęcherzyków powietrza; nadmierne siły ścinające doprowadzą do powstania mieszanych komórek, co uniemożliwi separację błon. Przenieść każdą zawiesinę resuspensjonowaną błony do kolejnego zestawu ośmiu probówek.Ostrożnie resuspenduj pozostałe osady i połącz wszystkie zawiesiny w sterylnej probówce. Po usunięciu osadów błon ze wszystkich 16 probówek, przemyj każdą czwórkę probówek 600 µL zmodyfikowanego buforu do resuspendowania błon. Skup płukanie na zaznaczonym obszarze każdej probówki i połącz roztwór z płukania z resuspendowanymi błonami.Powtórz płukanie dla pozostałych probówek. Inkubuj zawiesinę z membrany w delikatnym ruchu kołyszącym przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu degradacji DNA i ułatwienia redukcji materiału kłaczkowatego. Następnie pobierz niewielką ilość zawiesiny z membrany i przeprowadź oznaczanie ilości białka.Aby określić całkowitą wydajność błon, należy przygotować rozcieńczenia zawiesiny błon w 2,5% SDS w stosunku jeden do jednego oraz jeden do trzech, a następnie podgrzać nierozcieńczoną zawiesinę w stosunku jeden do jednego oraz zawiesinę w stosunku jeden do trzech w temperaturze 90 °C przez 10 minut. SDS i ciepło są niezbędne do uwolnienia O MPS z wyekstrahowanych błon. Do ilościowego oznaczenia stężenia białka w resuspensji błon należy użyć testu białkowego BioRad DC.Całkowita wydajność białka wynosi zazwyczaj od 1 do 1,6 mg/ml. Po określeniu stężenia białka w preparacie błonowym próbki można rozdzielić w gradiencie sacharozy. Należy rozpocząć od przygotowania serii roztworów sacharozy w EDTA.Aby przygotować liniowe gradienty sacharozy, należy użyć pipety z gruszką, aby nanieść warstwami 1,8 mililitrów każdego roztworu sacharozy do probówek do ultrawirówki UltraClear o wymiarach 14 by 95 milimetrów w następującej kolejności: 55%, 50%, 45%, 40%, 35% oraz 30%. Następnie na wierzch każdego gradientu należy nanieść 1,5 miligramów zawiesiny membran. Nie należy nanosić więcej niż 1,7 mililitrów zawiesiny membran na jeden gradient. Należy indywidualnie zważyć każdą probówkę i ostrożnie skorygować wagę końcową, dodając lub usuwając zawiesinę membran, tak aby wszystkie probówki miały taką samą masę. Gradienty sacharozy należy przenieść do rotora z ruchomymi koszyczkami SW 40 TI i wirować przy 256 000 GS przez minimum 17 godzin w temperaturze czterech stopni Celsius.Po 17 godzinach wirowania zatrzymaj wirówkę i ostrożnie wyjmij gradienty sacharozy z rotora. Następnie zbierz frakcje. Ostrożnie oczyść dno probówki z gradientem sacharozy 70% etanolem.Następnie należy przebić dno probówki igłą o rozmiarze 21 G i zebrać sekwencyjne frakcje o objętości 500 µL z gradientu do sterylnych probówek do mikrowirówki. Należy pozwolić na ściekanie gradientu siłą grawitacji, aby nie zakłócić gradientu sacharozy. Jeśli jednak ściekanie z dna probówki z gradientem ustanie, można przyłożyć niewielki nacisk palcem do górnej części probówki.Na koniec, za pomocą refraktometru wyznacz współczynnik załamania światła dla każdej frakcji gradientu sacharozy i skorelowanie go z gęstością właściwą wyrażoną w gramach na mililitr. Ocenę lokalizacji białek w reprezentatywnych frakcjach gradientu sacharozy przeprowadź za pomocą rozdziału w metodzie SDS-PAGE oraz immunoblottingu. Poniżej przedstawiono immunoblot frakcji z gradientu sacharozy użytego do rozdziału błon wyekstrahowanych z lizowanego szczepu żywej szczepionki Freis; białka błony zewnętrznej szczepu Freis lub Omp zlokalizowano w zakresie gęstości od 1,17 do 1,2 g/mL.W ramach porównania, białka błony wewnętrznej (ip) lokalizowały się pomiędzy gęstościami 1,13 a 1,14 g/ml. Podobne wyniki uzyskano dla szczepu FHU four. Przedstawiłem właśnie sposób ekstrakcji i izolacji pęcherzyków błony zewnętrznej Francis Cellis poprzez lizę osmotyczną i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu komórek bakteryjnych we wczesnej fazie wzrostu logarytmicznego, aby powoli, lecz konsekwentnie rozcieńczać te komórki bakteryjne w wodzie dejonizowanej podczas etapu osmotycznego gliko, oraz o zachowaniu ostrożności podczas resuspensji osadów błonowych z ultrawirówki. To kończy naszą procedurę separacji błon. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przyszłych eksperymentach.

method-for-the-isolation-of-francisella-tularensis-outer-membranes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda izolacji Francisella tularensis zewnętrznych błon

Źródło: Cian, M. B. et al., Separation of the cell envelope for Gram-negative bacteria into Inner and Outer membrane fractions with Technical Adjustment for Acinetobacter baumannii. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej frakcji błonowej bakterii Gram-ujemnych za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy. Frakcje membranowe są oczyszczane i przechowywane w niskich temperaturach w celu ukierunkowanej analizy składników specyficznych dla membrany.

Separacja wewnętrznych i zewnętrznych frakcji błonowych bakterii Gram-ujemnych

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Jung, A. L. i in. Pęcherzyki zewnętrznej błony Legionella pneumophila: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego u makrofagów. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje izolację zewnętrznych pęcherzyków błonowych (OMV) od Legionella pneumophila za pomocą sekwencyjnej wirowania, sterylnej filtracji oraz ultrawirowania. Oczyszczone OMV, wzbogacone o białka błonowe i lipopolisacharydy, nadają się do badań interakcji gospodarz-patogen.

Izolacja zewnętrznych pęcherzyków błonowych Legionella pneumophila oparta na ultrawirowaniu

Ten protokół opisuje dotchawicze szczepienia szczurów Fischer 344 z Francisella tularensis. Procedura ta naśladuje narażenie płuc ludzi na ten potencjalny czynnik zagrożenia biologicznego i może być wykorzystana do przetestowania skuteczności szczepionki i terapii przeciwko tularemii płucnej.

Inokulacja dotchawicza szczurów Fischer 344 w Francisella tularensis

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Chociaż prokariota nie mają układu organellarnego, istnieją regiony subkomórkowe ze zlokalizowanymi białkami. Ilościowa i jakościowa analiza enzymów i białek w regionach subkomórkowych jest ważna dla opracowania celów dla leków i szczepionek. Tutaj ilustrujemy subkomórkowe frakcjonowanie białek leptospiralnych za pomocą Triton X-114 i jego analizę.

Wzbogacanie białek subkomórkowych w Leptospira przy użyciu metody frakcjonowania opartej na Triton X-114

Poznaj metodę izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis poprzez lizę osmotyczną i ultrawirówkę w gradiencie sacharozy. Technika ta umożliwia badanie białek błonowych i mechanizmów wirulencji.

Metoda izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis

Przeglądaj więcej filmów