Name: Wizualizacja transferu wirusa HIV z komórki do komórki przy użyciu fluorescencyjnych klonów wirusa HIV i żywej mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji transferu wirusa HIV między komórkami T przy użyciu fluorescencyjnych klonów wirusa i żywej mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia obserwację transmisji przez synapsy wirusologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejszy przegląd został sfinansowany z grantów National Institutes of Health, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Career Scientist Awards dla B.K.C., a także przez NSF Center for Biophotonics Science and Technology, Cooperative Agreement PHY012099 oraz UCD Health System Research Award dla T.H. UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w publikacji <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al. Science 323: 1743-1747 (2009)</a>.
1. Przegląd
Przenoszenie HIV z komórki na komórkę zostało pierwotnie opisane z wykorzystaniem zakażonych HIV komórek Jurkat jako komórek dawców oraz pierwotnych limfocytów T CD4+ jako komórek biorców 1,2,3. W badaniach tych wirusa wykrywano w utrwalonych komórkach za pomocą barwienia przeciwciałami. Aby śledzić transfer wirusa z komórki na komórkę w żywych komórkach, wykorzystujemy rekombinowany, zakaźny klon molekularny HIV nazwany HIV Gag-iGFP 4. Zawiera on zielone białko fluorescencyjne (GFP) wstawione wewnętrznie do białka Gag pomiędzy domenami MA i CA. Ten klon molekularny HIV zachowuje zakaźność bez potrzeby stosowania wirusa pomocniczego. Cząsteczki wirusa powstałe z tego klonu są stechiometrycznie obciążone zielonym białkiem fluorescencyjnym, co zapewnia silny sygnał fluorescencji do monitorowania składania wirusa i jego transferu między komórkami. Dzięki zastosowaniu w połączeniu z obojętnymi fluorescencyjnymi barwnikami do śledzenia komórek, można odróżnić komórki biorców od wprowadzonych komórek dawców, co pozwala na wizualizację transferu HIV z zakażonej komórki T do niezakażonej komórki T 5. Formowanie synapsy wirologicznej i transfer wirusa z jednej komórki do drugiej można następnie obserwować w żywych komórkach podczas ich hodowli w szczelnej, przepuszczalnej dla gazów komorze obrazującej.
(Dzień 1)
2. Przygotowanie komórek T Jurkat ztransfected HIV Gag-iGFP
<ol>
	<li>Przygotować ludzką linię komórkową limfocytów T CD4+ Jurkat (ATCC, Manassas, VA), utrzymując starannie komórki w stężeniu od 2 x 105 do 8 x 105 komórek/mL w pożywce do hodowli komórek Jurkat (RPMI 1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 jednostek/mL penicyliny oraz 100 μg/mL streptomycyny). Klucz do sukcesu: Hodowanie komórek Jurkat w stężeniach przekraczających 8 x 105 komórek/mL spowoduje obniżenie wydajności transfekcji. 
Uwaga: Transfekcja prowiralnego DNA HIV Gag-iGFP do limfocytów T, opisana poniżej, prowadzi do produkcji zdolnego do replikacji ludzkiego wirusa niedoboru odporności. W związku z tym wszystkie procedury powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolony personel laboratoryjny w certyfikowanych pomieszczeniach do hodowli tkankowej o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ lub 3 (BL2+/BL3). Praca z zakaźnym HIV w placówkach obrazowania musi zostać zatwierdzona przez lokalny instytucjonalny urząd ds. bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Przeprowadzić transfekcję komórek Jurkat plazmidem wirusowym HIV Gag-iGFP, stosując metodę nukleofekcji Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Osadzić 5 x 106 komórek poprzez wirowanie przez 10 min przy 150 x g. Odessać nadsącz i przemyć komórki sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Odwirować komórki i resuspendować osad w 97 μL uprzednio ogrzanego roztworu do nukleofekcji V zawierającego suplement producenta. Dodać trzy μL wolnego od endotoksyn plazmidu HIV Gag-iGFP (1 μg/μL) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszać. Przenieść zawiesinę komórkową do kuwety i przeprowadzić nukleofekcję, korzystając z programu S-18. Natychmiast przenieść komórki do 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki do hodowli Jurkat bez antybiotyków.</li>
	<li>Aby przygotować komórki docelowe CD4+ do synaps wirusologicznych, pozyskujemy ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej z warstwy leukocytarnej (buffy coats), stosując standardowy protokół Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Szwecja). Następnie limfocyty T CD4+ są wyselekcjonowane negatywnie przy użyciu zestawu do izolacji za pomocą kulek magnetycznych (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Mogą one być przechowywane kriogenicznie w ciekłym N2 w alikwotach 5 x 106 komórek/500 μL pożywki do zamrażania (90% płodowej surowicy bydlęcej/10% DMSO). Rozmrożone pierwotne limfocyty T CD4+ hoduje się w RPMI z 10% FBS, uzupełnionym o 10 jednostek/mL IL-2.</li>
</ol>
(Dzień 2)
3. Odzyskiwanie żywych komórek linii Jurkat przetransfekowanych HIV Gag-iGFP oraz barwienie komórek docelowych barwnikami fluorescencyjnymi
<ol>
	<li>Pozostaw komórki Jurkat na noc w celu regeneracji po transfekcji. Następnie usuń zanieczyszczenia komórkowe poprzez wirowanie na gradiencie gęstości Ficoll-Paque. Do dna stożkowej probówki o pojemności 15 mL wlej 1.5 mL Ficoll-Paque. Ostrożnie nałóż na ten materiał gradientowy transfektowane komórki Jurkat w 5 mL objętości pożywki RPMI. Wiruj komórki przy 400 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Ostrożnie pobierz komórki z interfejsu pożywka/Ficoll za pomocą pipety. Przenieś je do nowej stożkowej probówki 15 mL. Rozcieńcz komórki pożywką RPMI do całkowitej objętości 15 mL i wiruj przy 300 x g przez 10 min. Resuspenduj osad w 3 mL pożywki do hodowli komórek Jurkat w dołku 2 cm (płytka 6-dołkowa) i przenieś komórki do inkubatora do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Aby odróżnić komórki docelowe od komórek donora w eksperymentach z transferem komórka-komórka, uprzednio znakujemy komórki docelowe CD4+ barwnikami fluorescencyjnymi. Pierwotne limfocyty T CD4+ są znakowane wieczorem w dniu poprzedzającym użycie. Osiągnęliśmy doskonałe rezultaty, znakując limfocyty T barwnikami CellTracker oraz CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Chociaż stężenie barwnika i czasy inkubacji muszą zostać zoptymalizowane w zależności od konkretnego barwnika i rodzaju użytych komórek, poniżej przedstawiono reprezentatywny protokół. Osadź 4 x 106 pierwotnych limfocytów T CD4+ poprzez wirowanie przy 400 x g przez 10 min. Przemyj komórki 5 mL PBS i resuspenduj w 2 mL PBS. Dodaj CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) do stężenia końcowego 1.5 μM i inkubuj w 37°C przez 20 min. Dodaj 8 mL kompletnej pożywki dla komórek Jurkat i wiruj przy 400 x g przez 10 min. Resuspenduj komórki w 3 mL kompletnej pożywki uzupełnionej o 10 units/mL IL-2 i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych na noc.</li>
</ol>
(Dzień 3)
4. Monitorowanie transferu HIV Gag-iGFP między komórkami za pomocą obrazowania komórek żywych
Rutynowo wykorzystujemy komórki Jurkat przetransfekowane HIV Gag-iGFP 48 godzin po transfekcji. Pomyślnie stosowaliśmy jednak komórki już po 24 godzinach, a także do 72 godzin po transfekcji.
<ol>
	<li>Około 48 godzin po transfekcji komórki Jurkat wykazujące ekspresję HIV Gag-iGFP należy policzyć, przemyć pożywką niezależną od CO2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), a następnie zawiesić w pożywce do obrazowania żywych komórek (pożywka niezależna od CO2, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny, 10 jednostek/mL IL-2) w stężeniu 1-3 x 107 komórek/mL.</li>
	<li>W podobny sposób należy przemyć i zawiesić oznakowane pierwotne limfocyty T CD4+ w pożywce do obrazowania żywych komórek w stężeniu 1-3 x 107 komórek/mL.</li>
	<li>Komórki Jurkat przetransfekowane HIV Gag-iGFP należy zmieszać z pierwotnymi limfocytami T CD4+ w stosunku 1:2 lub 1:3, a następnie przenieść do mikrokomory przepuszczalnej dla gazów, przeznaczonej do hodowli tkankowych (Ibidi, Verona, WI). Na przykład należy zmieszać 20 μL przetransfekowanych HIV Gag-iGFP komórek Jurkat z 40 μL oznakowanych pierwotnych limfocytów T CD4+. Do komory Ibidi należy nanieść 50 μL tej mieszaniny i zamknąć komorę za pomocą korków. Korki należy zabezpieczyć, owijając miejsce styku korka z komorą Ibidi paraflem.</li>
</ol>
5. Uwagi dotyczące platform mikroskopowych: obrazowanie konfokalne z dyskiem obrotowym
Po załadowaniu komory obrazowania Ibidi komórkami, niezwłocznie montujemy urządzenie na odwróconym mikroskopie optycznym (iX71 Olympus, Center Valley, PA). Przenoszenie komory Ibidi do mikroskopu powinno być wykonywane wyłącznie przez przeszkolony personel laboratoryjny (poziom BSL2+), noszący odpowiednią odzież ochronną. Choć w obrazowaniu żywych komórek powszechnie stosuje się kosztowne komory inkubacyjne w celu utrzymania stabilnej temperatury 37°C, w tym przypadku osiągnięto to za pomocą prostego i ekonomicznego grzejnika termostatycznego (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) wraz z termoparą typu T zamontowaną obok próbki w celu zapewnienia właściwej informacji zwrotnej o temperaturze. Stwierdzono, że zastosowanie pożywek niezależnych od CO2 pozwala na utrzymanie wysokiej żywotności komórek przy jednoczesnym uniknięciu stosowania komory z CO2. Aby zabezpieczyć platformę przed wahaniami temperatury w pomieszczeniu oraz zablokować tło świetlne, cały zestaw mikroskop/grzejnik przykrywa się dużą czarną osłoną, tworząc wokół systemu izolowaną kieszeń powietrzną. Znacznie ogranicza to wahania temperatury i związany z nimi dryft próbki, ale wymaga wstępnego podgrzewania przez 30 minut przed zamontowaniem próbki.
6. Pozyskiwanie, transfer danych i przetwarzanie obrazów
Obrazy są rejestrowane przy użyciu obiektywu imersyjnego z olejkiem 60x 1.42 NA (UPlanApo N, Olympus), ponieważ wysoka apertura numeryczna (NA) znacznie poprawia rozdzielczość. W celu utworzenia konfokalnych obrazów 3D skanowanie jest przeprowadzane przez jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem (CSU-10, Yokagawa, Japonia), która jednocześnie wykorzystuje &gt;800 punktów konfokalnych, aby radykalnie zwiększyć szybkość skanowania. Aby uzupełnić tę szybkość, CSU-10 jest sparowany z bardzo czułą kamerą o sprzężonych ładunkach z mnożeniem elektronów (EMCCD, iXon+ 897, Andor Technologies, Irlandia), co umożliwia szybkie obrazowanie przy słabym oświetleniu, redukując jednocześnie fotobleaching i fototoksyczność. Źródłem światła fluorescencyjnego jest wielodługościowy gazowy laser jonowy ArKr (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), w którym pożądana długość fali (488 nm) oraz moc lasera mierzona bezpośrednio przed obiektywem mikroskopu (&lt;1 mW) są wybierane przez akustyczno-optyczny filtr strojony (AOTF, Andor Technologies). Aby dodatkowo ograniczyć fotobleaching i wydłużyć całkowity czas obrazowania, AOTF szybko (mikrosekundy) wyłącza wiązkę lasera za każdym razem, gdy kamera jest nieaktywna (10-20 ms), podczas gdy nowo nabyty obraz jest przesyłany z CCD (ekspozycja 15-30 ms) do komputera. Światło lasera jest wprowadzane do systemu wirującego dysku za pomocą quadbandowego lustra dichroicznego 405/488/568/647 (Semrock, Rochester, NY). Emisja fluorescencji jest filtrowana za pomocą filtra pasmowego 525/50 (Semrock) wewnątrz koła filtrowego (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) zamontowanego pomiędzy kamerą EMCCD a konfokalną jednostką wirującego dysku. Cały sprzęt i proces akwizycji, w tym stolik z osią z (Mad City Labs, Madison, WI), są sterowane przez oprogramowanie Andor iQ v1.8. Aby zmaksymalizować szybkość akwizycji przy stosach obrazów 3D trwających około 1.2-1.9 sekundy, przycinamy obszar rejestracji kamery EMCCD do bezpośredniej okolicy pary komórek. Ponadto, kosztem części informacji w osi z, można zastosować duży krok z w zakresie 0.45-0.75 μm, aby przyspieszyć akwizycję. Obrazowanie w tych warunkach może trwać do 6 godzin – z wykorzystaniem ciągłych segmentów 20-60 minutowych – przy minimalnym fotobleachingu. Łącznie każdy segment danych zajmuje zazwyczaj 5-20 Gb miejsca, ponieważ rejestrowanych jest dziesiątki tysięcy obrazów. Aby ułatwić transport i analizę dużych plików danych, każdy zestaw akwizycyjny musi zostać podzielony i wyeksportowany jako 1 Gb segmenty plików obrazów TIFF za pomocą oprogramowania Andor iQ v1.8. Na tym etapie dostępnych jest wiele doskonałych pakietów oprogramowania do analizy obrazu, takich jak Metamorph, Volocity i ImageJ (zalecamy jego modyfikację Fiji).
W przypadku konieczności śledzenia dwóch markerów fluorescencyjnych, rejestrujemy oba jednocześnie bez spowalniania akwizycji, korzystając z „trybu podzielonego ekranu” (split screen mode). Oba markery są pobudzane jednocześnie przez dwie różne linie lasera ArKr (najczęściej 488 i 568 nm). Bezpośrednio przed kamerą EMCCD umieszczony jest dzielnik obrazu (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK), który rozdziela dwa różne obrazy. Następnie każdy obraz jest niezależnie filtrowany za pomocą filtrów fluorescencyjnych (Semrock) i rzutowany obok siebie na matrycę kamery w tym samym czasie, co tworzy efekt „podzielonego ekranu”. Wymaga to następnie ręcznego przycinania i dopasowania obrazów na etapie późniejszej obróbki obrazu.
7. Uwagi dotyczące przetwarzania obrazów i analizy danych
Analizę obrazów przeprowadzamy zazwyczaj za pomocą oprogramowania Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) na komputerach Macintosh (Apple, Inc). Obrazy z konfokalnej mikroskopii laserowej z dyskiem obrotowym są najpierw korygowane pod kątem intensywności w celu kompensacji fotoblaknięcia, a następnie poddawane dekonwolucji w programie Volocity. Pomiary intensywności oraz śledzenie punktów Gag wykonuje się za pomocą modułu Quantification w programie Volocity. W przypadku zestawów obrazów, w których konieczne jest obliczenie ruchu względem wcześniej uformowanej synapsy, stosowany jest zautomatyzowany algorytm śledzenia, który monitoruje kolbkę synaptyczną przez całą sekwencję. Należy przeprowadzić ręczną inspekcję obszarów zainteresowania (ROI) zdefiniowanych przez oprogramowanie do autotrackingu, aby potwierdzić, że program poprawnie śledził wybrany obiekt. W przypadku obiektów, których kontrast z otoczeniem jest zbyt słaby, śledzenie może być wykonywane ręcznie, klatka po klatce. Pakiet oprogramowania Volocity umożliwia eksport lokalizacji XYZ, objętości oraz zintegrowanego sygnału w obrębie wybranych obiektów. Odległość od synapsy oraz prędkość śledzonego obiektu oblicza się poprzez normalizację ruchów względem centrum kolbki synaptycznej.
8. Reprezentatywne wyniki
W ciągu 10 do 15 minut od zmieszania powinna być możliwa wizualizacja komórek Jurkat wykazujących ekspresję HIV Gag-iGFP przylegających do pierwotnych limfocytów T CD4+. Obrazując te koniugaty, można ocenić ruchy punktów Gag w komórkach zakażonych, a także w komórkach docelowych po utworzeniu synapsy. Można zaobserwować przemieszczanie się punktów Gag-iGFP do komórek docelowych wkrótce po sformowaniu się synaps.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy tutaj prostą metodę wizualizacji transferu HIV z komórki do komórki. Niedawne badania przeprowadzone w naszym laboratorium oraz przez inne zespoły sugerują, że może to być dominujący sposób rozprzestrzeniania się HIV między limfocytami T. Opisana tutaj metoda wykorzystuje rekombinowaną formę HIV, zwaną HIV Gag-iGFP, która posiada genetycznie zakodowany znacznik zielonego białka fluorescencyjnego w podstawowym białku strukturalnym, Gag. Dzięki wysokiemu poziomowi GFP wytwarzanego w każdej cząsteczce wirusa, ten zdolny do replikacji klon HIV umożliwia badaczom śledzenie pojedynczych cząsteczek wirusa w czasie rzeczywistym. Wirus ten powinien być szczególnie użyteczny w badaniach dotyczących montażu i transferu HIV z komórki do komórki.
Przenoszenie HIV poprzez transfer komórka-komórka jest wysoce efektywne. Podczas trzymiastegodzinnej kokultury rutynowo obserwujemy przeniesienie wirusa do 20-30% pierwotnych limfocytów T, co oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Podobną efektywność obserwuje się jakościowo podczas obrazowania żywych komórek. Zainfekowane wirusem limfocyty T zaczynają tworzyć synapsy z niezainfekowanymi pierwotnymi limfocytami T niemal natychmiast po rozpoczęciu kokultury. Co ciekawe, nie wszystkie pierwotne limfocyty T są zdolne do wchodzenia w interakcje z zakażonymi HIV komórkami Jurkat, mimo wymuszonych interakcji za pomocą pęset laserowych (niepublikowane obserwacje, GM). HIV Gag-iGFP bez wątpienia okaże się użyteczny w określaniu subpopulacji limfocytów T najbardziej podatnych na transfer komórka-komórka, zarówno in vitro, jak i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Komórki T Jurkat</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warstwy leukocytarne z krwi pełnej</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Nucleofector oraz roztwór V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestawy EndoFree Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmid HIV Gag-iGFP</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek T CD4+</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwniki Celltracker/CellTrace</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka niezależna od CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komory obrazujące</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Olympus IX-71</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw olejowy PlanApo N 1.42NA 60X</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser jonowy ArKr Innova 70C</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalna jednostka z wirującym dyskiem typu Nipkow CSU-10</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichroiczny dzielnik wiązki Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowy 525/50</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera iXon+ 897 z urządzeniem sprzężonych ładunków z mnożeniem elektronów</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik termostatyczny ASI 400</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja transferu hiv między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów hiv oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Dzięki fuzji zielonego białka fluorescencyjnego z wybranymi białkami, biolodzy zyskali możliwość badania złożonych procesów komórkowych w żywych organizmach przy użyciu wideomikroskopii fluorescencyjnej. Aby śledzić ruchy białka rdzeniowego wirusa niedoboru odporności u ludzi podczas transmisji wirusa z komórki do komórki, oznaczyliśmy białko Gag za pomocą GFP w kontekście zakaźnego klonu molekularnego HIV, nazwanego HIV Gag-iGFP. Badamy ten klon wirusowy przy użyciu konfokalnej mikroskopii wideo. W poniższym zwizualizowanym eksperymencie przeprowadzamy transfekcję ludzkiej linii komórek T za pomocą HIV Gag-iGFP, a jako komórki docelowe dla wirusa wykorzystujemy fluorescencyjnie oznakowane, niezakażone komórki T CD4+. Dzięki zastosowaniu różnych znaczników fluorescencyjnych możemy łatwo śledzić produkcję wirusa oraz jego transport przez struktury międzykomórkowe nazywane synapsami wirologicznymi. Proste komory obrazowania przepuszczalne dla gazów pozwalają nam obserwować synapsy za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek od kilku minut do kilku dni. Podejścia te mogą być wykorzystywane do śledzenia białek wirusowych podczas ich przemieszczania się z jednej komórki do drugiej.

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Poprzez fuzję zielonego białka fluorescencyjnego z wybranymi białkami, biolodzy zyskali możliwość badania złożonych procesów komórkowych w żywych organizmach przy użyciu ...

W niniejszej procedurze wykorzystano obrazowanie żywych komórek do wizualizacji transferu HIV znakowanego GFP przez synapsy wirologiczne pomiędzy ekspresyjnymi dla HIV komórkami T kotów rasy jerk CAT a niezainfekowanymi pierwotnymi limfocytami T. Test transferu z komórki do komórki rozpoczyna się od transfekcji komórek T kotów rasy jerk CAT za pomocą HIV gag IG FP, zakaźnego fluorescencyjnego klonu HIV 1; transfektowane komórki kotów rasy jerk CAT wykazują ekspresję HIV gag IG FP. Następnie miesza się je z niezainfekowanymi pierwotnymi limfocytami T znakowanymi C-M-T-M-R i wprowadza do komory obrazowania, w której można obserwować transfer HIV znakowanego GFP przez synapsę wirologiczną.Otrzymane dane są analizowane przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu w celu ujawnienia szczegółów transferu HIV przez synapsy wirologiczne limfocytów T. Cześć, nazywam się Benjamin Dale i pochodzę z laboratorium Ben Chena w Katedrze Medycyny w Mount Sinai School of Medicine. Nazywam się Greg McNerney z laboratorium dr. Thomasa Husera w NSF Center for Biophotonics w uc Davis Medical Center.A ja jestem Deanna Thompson, również z laboratorium dr. Thomasa Husera. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wizualizacji transferu HIV-1 między komórkami z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek. W tej procedurze komórki Jurkat są transfekowane zakaźnym klonem molekularnym HIV-1; procedura ta jest przeznaczona wyłącznie dla przeszkolonego personelu laboratoryjnego pracującego w certyfikowanych warunkach bezpieczeństwa biologicznego.Protokół przedstawiony w niniejszym materiale może być realizowany w pomieszczeniach do hodowli tkankowych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ lub 3. Praca z zakaźnym HIV w placówkach obrazowych musi zostać zatwierdzona przez lokalny instytucjonalny urząd ds. bezpieczeństwa biologicznego. Komórki jerk cat, wykorzystywane jako komórki donora, należy utrzymywać w stężeniu od 2×10⁵ do 8×10⁵ komórek/ml.W hodowli komórek jerk cat stężenie komórek w medium przekraczające 8 × 10⁵ komórek/ml prowadzi do spadku wydajności transfekcji. Aby rozpocząć procedurę, należy przeprowadzFaucetć transfekcję 5 × 10⁶ komórek jerk cat za pomocą plazmidu wirusowego HIV gag IGFP. Stosując metodę amax nucleofection opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym, należy pozostawić komórki do regeneracji przez noc. Mononuklearne komórki krwi obwodowej są oczyszczane z warstwy leukocytarnej (buffy coat) pełnej krwi ludzkiej metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll.Pierwotne limfocyty T CD4+ są oczyszczane z mononuklearnych komórek krwi obwodowej poprzez selekcję negatywną przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD4+. Limfocyty T CD4+ wyselekcjonowane negatywnie są zbierane z kolumny magnetycznej i hodowane w naszym PMI z 10% FPS, uzupełnionym o 10 units per milliliter rekombinowanej ludzkiej IL-2. Można również podzielić izolowane pierwotne limfocyty T CD4+ na alikwoty i zamrozić je przy użyciu pojemników do mrożenia kriogenicznego. Pojemniki do mrożenia umieszcza się w zamrażarce o temperaturze -70 °C na minimum od trzech do czterech godzin.Następnie komórki przenosi się do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania. Po przeprowadzeniu transfekcji komórek Jurkat oraz izolacji docelowych pierwotnych limfocytów T CD4+, w dniu następującym po transfekcji należy przystąpić do oczyszczania i znakowania komórek. Komórki Jurkat wykazują obecnie ekspresję infekcyjnego fluorescencyjnego konstruktu HIV.Podczas pracy z próbkami zakaźnymi nosimy fartuch laboratoryjny zapinany z przodu oraz dwie pary rękawiczek. Usuń resztki komórkowe z transfektowanych komórek poprzez wirowanie na poduszce z medium o wysokiej gęstości Ficoll. Najpierw odmierz 1,5 ml Ficollu na dno probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Następnie delikatnie nakładamy na materiał gradientowy transfekowane komórki jerk hat w objętości 5 mL naszego medium PMI. Na tym etapie transfekowane komórki jerk hat są zdolne do produkcji zakaźnego HIV. W związku z tym wszystkie końcówki pipet, które miały kontakt z komórkami wykazującymi ekspresję HIV, muszą zostać zdezynfekowane 10% roztworem wybielacza.Przed wyrzuceniem do pojemnika znajdującego się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zakręć probówkę, spryskaj jej zewnętrzną powierzchnię roztworem 70% etanolu i wytrzyj suchą chusteczką Kimwipe; odwiruj komórki przy 400 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Po wirowaniu, za pomocą pipety ostrożnie pobierz komórki z granicy fazy medium i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rozcieńcz komórki w naszym medium PMI do całkowitej objętości 15 ml i odwiruj przy 300 G przez 10 minut.W temperaturze pokojowej zawieszamy osad w trzech mililitrach pożywki hodowlanej z dodatkiem surowicy cielęcej płodowej i przenosimy do dołka o średnicy dwóch centymetrów w płytce sześciodołkowej. Płytkę umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkanek do czasu wykorzystania następnego dnia. Wieczorem tego samego dnia znakujemy pierwotne limfocyty T CD4+ wykorzystywane jako komórki docelowe, aby odróżnić je od komórek donora. Najpierw otrzymujemy osad z 4 × 10⁶ pierwotnych limfocytów T CD4+ poprzez wirowanie przy 400 ×g przez 10 minut.Następnie przemyć komórki pięcioma mililitrami PBS i resuspender w dwóch mililitrach PBS, dodać CellTracker Orange do stężenia końcowego 1,5 µM i inkubować w temperaturze 37 °C przez kilka minut. Po zakończeniu inkubacji dodać osiem mililitrów kompletnego medium chicka i odwirować przy 400 ×g przez 10 minut.Resuspender komórki w trzech mililitrach pełnej pożywki uzupełnionej o 10 jednostek na mililitr IL2 i pozostawić w inkubatorze do hodowli tkanek na noc. Po inkubacji nocnej komórki dawcy i docelowe są gotowe do eksperymentu transferu komórka-komórka. Przed rozpoczęciem eksperymentu transferu komórka-komórka należy przygotować komorę obrazującą, aby zabezpieczyć platformę przed wahaniami temperatury w pomieszczeniu.Aby zablokować światło tła w pomieszczeniu, cały zestaw grzejny mikroskopu zostaje przykryty dużym czarnym pokrowcem, co tworzy wokół systemu izolującą poduszkę powietrzną. W komorze obrazowania utrzymywana jest stabilna temperatura 37 °C przy użyciu grzejnika termostatycznego z termoparą typu T umieszczoną obok próbki w celu sprzężenia zwrotnego temperatury. Przed zamocowaniem próbki należy przeprowadzić wstępne podgrzewanie przez 30 minut.Obrazowanie konfokalne z wirującym dyskiem przy użyciu odwróconego mikroskopu optycznego jest wykorzystywane do tworzenia trójwymiarowych obrazów konfokalnych transferu HIV z komórki do komórki. Cała aparatura i proces akwizycji, w tym sterowanie stołem Z, są kontrolowane przez oprogramowanie IQ wersja 1.8. Skanowanie jest wykonywane przez jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem CS U 10, która jednocześnie wykorzystuje ponad 800 punktów konfokalnych, aby znacznie zwiększyć szybkość skanowania i uzupełnić jego prędkość. CS U 10 jest sparowany z wysoce czułą kamerą CCD z mnożeniem elektronów (electron multiplying charged coupled device), co umożliwia szybkie obrazowanie przy słabym oświetleniu, co redukuje zarówno fotobleakowanie, jak i fototoksyczność.Źródłem światła fluorescencyjnego jest wielodługościowy laser jonowy argonowo-kryptonowy. Do wyboru pożądanych długości fal, które w tym przypadku wynoszą 488 nanometrów i 568 nanometrów, wykorzystuje się akustyczno-optyczny filtr strojący (AOTF), kontrolując jednocześnie ich moc w celu dalszej redukcji fotoblaknięcia i wydłużenia czasu obrazowania. AOTF szybko odcina wiązkę lasera po każdej ekspozycji trwającej od 15 do 30 milisekund, gdy kamera nie przejmuje obrazów, co zapobiega niepotrzebnej ekspozycji podczas przesyłania obrazów z kamery EMCCD do komputera.Światło laserowe jest wprowadzane do systemu z wirującym dyskiem za pomocą czteropasmowego lustra dichroicznego 405/488/561/647. Emisja fluorescencyjna jest rozdzielana według długości fali za pomocą lustra dichroicznego długoprzepustowego 560 nm z rozdzielaczem obrazu. Kanał zielony jest filtrowany za pomocą filtra pasmowego 525/50 nm, a kanał czerwony za pomocą filtra pasmowego 609/54 nm. Oba kanały są rzutowane obok siebie na kamerę E-M-C-C-D.Podczas nagrzewania się komory obrazującej, przygotuj komórki do eksperymentu z transferem międzykomórkowym. Użyj hemocytometru do policzenia komórek ette ekspresyjnych dla HIV gag IGFP. Umieść hemocytometr w szalce Petriego, aby uniknąć bezpośredniej ekspozycji na komórki ekspresyjne dla wirusa.Przemyj komórki pożywką niezależną od dwutlenku węgla i resuspenderuj w pożywce do obrazowania żywych komórek w stężeniu od 1 do 3 × 10⁷ komórek na ml. Zastosowanie pożywki niezależnej od dwutlenku węgla eliminuje konieczność użycia komory inkubacyjnej z CO₂ do obrazowania.Komórki należy policzyć, przemyć i resuspender znakowane pierwotne limfocyty T CD4+, w taki sam sposób jak w przypadku komórek Jurkat. Następnie należy zainicjować transfer międzykomórkowy: zmieszać 20 µL transfekowanych HIV gag IGFP komórek Jurkat z 40 µL znakowanych pierwotnych limfocytów T CD4+ i nanieść 50 µL mieszaniny do przepuszczalnej dla gazów mikrokomory EBD przeznaczonej do hodowli tkankowej. Zamknąć komorę za pomocą korków i zabezpieczyć je, owijając styki korka z komorą EBD parafimem.Przetrzyj komorę obrazowania chusteczką nasączoną 70% ethanol i pozostaw do krótkiego wyschnięcia w dygestorium. Przenoś zamkniętą komorę obrazowania w szczelnym pojemniku, aby uniknąć przypadkowej ekspozycji. Jeśli komora nie zostanie upuszczona podczas transportu, niezwłocznie po załadowaniu komory obrazowania IBD komórkami, zamocuj urządzenie na mikroskopie.Wykonaj obrazy par komórek, używając obiektywu imersyjnego z olejkiem 60 x 1,42 NA, ponieważ wysoka apertura numeryczna znacznie poprawia rozdzielczość, co pozwala zmaksymalizować szybkość akwizycji dla stosów obrazów 3D. Ogranicz obszar rejestracji kamery EM CD do bezpośredniej okolicy pary komórek. Ponadto, zastosowanie dużego kroku Z pomiędzy 0,45 a 0,75 micrometers może również pomóc w przyspieszeniu akwizycji w tych warunkach.Obrazy są rejestrowane w sposób ciągły w odstępach od 20 do 60 minut. Powtarzalne obrazowanie tego samego miejsca próbki może trwać do sześciu godzin przy minimalnym fotobieleniu podczas akwizycji. Każdy segment danych składa się z dziesiątek tysięcy obrazów, które mogą zajmować łącznie od 5 do 20 gigabajtów.Aby ułatwić transport i analizę dużych plików, każdy z nich został podzielony i wyeksportowany jako jednogigabajtowe segmenty plików obrazów TIFF. Do analizy uzyskanych obrazów należy użyć jednego z wielu programów do analizy obrazu. Szczegółowe informacje na temat analizy obrazów, w tym korekcji wybielania intensywności oraz automatycznego i ręcznego śledzenia punktów gag, znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym.W ciągu 10 do 15 minut od wymieszania można zaobserwować obrazowanie komórek Jurkat wykazujących ekspresję HIV gag IGFP przylegających do pierwotnych limfocytów T CD4+. W przypadku tych koniugatów można ocenić ruchy punktów gag w komórkach zainfekowanych, a także w komórkach docelowych. Po utworzeniu synapsy, w czasie od 30 minut do trzech godzin, można zaobserwować przemieszczanie się punktów gag IG FP do komórek docelowych znakowanych barwnikiem Cell Tracker.Właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować przenoszenie HIV z komórki do komórki pomiędzy limfocytami T. Podczas wykonywania tych procedur bardzo ważne jest pamiętanie o przestrzeganiu wszystkich środków ostrożności dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego dwa plus (BSL-2+) lub trzy (BSL-3) podczas pracy z próbkami, które miały kontakt z komórkami wykazującymi ekspresję HIV. Pamiętaj również o stosowaniu dobrze utrzymanych komórek JCA oraz wolnego od endotoksyn DNA, aby zoptymalizować transfekcję.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wizualizacja transferu HIV z komórki na komórkę za pomocą fluorescencyjnych klonów HIV i mikroskopii konfokalnej na żywo

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Źródło: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)W niniejszym materiale wideo zaprezentowano jednoczesną wizualizację DNA, RNA oraz białka kapsydu HIV-1 w zakażonych limfocytach ludzkich z wykorzystaniem hybrydyzacji rozgałęzionego DNA (bDNA) oraz immunofluorescencji, co umożliwia szczegółową analizę etapów replikacji wirusa w poszczególnych...

Multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne kwasów nukleinowych i białek wirusowych w zakażonych limfocytach ludzkich

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Poznaj metodę wizualizacji transferu wirusa HIV między komórkami T przy użyciu fluorescencyjnych klonów wirusa i żywej mikroskopii konfokalnej. Protokół umożliwia obserwację transmisji przez synapsy wirusologiczne.

Wizualizacja transferu wirusa HIV z komórki do komórki przy użyciu fluorescencyjnych klonów wirusa HIV i żywej mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów