Name: Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu oznaczenia dynamicznej modyfikacji histonów w aktywowanej ekspresji genów w komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Poznaj technikę ChIP do badania dynamicznych modyfikacji histonów w ludzkich komórkach aktywowanych interferonem gamma. Ta metoda pozwala analizować zmiany w ekspresji genów i wiązanie czynników transkrypcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana przez University of Virginia, University of Virginia Cancer Center oraz The Thomas F. and Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Dziękujemy laboratorium Jamesa E. Darnell (Rockefeller University) oraz laboratorium Roberta Rossa (Fordham University) za udostępnienie linii komórkowych.

PLANOWANIE
Na dzień przed planowanym eksperymentem ChIP należy wyhodować komórki tak, aby zapewnić ich wystarczającą liczbę. Przyjmuje się, że każdy test ChIP wymaga ~1-1,5 x 107 komórek. Zawsze należy zaplanować wykonanie kontroli negatywnej (IgG) i pozytywnej (przeciwciało pan-histonowe) oraz powtórzeń eksperymentów. 
 Wskazówka - W przypadku komórek 2FTGH każdy test ChIP wymaga około jednejy szalki hodowlanej o średnicy 15 cm przy 80% konfluencji.
CZĘŚĆ 1: PRZYGOTOWANIE CHROMATYNY I WYKONA NIE ChIP
<ol>
 <li>Usunąć pożywkę i indukować komórki przez wymagany czas, dodając 20 mL 10% surowicy z cieląt (CCS)/DMEM zawierającej IFN-gamma w stężeniu 5 ng/mL. Na płytkach nieindukowanych zastąpić pożywkę również 20 mL 10% CCS/DMEM.</li>
 <li>W dygestorium dodać 540 μL 37% formaldehydu do 20 mL pożywki (stężenie końcowe 1%) w szalce 15 cm. 
 Wskazówka - Przechylić płytkę i dodać formaldehyd do skupiska pożywki, a następnie kołysać płytką, aby równomiernie go rozprowadzić.
 </li>
 <li>Pozostawić do przebiegu sieciowania przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Dodać glicynę do stężenia końcowego 0,125 M, aby przerwać sieciowanie.</li>
 <li>Odssać pożywkę próżniowo i raz przemyć komórki 10 mL lodowatego roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).</li>
 <li>Zebrać komórki skrobakiem komórkowym w ok. 7 mL PBS i połączyć komórki (z 6 płytek) traktowane w ten sam sposób w probówce stożkowej 50 mL na lodzie.</li>
 <li>Wirować (wirówka Beckman Coutler Allegra 12-R) przy 180 rpm w temperaturze 4°C przez 5 minut i odessać PBS. 
 Wskazówka - Jeśli proces jest przerywany na tym etapie, szybko zamrozić osad komórkowy i przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy w 4 mL buforu pęczniejącego (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Przed użyciem dodać 1 mM DTT, kompletnych inhibitorów proteaz i schłodzić na lodzie) i przenieść do probówki stożkowej 15 mL. 
 Wskazówka - Ta objętość buforu pęczniejącego jest odpowiednia dla zbiórki z 6 płytek (ok. 6-9 x 107 komórek). Większa lub mniejsza ilość buforu może zmienić wydajność homogenizacji w douncerze.
 </li>
 <li>Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę do schłodzonego douncera 15 mL (Wheaton) i wykonać 20 pociągnięć tłuczkiem A.</li>
 <li>Przenieść homogenizowane komórki z powrotem do probówki stożkowej 15 mL na lodzie.</li>
 <li>Wirować przy 250 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Resuspender osad jądrowy (ok. 20 μL z 6 płytek) w 3 mL (15 objętości osadu) buforu do sonikacji (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-10, 0,1% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS. Tuż przed użyciem dodać kompletne inhibitory proteaz i schłodzić na lodzie). 
 Wskazówka - Ta objętość buforu do sonikacji jest odpowiednia dla zbiórki z 6 płytek (ok. 6-9 x 107 komórek). Większa lub mniejsza ilość buforu może zmienić wydajność sonikacji.</li>
 <li>Sonikować zawiesinę jąder na lodzie przez 10 cykli (20 sekund włączony/40 sekund wyłączony /ustawienie amplitudy na 8) przy użyciu sonikatora Misonix Sonicator 30 wyposażonego w mikrokońcówkę. Zazwyczaj skutkuje to powstaniem fragmentów chromatyny o średniej wielkości 20-10 bp. 
 Wskazówka - Ponieważ sonikatory różnią się od siebie, wydajność sonikacji należy określić empirycznie. W tym celu należy pobrać aliquoty po 20 μL przed sonikacją oraz po każdym cyklu sonikacji. Próbki te należy ogrzewać w 65°C przez 4 godziny. Następnie dodać bufor do ładowania DNA i przeprowadzić standardową elektroforezę na żelu agarozowym 1%/TBE, aby zwizualizować fragmenty DNA.) 
 </li>
 <li>Przenieść sonikowany materiał do probówki wirówkowej SS34 i wirować przez 20 minut w temperaturze 4°C przy 130 rpm w rotorze SS34 (wirówka Sorvall RC6 Plus), abyt osadzić zazwyczaj niewielką ilość debris komórkowych.</li>
 <li>Ostrożnie przenieść nadsącz do probówki stożkowej 15 mL na lodzie.</li>
 <li>Przeprowadzić wstępne oczyszczanie (pre-clearing) poprzez dodanie 360 μL zawiesiny kulek agarozowych z DNA sperm plemników łososia/Białkiem A lub G i kołysanie w temperaturze 4°C przez co najmniej 30 minut. 
 Wskazówka - Ten krok zmniejsza poziom szumu w analizie, który wynika z niespecyficznych zdarzeń wiązania.</li>
 <li>Wirować przy 10 rpm w temperaturze 4°C przez 5 minut, aby osadzić kulki agarozowe.</li>
 <li>Przenieść oczyszczony nadsącz do kolejnej probówki stożkowej 15 mL na lodzie.</li>
 <li>Zmierzyć jednostki A260 oczyszczonej chromatyny i dostosować objętość za pomocą buforu do sonikacji do czterech (4) jednostek A260 (0,2 mg/mL przy założeniu, że 1 jednostka A260 = 0,050 mg/ml). 
 Wskazówka - Aby zmierzyć jednostki A260, rozcieńczyć 10 μL oczyszczonej chromatyny w 190 μL DDW; spektrofotometr ustawić na zero (blank) za pomocą 10 μL buforu do sonikacji w 190 μL DDW. 
 </li>
 <li>Odstawić 75 μL chromatyny (przy 4 jednostkach A260) jako próbkę wejściową (Input Sample) i przechowywać w temperaturze 20°C do momentu odwrócenia sieciowania. Wskazówka - Ten krok jest kluczowy dla analizy danych. Nie można pominąć pobrania aliquoty wejściowej. </li>
 <li>Rozdzielić przygotowaną chromatynę do probówek mikrocentryfugowych 1,7 mL na lodzie w aliquotach po 1 mL. Wskazówka - Jeśli proces jest przerywany na tym etapie, szybko zamrozić przygotowaną chromatynę na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80°C. Uwaga: przechowywana chromatyna może ulec degradacji, co prowadzi do mniej niż optymalnych wyników, dlatego należy tego unikać w miarę możliwości. </li>
 <li>Dodać przeciwciała klasy ChIP do zestawów próbek indukowanych i nieindukowanych w duplikacie. Dodać IgG (2 μg) i przeciwciało przeciwko pan Histonie H3 (15 μL) jako kontrole negatywną i pozytywną do zestawów próbek indukowanych i nieindukowanych. 
 Wskazówka - Ilość przeciwciała do użycia musi zostać określona empirycznie lub należy sprawdzić kartę produktu dostawcy w celu poznania sugerowanych ilości. Zazwyczaj 1-2 μg przeciwciała klasy ChIP działa dobrze. Odpowiednią objętość w przypadku przeciwciał dostarczanych w formie surowicy należy określić empirycznie. 
 </li>
 <li>Kołysać wszystkie probówki przez noc w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
CZĘŚĆ 2: WYDZIELANIE IMMUNOKOMPLEKSÓW
<ol>
 <li>Do wszystkich probówek dodać 60 μL zawiesiny kulek agarozowych Salmon Sperm DNA/Protein A lub Protein G. 
 Wskazówka Należy używać Protein A dla króliczych przeciwciał poliklonalnych oraz Protein G dla mysich przeciwciał monoklonalnych.</li>
 <li>Inkubować w wytrząsarce w temperaturze 4°C przez co najmniej 60 minut.</li>
 <li>Ucieplić kompleksy immunologiczne (kulki agarozowe) poprzez delikatne wirowanie w mikrowirówce przy 200 rpm w temperaturze 4°C przez 3 minuty.</li>
 <li>Odssać nadsącz.</li>
 <li>Przemyć kompleksy immunologiczne 1 mL każdego z poniższych buforów do mycia przez 10 minut w wytrząsarce w temperaturze 4°C. Po każdym myciu wirować w mikrowirówce przez 3 minuty przy 200 rpm w temperaturze 4°C i odssać nadsącz. Próbki należy przechowywać w lodzie. PMSF należy dodać bezpośrednio przed użyciem.
 <ul>
 <li>Bufor do mycia o niskim zasoleniu (Low Salt Wash) – 0.1% SDS, 1% Triton X-10, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF</li>
 <li>Bufor do mycia o wysokim zasoleniu (High Salt Wash) – 0.1% SDS, 1% Triton X-10, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM PMSF</li>
 <li>Bufor do mycia LiCl (LiCl Wash) – 0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoksycholan sodu, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF</li>
 <li>Bufor do mycia TE (TE Wash) – dwa mycia buforem TE – 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Usunąć ostatnią porcję buforu TE i dodać do kulek 50 μL buforu do elucji (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). 
 Wskazówka – Bufor do elucji należy przygotować na świeżo. 
 </li>
 <li>Wymieszać kulki agarozowe w buforze do elucji za pomocą vorteksu i ogrzewać przez 30 minut w temperaturze 65°C. 
 Wskazówka – każdą probówkę należy vorteksować co najmniej co 10 minut w ciągu tych 30 minut.</li>
 <li>Wirować w mikrowirówce przez 30 sekund przy 20 rpm i przenieść eluat do nowej probówki do mikrowirówki. 
 Wskazówka – podczas elucji należy rozmrozić próbki wejściowe i dodać do każdej z nich 50 μL buforu do elucji. Próbki te należy uwzględniać we wszystkich kolejnych etapach. 
 </li>
 <li>Do wszystkich próbek dodać 5 M NaCl do stężenia końcowego 20 mM, a następnie wymieszać za pomocą vorteksu.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 65°C przez noc (lub co najmniej przez 4 godziny).</li>
</ol>
CZĘŚĆ 3: OCZYŚCZANIE DNA PO ChIP I DNA WEJŚCIOWEGO (INPUT)
<ol>
 <li>Wszystkie próbki wirować w mikrowirówce przez 30 sekund, aby zebrać kondensację z pokrywek.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 1 μL RNAse A (10 U/μL) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
 <li>Dodać 10 μL 0,5 M EDTA, 40 μL 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 μL Proteinazy K (10 mg/mL) i inkubować w temperaturze 45°C przez 60 minut. Wskazówka: Przygotować master mix z tych odczynników i dodać 52 μL do każdej probówki.</li>
 <li>Próbki poddać ekstrakcji fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie ekstrakcji chloroform/alkohol izoamylowy.</li>
 <li>Dodać 2 μL glikogenu (25 μg/μL) oraz 0,1 objętości 3 M octanu sodu pH 5,2 i wymieszać na wortexie.</li>
 <li>Dodać 2,5 objętości 10% etanolu i wymieszać na wortexie.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 20°C przez noc.</li>
</ol>
CZĘŚĆ 4: KONTYNUACJA OCZYSZCZANIA DNA ChIP oraz DNA INPUT
<ol>
 <li>Wiruj próbki w mikrocentry fudze przez minimum 20 minut przy 130 rpm w temperaturze 4°C, aby wytrącić pellety DNA/glikogenu.</li>
 <li>Przemyj pellety DNA/glikogenu 1 mL 70% etanolu.</li>
 <li>Osusz pellety na powietrzu lub szybko w wirówce próżniowej DNA Savant. 
 Wskazówka - Nie doprowadź do nadmiernego wysuszenia DNA.</li>
 <li>Resuspender pellety DNA/glikogenu w 200 μL buforu TE.</li>
 <li>DNA (1 μL) jest gotowe do ilościowego oznaczenia za pomocą real-time PCR. Pozostałe DNA przechowywać w temperaturze 20°C. 
 Wskazówka - Użycie więcej niż 1 μL DNA może hamować reakcje real-time PCR, dlatego należy ostrożnie zwiększać skalę.</li>
</ol>
Część 5: REPREZENTATYWNE WYNIKI:
Próbki DNA z ChIP oraz Input są ilościowo oznaczane metodą Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 750 Fast Real-Time PCR System) przy użyciu starterów specyficznych dla analizowanego locus genu. Startery celujące w sekwencję genomiczną, o której wiadomo, że jest ona wzbogacona lub pozbawiona badanych modyfikacji histonowych, mogą służyć jako kontrole pozytywne i negatywne. Dane są prezentowane jako procent Inputu. Procedurę ChIP należy powtórzyć w całości z trzema powtórzeniami biologicznymi, aby upewnić się, że raportowane zmiany w modyfikacjach histonowych są istotne statystycznie.
Istnieje kilka istotnych kwestii, które należy rozważyć podczas wykorzystania real-time PCR do ilościowego oznaczania DNA, w tym projektowanie starterów, wydajność PCR oraz odpowiednia metoda obliczania procentowego udziału materiału wejściowego i procedury normalizacji. Podczas profilowania stopnia zajętości modyfikacji histonowych w obrębie genu, wydajność PCR musi być spójna dla wszystkich par starterów. Producent systemu real-time PCR może zapewnić niezbędne informacje oraz szkolenie.
Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wyniki immunoprecypitacji chromatyny podczas aktywacji genu IRF1 przez STAT19, wywołanej przez IFN-γ.
<img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="Analiza ekspresji genów, H3K36me3, STAT1, Pol II, Pan H3; wykres % input w funkcji lokalizacji starterów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rycina 1. Obsadzenie STAT1, polimerazy RNA II i H3K36me3 jest dynamiczne podczas aktywacji genu IRF1 przez STAT1. (A, B, C) ChIP z użyciem przeciwciał α-H3K36me3, α-STAT1 i α-Pol II dla chromatyny pobranej z komórek 2FTGH indukowanych IFN-γ przez 30 minut (czerwone kwadraty), 1,5 godziny (niebieskie kółka), 5 godzin (zielone trójkąty) lub nieindukowanych (czarne romby). IgG stanowi kontrolę negatywną (szare krzyżyki). (D) Przeciwciało Pan H3 służy jako kontrola pozytywna i pokazuje stopień zajętości histonów w obrębie locus w warunkach indukowanych (niebieskie kółka) i nieindukowanych (czarne romby). Spadek w okolicy -5 bp wynika z ubytku nukleosomów, który występuje w miejscach inicjacji transkrypcji.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiony protokół ChIP został z sukcesem zastosowany w laboratorium do analizy ponad dwudziestu różnych modyfikacji histonów. Ponadto scharakteryzowaliśmy zmiany w zajętości czynników transkrypcyjnych, enzymów modyfikujących histony, białek rozpoznających modyfikacje histonów oraz aparatu transkrypcyjnego polimerazy RNA II w obrębie kilku genów indukowanych przez IFN-γ. Procedurę tę wykorzystaliśmy również do scharakteryzowania zmian w modyfikacjach histonów podczas różnicowania nowotworowej komórki macierzystej<sup...

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform/alkohol izoamylowy</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny Mini zestaw inhibitorów proteaz</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca Cosmic</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sód deoksycholanowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko Histonie H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/izoamyl</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAza A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza z DNA sperm sperm łososia/Białkiem A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza z DNA sperm sperm łososia/Białkiem G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko polimerazie RNA II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecypitacja chromatyny (chip) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

W odpowiedzi na różnorodne ligandy zewnątrzkomórkowe, czynniki transkrypcyjne STAT (signal transducer and activator of transcription) są szybko rekrutowane ze swojego stanu utajonego w cytoplazmie do receptorów powierzchniowych komórki, gdzie ulegają aktywacji poprzez fosforylację pojedynczej reszty tyrozyny1. Następnie tworzą dimery i translokują do jądra komórkowego, aby stymulować transkrypcję genów docelowych, wpływając na wzrost, różnicowanie, homeostazę oraz odpowiedź immunologiczną. Biorąc pod uwagę ich szeroki udział w prawidłowych procesach komórkowych, nie jest zaskakujące, że dysregulacja funkcji STAT przyczynia się do rozwoju chorób ludzkich, w szczególności nowotworów2 oraz chorób autoimmunologicznych3. Jest dobrze znane, że transkrypcja jest regulowana poprzez zmiany w matrycy chromatynowej4,5. Zmiany te obejmują aktywność kompleksów zależnych od ATP, a także kowalencyjne modyfikacje histonów i metylację DNA6. Ponieważ aktywacja ekspresji genów przez białka STAT jest zarówno szybka, jak i przejściowa, wymaga ona specyficznych mechanizmów modulowania matrycy chromatynowej w obrębie locus genów zależnych od STAT. Aby zdefiniować te mechanizmy, scharakteryzowaliśmy modyfikacje histonów oraz aktywności enzymatyczne, które je generują, w locus genów reagujących na sygnalizację STAT. Niniejszy protokół opisuje immunoprecypitację chromatyny, metodę cenną w badaniu wpływu sygnalizacji STAT na chromatynę podczas aktywowanej ekspresji genów.

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania dynamicznych zmian w matrycy chromatyny, które regulują transkrypcję indukowaną przez szlak przekazywania sygnału.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

W odpowiedzi na różnorodne ligandy zewnątrzkomórkowe, czynniki transkrypcyjne STAT (przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji) są szybko rekrutowane ...

Eksperyment ChIP jest wykorzystywany do monitorowania dynamicznych zmian w modyfikacjach histonów, które występują podczas aktywacji ekspresji genów przez STAT1; w ten sposób można również badać zmiany w zajętości czynników transkrypcyjnych, kompleksów modyfikujących histony oraz samego aparatu transkrypcyjnego. Aby rozpocząć analizę, komórki indukuje się interferonem gamma w celu aktywacji sygnalizacji STAT1, po czym następuje sieciowanie komórek formaldehydem i ich zebranie. Następnie izoluje się jądra i poddaje je sonikacji, co powoduje rozszczepienie chromatyny na fragmenty o długości około 200 do 1000 par zasad. W kolejnym kroku dodaje się przeciwciało skierowane przeciwko białku lub modyfikacji histonów będącej przedmiotem zainteresowania, a następnie wytrąca kompleksy immunologiczne.Kompleksy immunologiczne są płukane, wiązania krzyżowe są zrywane, a DNA jest oczyszczane. Zmiany w modyfikacjach histonów lub rekrutacja białek do konkretnych obszarów genu mogą zostać określone na podstawie ilościowej analizy DNA immunoprecypitowanego za pomocą reakcji qPCR. Cześć, nazywam się Lauren Borow z laboratorium dr Melissy Hendrickson oraz Katedry Biologii na Uniwersytecie Wirginijskim.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę immunoprecypitacji chromatyny. Stosujemy tę metodę w naszym laboratorium do badania dynamicznych modyfikacji histonów, które zachodzą podczas transkrypcji w odpowiedzi na sygnalizację STAT1. Zatem zacznijmy.Na jeden dzień przed rozpoczęciem tej procedury należy hodować komórki w taki sposób, aby dostępna była wystarczająca ich liczba dla dwóch linii komórkowych FTGH użytych w tym badaniu. Dla każdego testu na chipie należy przygotować jedną szalkę hodowlaną o średnicy 15 centymetrów z 80% konfluencją. W każdym eksperymencie należy uwzględnić negatywną kontrolę IgG, pozytywną kontrolę z przeciwciałem pan-histonowym oraz próby powtórzone.Aby rozpocząć tę procedurę, należy usunąć pożywkę hodowlaną. Zastąp ją 20 mililitrami DMEM uzupełnionego o 10% surowicy z cieląt kosmicznych i zawierającego interferon gamma w stężeniu pięciu nanogramów na mililitr. Zastąp również pożywkę na płytkach nieindukowanych 20 mililitrami 10%C-C-S-D-M-E-M.Dalsze prace należy prowadzić w dygestorium. Przechylić szalkę do hodowli tkankowej o średnicy 15 centymetrów i dodać 540 µL 37% roztworu formaldehydu do 20 mL pożywki. Następnie delikatnie kołysać szalką, aby równomiernie rozprowadzić roztwór.Pozostaw próbki na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia sieciowania. Następnie dodaj glicynę do stężenia końcowego 125 millimolar, aby zatrzymać reakcję sieciowania. Odessij medium za pomocą aspiratora próżniowego i przemyj komórki raz 10 mililitrami lodowatego PBS, używając skrobaka do komórek; zbierz komórki w około siedmiu mililitrach PBS i połącz komórki traktowane w ten sam sposób z sześciu płytek o średnicy 15 centymetrów w probówce stożkowej o pojemności 50 mililitrów w lodzie.Na koniec odwiruj zebrane komórki z prędkością 1 800 RPM przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odessaj PBS. Jeśli procedura jest przerywana na tym etapie, zamroź gwałtownie pellet komórkowy i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po sieciowaniu. Kolejnym krokiem jest przygotowanie chromatyny.Zacznij od dodania 1 mM DTT oraz pełnego zestawu inhibitorów proteaz do buforu pęczniejącego schłodzonego na lodzie. Resuspenduj osad z sześciu płytek, pobierając 4 mL buforu pęczniejącego i przeleć do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Zastosowanie większej lub mniejszej ilości buforu może wpłynąć na efektywność homogenizacji.Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 minut. Po zakończeniu inkubacji na lodzie przenieść zawiesinę do schłodzonej probówki typu dounce o pojemności 15 ml i wykonać 20 pociągnięć tłokiem typu A. Po homogenizacji przenieść komórki z powrotem do stożkowej probówki 15 ml na lód, wirować z prędkością 2 500 RPM przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić nadsącz, pozostawiając pellet jąder komórkowych.Do schłodzonego na lodzie buforu do sonikacji dodać kompletny inhibitor proteaz. Sześć płytek pozwala uzyskać około 200 µL zawiesiny osadu jądrowego. Zawiesić osad w 15 objętościach osadu lub w 3 mL buforu do sonikacji.Zastosowanie innej objętości dla tej liczby komórek może zmienić efektywność sonikacji. Efektywność sonikacji powinna zostać uprzednio określona dla sonikatora używanego w Twoim laboratorium. W niniejszej procedurze zastosowano urządzenie Miss Sonic sonicate 3000 wyposażone w mikroczip.Poddaj zawiesinę jąder sonikacji na lodzie przez 10 cykli (20 sekund pracy i 40 sekund przerwy) przy ustawieniu amplitudy na poziom osiem. Zazwyczaj po zakończeniu sonikacji prowadzi to do uzyskania fragmentów chromatyny o średniej wielkości od 200 do 1000 par zasad. Przenieś sonikowany materiał do probówki wirówki SS 34 i wiruj przy 13 000 RPM przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W rotorze SS 34 odwiruj próbkę w celu osadzenia resztek komórkowych, których ilość jest zazwyczaj niewielka. Ostrożnie przenieś nadfiltr do probówki stożkowej o objętości 15 mililitrów w lodzie. Następnie przejdź do etapu blokowania, aby zmniejszyć tło wynikające z niespecyficznych zdarzeń wiązania.W pierwszej kolejności przeprowadź wstępne oczyszczanie preparatu chromatyny, dodając 360 µL zawiesiny kulek agro z białkiem A lub G i DNA plemników łososia, a następnie inkubuj w temperaturze 4 °C podczas delikatnego mieszania przez co najmniej 30 minut. Wirowarkuj z prędkością 1000 RPM przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzić kulki agro. Następnie przenieś oczyszczony naddatek do drugiej probówki stożkowej o pojemności 15 ml, utrzymując ją w lodzie.Następnie zmierz absorbancję przy 260 nanometrach lub jednostki A 260 chromatyny. Rozcieńcz 10 µL chromatyny w 190 µL wody dwukrotnie destylowanej. W celu przygotowania próbki ślepej połącz 10 µL buforu do sonikacji z 190 µL wody dwukrotnie destylowanej.Dostosuj objętość próbki w buforze do sonikacji do czterech jednostek A 260. Odstaw 75 µL uprzednio oczyszczonej chromatyny przy czterech jednostkach A 260 jako próbkę wejściową (input) i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu odwrócenia wiązań krzyżowych. Należy pamiętać, że krok ten jest kluczowy dla analizy danych.Należy zatem pamiętać o pobraniu alikwotu wejściowego; pozostałą partię preparatu chromatyny rozdzielić w alikwotach po 1 ml do probówek typu microcentrifuge o pojemności 1,7 ml na lodzie. W przypadku przerwania procedury na tym etapie, chromatynę należy zamrozić gwałtownie w suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.Ponieważ jednak przechowywana chromatyna może ulegać degradacji, najlepiej jest kontynuować procedurę ip. Teraz należy dodać przeciwciała klasy chip do zestawów próbek indukowanych i nieindukowanych. W dubletach.Zazwyczaj dobrze sprawdza się od jednego do dwóch mikrogramów przeciwciała, jednak ilość tę należy wcześniej wyznaczyć empirycznie. Do zestawów próbek indukowanych i nieindukowanych należy dodać dwie mikrogramy IgG oraz 15 mikrolitrów przeciwciała przeciwko pan histonie H3 jako kontrolę negatywną i pozytywną. Następnie wszystkie probówki należy inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 4°C, a po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami przystąpić do izolacji kompleksów immunologicznych.Do wszystkich probówek dodać 60 µL zawiesiny kulek z białkiem A lub białkiem G z DNA sperm sperm salmon. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 60 minut w celu związania kompleksów immunologicznych z kulkami.Osadź kompleksy immunologiczne związane z koralikami agarozy poprzez delikatne wirowanie z prędkością 2000 RPM przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie odessij nadsącz. Następnie przeprowadź serię przemywań buforem, zaczynając od przemywania w niskim stężeniu soli, a następnie w wysokim stężeniu soli. Na koniec wykonaj przemywanie chlorkiem litu.I na koniec, dwukrotne przemycie buforem TE z każdego z buforów piorących. Tuż przed użyciem dodać PMSF, przemyć 1 mL buforu przez 10 minut w wytrząsaniu w temperaturze 4 °C, odwirować przez 3 minuty przy 2000 RPM w temperaturze 4 °C i odessać nadsącz, utrzymując próbki w niskiej temperaturze na lodzie. Po usunięciu końcowego przemycia buforem TE, dodać 500 µL świeżo przygotowanego buforu Lucian do kulek, wymieszać kulek agarose w buforze Lucian za pomocą wortexa i inkubować przez 30 minut w temperaturze 65 °C.Wiadomuj próbki wejściowe, mieszając je w vortexie co 10 minut podczas elucji, a następnie dodaj do każdej z nich 500 µL buforu elucyjnego. Uwzględnij te próbki we wszystkich kolejnych etapach. Po zakończeniu inkubacji próbek w temperaturze 65 °C, wiruj je w mikrowirówce przez 30 sekund przy 2000 RPM i przenieś EENT do nowej probówki do mikrowirówki.Na koniec należy odwrócić proces sieciowania. Do wszystkich próbek należy dodać NaCl w stężeniu 5 M, aby uzyskać końcowe stężenie 200 mM, a następnie inkubować w wirującym inkubatorze w temperaturze 65 °C przez co najmniej cztery godziny lub przez całą noc. Po odwróceniu sieciowania kompleksów immunologicznych, związane DNA można odzyskać po zakończeniu inkubacji w temperaturze 65 °C.Wiruj próbki w mikrocentryfudze przez 30 sekund. Aby zebrać kondensat z zakrętek, dodaj jeden mikrolitr RNase A do każdej probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodaj do każdej probówki 10 µL 0,5 M EDTA, 40 µL 0,5 M Tris-HCl pH 6,5 oraz dwa mikrolitry proteinazy K lub łącznie 52 µL master miksu i inkubuj w temperaturze 45 °C przez 60 minut. Ekstrahuj próbki za pomocą fenolu i chloroformu, izopropanolu, a następnie ponownie chloroformem i izopropanolem.Następnie, aby wyprecypitować DNA, do każdej próbki należy dodać 2 µL glikogenu oraz 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2, a następnie wymieszać na wirówce typu vortex. Dodać 2,5 objętości 100% etanolu, wymieszać na vortexie i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C. Próbki należy wyjąć i wirować przy 13 000 RPM przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Przemyj osady DNA i glikogenu jednym mililitrem 70% etanolu, a następnie osusz je na powietrzu lub za pomocą wirówki próżniowej. Nie doprowadź do nadmiernego wysuszenia DNA. Resuspenduj osady w 200 µL buforu TE i wyznacz ich ilość, wykorzystując do analizy w czasie rzeczywistym nie więcej niż jeden mikrolitr.Przedstawione tutaj wyniki PCR pochodzą z eksperymentu ChIP śledzącego dynamikę H3K36me3. Podczas indukcji genu IRF1 za pomocą interferonu gamma wykorzystano przeciwciało przeciwko H3K36me3 do wyprecypitowania chromatyny pobranej z komórek 2FTGH indukowanych interferonem gamma przez 30 minut, 1,5 godziny i 5 godzin, z zastosowaniem IgG jako kontroli negatywnej. W tych samych punktach czasowych określono również stopień zajętości STAT1 oraz polimerazy RNA II.Zajętość histonów w obrębie locus genu IRF1 określono dla warunków nieindukowanych i indukowanych przy użyciu przeciwciała przeciwko pan-histonowi 3, który służy jednocześnie jako kontrola pozytywna. Spadek w okolicy minus 5 par zasad wynika z ubytku nukleosomów występującego w miejscach startu transkrypcji. Przedstawiliśmy właśnie procedurę immunoprecypitacji chromatyny.Niniejszy test jest przydatny do obserwacji modyfikacji chromatyny występujących podczas aktywnej transkrypcji genów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed rozpoczęciem eksperymentu ChIP opracować z opiekunem procedurę fragmentacji swojej chromatyny. Należy również pamiętać o pobraniu próbek kontrolnych (input).To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chromatynowa immunoprecypitacja (ChIP) do oznaczania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywowanej ekspresji genów w ludzkich komórkach

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Inhibitory acetylotransferaz histonowych (HAT, znane również jako acetylotransferazy lizyny), takie jak CBP/p300, są potencjalnymi terapiami w leczeniu raka. Potrzebne są jednak rygorystyczne metody walidacji tych inhibitorów. Trzy metody walidacji in vitro obejmują testy HAT z rekombinowanymi acetylotransferazami, immunoblotting acetylacji histonów w hodowli komórkowej oraz ChIP-qPCR.

Testy do walidacji inhibitorów acetylotransferazy histonowej

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj technikę ChIP do badania dynamicznych modyfikacji histonów w ludzkich komórkach aktywowanych interferonem gamma. Ta metoda pozwala analizować zmiany w ekspresji genów i wiązanie czynników transkrypcyjnych.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu oznaczenia dynamicznej modyfikacji histonów w aktywowanej ekspresji genów w komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w celu badania dynamicznych modyfikacji histonów w aktywownej ekspresji genów w komórkach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów