Name: Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę hodowli i stymulacji sieci neuronowych na matrycach mikroelektrod (MEA) z użyciem neuronów kory mózgowej szczura. Protokół umożliwia długoterminowe badanie aktywności sieciowej in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować członkom grupy Potter za dostarczenie bezcennych komentarzy na temat protokołu. Praca ta została sfinansowana ze stypendium szkoleniowego w zakresie badań klinicznych od Fundacji Amerykańskiej Akademii Neurologii dla CMH, stypendium z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a>) do JDR (GM08169), grant z NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS054809), Ruth L. Kirschstein National Research Service Award dla JDR (NS060392), grant NSF EFRI (0836017), Coulter Foundation Translational Research Award oraz stypendium badawcze dla JDR (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH nie ma nic do ujawnienia. JDR i SMP są płatnymi konsultantami dla Axion Biosystems. Opłaty za zgłoszenie i opłaty za przetwarzanie wideo dla tego artykułu i filmu zostały łaskawie sponsorowane przez Multi-Channel Systems.

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące hodowli i utrzymania sieci neuronowych na układach mikroelektrod, a także wprowadzenie do rejestrowania i stymulowania sieci neuronowych. Niektóre z najczęstszych problemów podczas nagrywania z MEA zostały również omówione w sekcji Rozwiązywanie problemów z MEA. Od czasu do czasu występują różnice w protokole, jak omówiono w całym tekście, i często zmiany te są wykorzystywane do optymalizacji określonych warunków wymaganych przez niektóre projekty eksperymentalne.
Chociaż prezentowany tutaj system nagrywania i stymulacji składa się z naszego specjalnie zaprojektowanego NeuroRighter15 z przedwzmacniaczem MCS, istnieje wiele innych systemów, które mogą zapewnić interfejs z sieciami neuronowymi. Wybór konkretnej konfiguracji będzie zależał od konkretnych potrzeb eksperymentalnych.
W tym protokole przedstawiono uproszczone przykłady rejestracji i stymulacji, jednak te kultury na MEA mogą być wykorzystane do uzyskania wglądu w złożone pytania dotyczące aktywności synaptycznej i połączeń sieci neuronowych. Jak wspomniano powyżej, trwają prace nad wykorzystaniem tej technologii do badania procesów takich jak plastyczność komórkowa, rozwój, ekscytotoksyczność i neurodegeneracja. 6-10 Na przykład niedawna publikacja z naszego laboratorium wykazała powtarzalne uczenie się ukierunkowane na cel in vitro ze stymulacją w pętli zamkniętej w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na aktualną aktywność sieci neuronalnej3.
Chociaż kultury MEA są często wybredne i delikatne, dzięki swojej prostocie i dostępności (w porównaniu z nienaruszonymi zwierzętami) stanowią potężny model do badania aktywności neuronalnej na poziomie sieci.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Kieszonkowe materiały<ul> <li>Jednorazowy filtr do butelek (150ml, 0,2&#x03BC; m wielkość porów; Nalgene #565-0020)</li> <li>Embrionalny dzień 18 samica szczura w ciąży w czasie</li> <li>Micr&#8211; tablice lektrody (patrz opis w protokole, B1)</li> <li>Micr&#8211; pokrywy matrycy lektrodowej (patrz opis w protokole, B3)</li> <li>Nylonowe sitko komórkowe (40&#x03BC; m, BD Falcon, #352340)</li> <li>Fiolki stożkowe z polipropylenu (sterylne, 15ml)</li> <li>Polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, 35mm i 100x15mm)</li> <li>Końcówki do pipet (sterylne, 20&#x03BC; l, 200&#x03BC; l oraz 1000&#x03BC; l) </li> <li>Pipety serologiczne (5 ml)</li></ul>Sprzęt:<ul> <li>Komora bezpieczeństwa biologicznego/okap z przepływem laminarnym</li> <li>Licznik komórek</li> <li>Wirówka</li> <li>Pojemnik z lodem</li> <li>Nożyczki preparacyjne i kleszcze (sterylizowane)</li> <li>Mikroskop preparacyjny w okapie z przepływem laminarnym</li> <li>Ręczny pipetownik elektryczny </li> <li>Hemacytometr</li> <li>Izofluoran i komora gazowa</li> <li>Mikroskop świetlny</li> <li>Ręczny pipetman (P-20 (20&#x03BC; l), P-200 (200&#x03BC; l), P-1000 (1000&#x03BC; System rejestracji l))</li> <li>MEA (patrz opis w protokole, D1)</li> <li>Gilotyna dla gryzoni</li> <li>inkubator trójgazowy (patrz opis w protokole, B15)</li> <li>Termos z aspiratorem umieszczonym w kapturze</li> <li>Vortex</li> <li>Łaźnia wodna (35-37&#x00B0; C)</li></ul>Roztwory i odczynniki:BSA solution: Zrobić 5% BSA (Sigma A-9418) w buforowanej fosforanowym soli o pH 7,4 i przefiltrować w temperaturze 0,2&#x03BC;m. To rozwiązanie można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w 4&#x00B0; C przez kilka miesięcy.Cell Medium: Kombajn 90 ml Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml końskiej surowicy (Gibco 16050), 1 ml pirogronianu sodu (100mM, Gibco 11360), 250 &#x03BC; l GlutaMAX (Gibco 35050) i insulina (końcowe stężenie 2,5 &#x03BC; g/ml, Sigma I-5500), a następnie przejść przez 0,2 &#x03BC; m filtr.22 Przed użyciem ogrzać i zrównoważyć podłoże komórkowe w inkubatorze. Roztwór separacyjny do przygotowania roztworu papainy:23<table border="1"> <tbody><tr> <td>Roztwór do rozwarstwiania (100ml bulionu)</td> <td>Połącz w kolejności, filtr 0,22 &#x03BC; m i przechowywać w temperaturze 4&#x00B0;C.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>Składnik</td> <td>Objętość ml</td> <td>Stężenie końcowe (mM)</td> </tr> <tr> <td>Woda podwójnie destylowana</td> <td>91.175</td> <td></td> </ tr> <tr> <td>1 M MgCl2</td> <td>0,58</td> <td>5,8 mM</td> </tr> <tr> <td>1 M CaCl2</td> <td>0,025</td> <td>0,25 mM</td> </tr> <tr> <td>0,5 M HEPES</td> <td>0,32</td> <td>1,6 mM</td> </tr> <tr> <td>0,5% Czerwień fenolowa</td> <td>0,2</td> <td>(0,001%)</td> </tr> <tr> <td>0,1 N NaOH</td> <td> 0,2</td> <td>0,2 mM</td> </tr> <tr> <td>2 M Na2SO4</td> <td>4,5</td> <td>90 mM</td> </tr> <tr> <td>1 M K2SO4</td> <td>3,0</td> <td>30 mM</td> </tr> <tr> <td>0,1 M Kwas kynureninowy</td> <td>1,0</td> <td>1 mM</td> </tr> <tr> <td>5 mM APV</td> <td>1,0</td> <td>0,05 mM</td> </tr></tbody></table> To rozwiązanie można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w 4&#x00B0; C przez kilka miesięcy.DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50&#x03BC; l podwielokrotności są błyskawicznie zamrażane i przechowywane w temperaturze -80&#x00B0;C. Podwielokrotność jest rozmrażana w okapie z przepływem laminarnym przed rozpoczęciem procesu dysocjacji komórek. <silny>Hank' s zrównoważony roztwór soli: Sigma (#4891). Roztwór 1X przygotowuje się w wodzie dejonizowanej, sterylnie filtrowanej do 0,2&#x03BC; m i przechowywane w temperaturze 4&#x00B0;C.Hibernate solution: Przygotuj w dniu hodowli. Połącz 98 ml pożywki L-15 (Invitrogen 11415) z 2 ml suplementu B-27 (50X, Invitrogen #17504) i przefiltruj w 0,2 &#x03BC;m.roztwór Lamininy: Przygotować w dniu hodowli. Rozcieńczyć 20&#x03BC; l lamininy (1mg/ml, Sigma L-2020) w 980 &#x03BC; l pożywka komórkowa dla końcowego stężenia 0,02 mg/ml. 20 &#x03BC; l Podwielokrotności lamininy (1 mg / ml) są przechowywane w temperaturze -80&#x00B0; C i rozmrożone tuż przed użyciem. Rozmrażanie powinno odbywać się na blacie stołu, a nie w łaźni wodnej, ponieważ szybkie rozmrażanie może czasami prowadzić do zżelowania lamininy.Papaina roztwór:23 Ogrzać 10 ml roztworu rozwarstwiającego (powyżej) do temperatury 30-32&#x00B0;C. Dodać 200 jednostek papainy (Sigma P-4762) i 1,6 mg L-cysteiny (Sigma C-7880). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą około 14 &#x03BC; l z 0,1 N NaOH. Inkubować przez około 30 minut, aż roztwór się zklaruje, przefiltrować 0,2 #x03BC; m, błyskawiczne zamrożenie ciekłym azotem w 2 ml podwielokrotności w sterylnych stożkowych fiolkach polipropylenowych o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -80°C. Rozmrozić podwielokrotność w temperaturze 35-37°C#x00B0#x00B0; C przed rozpoczęciem protokołu.Roztwór polietylenoiminy (PEI):13 100 &#x03BC; l PEI (50% w/v, Sigma P-3143) rozcieńcza się w 100 ml buforu boranu sodu (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) do końcowego stężenia 0,05% w/v. Sterylny filtr o temperaturze 0,2 &#x03BC;m. Można to przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w 4&#x00B0; C przez miesiące. Sterylna woda dejonizowana: Autoklaw i pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem. Trypsin (0,25% z EDTA, Gibco 25200): 1ml porcje są błyskawicznie zamrażane i przechowywane w temperaturze -80&#x00B0;C. Podwielokrotności są rozmrażane w 35-37&#x00B0; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr></tbody></table>

jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (mea)

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

Przez ostatnie stulecie, wielu neurobiologów na całym świecie poświęciło swoje życie na zrozumienie, jak działają sieci neuronowe i dlaczego przestają działać w różnych chorobach. Badania obejmowały obserwację neuropatologiczną, mikroskopię fluorescencyjną ze znakowaniem genetycznym oraz zapis wewnątrzkomórkowy zarówno w zdysocjowanych neuronach, jak i preparatach warstwowych. W protokole omówiono inną technologię, która polega na hodowaniu zdysocjowanych kultur neuronalnych na matrycach mikroelektrod (zwanych również matrycami wieloelektrodowymi, MEA).
Istnieje wiele zalet korzystania z tego systemu w porównaniu z innymi technologiami. Zdysocjowane kultury neuronalne na MEA zapewniają uproszczony model, w którym aktywnością sieci można manipulować za pomocą sekwencji stymulacji elektrycznej za pomocą wielu elektrod matrycy. Ponieważ sieć jest niewielka, wpływ stymulacji jest ograniczony do obserwowalnych obszarów, co nie ma miejsca w przypadku nienaruszonych preparatów. Komórki rosną w monowarstwie, dzięki czemu zmiany w morfologii są łatwe do monitorowania za pomocą różnych technik obrazowania. Wreszcie, kultury na MEA mogą przetrwać ponad rok in vitro, co usuwa wszelkie wyraźne ograniczenia czasowe związane z innymi technikami hodowli. 1
Nasze laboratorium i inne na całym świecie wykorzystują tę technologię do zadawania ważnych pytań na temat sieci neuronowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie informacji niezbędnych do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i stymulacji elektrycznej kultur na MEA. Sieci in vitro zapewniają środki do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórek, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla, rejestracja i stymulacja sieci neuronowych na układach mikroelektrod. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie odczynników i układów mikroelektrod do hodowli. Drugim etapem procedury jest dysocjacja neuronów korowych z zarodka szczura w 18 dniu.Trzecim krokiem procedury jest umieszczenie neuronów na matrycach mikroelektrod i hodowli przez dwa do trzech tygodni. Ostatnim etapem procedury jest eksperymentowanie z sieciami neuronalnymi poprzez stymulację i rejestrację z matryc mikroelektrod. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują spontaniczną i wywołaną bodźcem aktywność w sieciach neuronalnych za pomocą oprogramowania rejestrującego i stymulującego poprzez skrupulatne hodowlę komórek na matrycach mikroelektrod.Cześć, nazywam się profesor Steve Potter. Jestem dyrektorem Laboratorium Neuroinżynierii na Wydziale Kultury Inżynierii Biomedycznej na Georgia Tech. Wydział ten jest dzielony z Emory University School of Medicine.Nazywam się Chad Hales i jestem doktorem habilitowanym w laboratorium doktora Pottera. Jestem również specjalistą ds. poznawczo-behawioralnych na Wydziale Neurologii w Emory University School of Medicine. Dzisiaj pokażemy Ci, jak hodować i pielęgnować neurony na matrycach wieloelektrodowych.Na przykład te. Używamy ich do badania uczenia się i pamięci in vitro oraz sieciowego przetwarzania informacji. Więc zacznijmy W okapie z przepływem laminarnym zacznij przygotowywać układy wielokanałowe, układ mikroelektrod lub pipetę MEA 100 mikrolitrów polietylenoaminy do środka czystego i sterylnego MEA spoczywającego na 100-milimetrowej szalce Petriego, aby uniknąć uszkodzenia elektrod.Nigdy nie dotykaj ciał stałych powierzchni MEA. Lekko przykryj naczynie sterylną pokrywką wyposażoną w przepuszczającą gaz membranę teflonową i inkubuj w kapturze przez 30 minut. Pokrywa z membraną teflonową zapewnia wymianę gazową przy minimalnym parowaniu i zdolności do hodowli w środowiskach o niższej wilgotności.Niższa wilgotność pozwala na zastosowanie delikatnej elektroniki w inkubatorze i zmniejsza poziom zanieczyszczeń. Odessać PEI, przepłukać MEA trzykrotnie jednym do dwóch mililitrów sterylnej wody dejonizowanej. Pozostaw je do wyschnięcia ze zdjętą pokrywką w kapturze przez co najmniej 30 minut lub do całkowitego wyschnięcia.Zakończ dysocjację neuronów korowych E 18 zgodnie z opisem w części tekstowej niniejszego protokołu. Odcedź komórki po odcedzeniu. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i ostrożnie doprowadź objętość zawiesiny komórek do czterech mililitrów za pomocą pożywki komórkowej.Ułóż 500 mikrolitrów 5% roztworu BSA pod wirówką zawiesinową w zawiesinie komórek w temperaturze 200 g przez sześć minut. Podczas wirowania komórek sprawdź, czy MEA jest całkowicie suchy. Ostrożnie odpipetować 20 mikrolitrów roztworu laminatu do środka MEA.Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza i upewnij się, że wszystkie elektrody są zakryte. Delikatnie umieść teflonową pokrywkę na MEA, aby zapobiec parowaniu lamininy. MEA powinien znajdować się na całkowicie płaskiej powierzchni po umieszczeniu pokrywy.W przeciwnym razie ciśnienie może spowodować pęknięcie szklanego dna tablicy. Inkubuj naczynie w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, 9% tlenu i 65% wilgotności przez 20 minut. Teraz przenieś przędzone komórki do okapu.Na dnie probówki powinna być widoczna osadka komórkowa. Usunąć i zachować supernatant na wypadek niepełnego granulowania. Delikatnie zawiesić granulkę.Policz liczbę komórek w 10 mikrolitrach zawiesiny na hemocytometrze i rozcieńcz zawiesinę do pożądanego stężenia. Zwykle od 1000 do 3000 komórek na mikrolitr z pożywką komórkową. Po zakończeniu inkubacji laminatu matrycy, należy natychmiast odessać kroplę.Odpipetować od 15 do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek na pokrytą laminatem powierzchnię MEA. Przykryj naczynie teflonową pokrywką i umieść w inkubatorze na 30 minut. Pod mikroskopem z kontrastem fazowym sprawdź naczynie, aby upewnić się, że ogniwa przylegają i zakryj wszystkie elektrody.Jeśli pokrycie jest niepełne, dodaj więcej komórek i ponownie inkubuj. Powoli zalej naczynie jednym mililitrem podgrzanego podłoża komórkowego równoważącego. Załóż teflonową pokrywę i umieść naczynie z powrotem w inkubatorze na 24 godziny.Następnego dnia. Pod mikroskopem z kontrastem fazowym sprawdź, czy hodowane komórki są przylegające i czy ilość zanieczyszczeń i śmierć komórek jest ograniczona przy odpowiedniej pielęgnacji i karmieniu. Jak wyjaśniono w załączonym tekście, neurony wyhodowane w ten sposób mogą przetrwać ponad rok.Po dwóch do trzech tygodniach kultury osiągnęły stały stan aktywności i można je nagrać z tego filmu, który teraz zademonstruje nagrywanie za pomocą niestandardowego programu do pisania neuro. Przenieś naczynie ponownie do inkubatora nagrywającego utrzymywanego w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, 9% tlenu i 65% wilgotności. Aby utrzymać idealną temperaturę i pH, przesuwając naczynie, noś je równolegle do podłoża i unikaj szybkich ruchów, które mogą wypchnąć komórki z podłoża.Wyjmij MEA z naczynia i umieść go w systemach wielokanałowych. Nagrywanie wzmacniacza preem, upewniając się, że prawidłowo dopasowałeś uziemienie wewnętrzne do uziemienia wzmacniacza Preem. Przedwzmacniacz znajduje się na urządzeniu do odprowadzania ciepła, jak opisano w załączonym tekście, przedwzmacniacz został przeniesiony z inkubatora.Lepiej pokaż prawidłowe ułożenie naczynia. Użyj chusteczki zwilżonej 70% etanolem, aby wyczyścić styki na obwodzie matrycy. Upewnij się, że MEA jest prawidłowo osadzony niżej i zatrzaśnij pokrywę.W razie potrzeby użyj bawełnianego wacika, aby wyrównać styki matrycy. W neuro writerze wybierz ustawienia odpowiednie dla eksperymentu. Przełącznik nagrywania musi być przestawiony w górę.Aby zapisać dane do pliku, kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie. Ekran spajka będzie teraz pokazywał biegnące ślady aktywności i szumy tła z okazjonalnymi potencjałami czynnościowymi i wybuchami aktywności. Jeśli elektroda emituje zbyt dużo szumów, może to oznaczać, że na przedwzmacniaczu może znajdować się niewspółosiowy pin na pokrywie wzmacniacza, mały kawałek śmieci, kropla medium, zdegradowana powierzchnia elektrody lub zachodząca przezroczysta membrana z pokrywy zakłócająca kontakt.Sprawdź styk i w razie potrzeby wyreguluj bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem. Kliknij zakładkę fali skokowej, aby zmienić widok ekranu na tryb wykrywania impulsów, w którym potencjały czynnościowe są wyświetlane w statycznych oknach o długości trzech milisekund. Aby stymulować sieć neuronalną na MEA, wytrenuj algorytm salpa w zakładce ustawień nagrywania, aby ograniczyć artefakt stymulacji, aktywuj salpa w zakładce ustawień online.Po rozpoczęciu nagrywania kliknij zakładkę STEM, aby ustawić odpowiedni paradygmat stymulacji, aby użyć programu otwartej pętli do stymulacji jednej elektrody i obserwować reakcje w naczyniu. Wybierz odpowiednie ustawienia w sekcji otwartej pętli, a następnie naciśnij start. Wizualizuj odpowiedzi na karcie głównych skoków i na karcie form fal szczytowych.Ten film przedstawia rozwój neuronów i komórek glejowych in vitro w siódmym dniu, gdy rosną i tworzą połączoną sieć na MEA, ponieważ widoczne są mikroelektrody. Jest to wykres rastrowy przedstawiający dwie minuty spontanicznej aktywności sieci neuronowej. Każda kropka reprezentuje potencjał czynnościowy.Dwa wybuchy aktywności są oznaczone niebieskimi strzałkami. Odpowiedź na wiele elektrod jest funkcją łączności sieciowej. Oto wykres rastrowy przedstawiający 16 sekund aktywności wywołanej bodźcem.Czerwone gwiazdki reprezentują bodźce. Czerwone strzałki pokazują pięć bodźców, które skutecznie indukowały wybuchy aktywności synaptycznej na wielu elektrodach. Zdarza się, że bodziec nie powoduje wybuchu.Tutaj, w niebieskiej strzałce, właśnie pokazaliśmy, jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na układach mikroelektrod. Prawdopodobnie najważniejszą rzeczą, o którą należy się martwić, jest zapobieganie zakażeniu kultur i zmniejszenie parowania. Jeśli używasz pokrywek z półprzepuszczalnymi membranami, takich jak ta, są one szczelne i zapobiegają parowaniu i infekcji, a możesz być w stanie hodować kultury przez miesiące, a może nawet ponad rok.Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

how-to-culture-record-stimulate-neuronal-networks-on-micro-electrode

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na mikroelektrodowych taśmach elektrodowych (MEA)

Niezawodna metoda badania lawin neuronalnych, czyli niezależnych od skali czasowo-przestrzennych wybuchów aktywności, które świadczą o dynamice stanu krytycznego w korze mózgu. Lawiny pojawiają się spontanicznie w rozwijających się warstwach powierzchownych hodowli kory, co umożliwia długoterminowe pomiary aktywności przy użyciu planarnych zintegrowanych matryc wieloelektrodowych (MEA) w ściśle kontrolowanych warunkach.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Ten film pokazuje rozwój hodowli neuronów 3D połączonej z planarnym układem mikroelektrod z neuronami hipokampa. Izolowane neurony tworzą sieć 2D w obszarze aktywnym układu mikroelektrod i przylegają do szklanych mikrokulek w wielodołkowej płytce z wkładką membranową. Po przeniesieniu tych pokrytych neuronami mikrokulek do elektrody, organizują się one w połączoną sieć neuronową 3D.

Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Ten film demonstruje rejestrację spontanicznej i zależnej od stymulacji aktywności neuronalnej z hodowli pierwotnych mysich neuronów spiralnych (SGN) na matrycy wieloelektrodowej (MEA). Polega na umyciu i przygotowaniu MEA, rejestrowaniu spontanicznej aktywności neuronalnej i zastosowaniu kontrolowanych bodźców elektrycznych w celu zidentyfikowania aktywności neuronalnej zależnej od stymulacji.

Analiza aktywności neuronalnej w pierwotnych mysich neuronach spiralnych przy użyciu układów wieloelektrodowych

Ten film prezentuje nagrania elektrofizjologiczne z organotypowych kokultur wycinków rdzenia kręgowego, uchwycone za pomocą matrycy wieloelektrodowej lub urządzenia MEA. Nagrania te oceniają regenerację neuronów między warstwami. Zaobserwowana zsynchronizowana aktywność elektryczna potwierdza udaną regenerację neuronów.

Zapisy elektrofizjologiczne do oceny regeneracji neuronów w współhodowanych wycinkach rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

Ten film demonstruje ustanowienie wspólnej kultury neuronów i astrocytów do rejestrowania aktywności sieci neuronalnej. Po ustaleniu wspólnej hodowli neuronów ruchowych i astrocytów na płytce z matrycą wieloelektrodową (MEA), synchroniczna rytmiczna aktywność elektryczna sieci neuronalnej została zarejestrowana zewnątrzkomórkowo za pomocą MEA.

Rejestrowanie aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnej w kokulturze neuron-astrocyt

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Poznaj metodę hodowli i stymulacji sieci neuronowych na matrycach mikroelektrod (MEA) z użyciem neuronów kory mózgowej szczura. Protokół umożliwia długoterminowe badanie aktywności sieciowej in vitro.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Przeglądaj więcej filmów