Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Niniejsza procedura wykorzystuje obrazowanie żywych komórek do wizualizacji transferu HIV znakowanego GFP przez synapsy wirologiczne pomiędzy wykazującymi ekspresję HIV komórkami T kotów jerk i niezinfekowanymi pierwotnymi komórkami T. Test transferu komórka-komórka rozpoczyna się od transfekcji komórek T kotów jerk HIV gag IG FP, zakaźnego fluorescencyjnego klonu HIV-1, w wyniku czego transfekowane komórki kotów jerk wykazują ekspresję HIV gag IG FP. Następnie miesza się je z niezinfekowanymi pierwotnymi komórkami T znakowanymi C-M-T-M-R i wprowadza do komory obrazującej, w której można obserwować transfer HIV znakowanego GFP przez synapsę wirologiczną.

Uzyskane dane analizuje się przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, aby ujawnić szczegóły transferu HIV przez virologiczne synapsy limfocytów T. Cześć, nazywam się Benjamin Dale i pochodzę z laboratorium Bena Chena z Katedry Medycyny w Mount Sinai School of Medicine. Nazywam się Greg McNerney z laboratorium dr. Thomasa Husera w NSF Center for Biophotonics w uc Davis Medical Center.

A ja jestem Deanną Thompson, również z laboratorium dr. Thomasa Husera. Dzisiaj przedstawimy procedurę wizualizacji transferu HIV-1 między komórkami z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek. W tej procedurze komórki Jurkat są transfekowane zakaźnym klonem molekularnym HIV-1; procedura ta powinna być wykonywana wyłącznie przez przeszkolony personel laboratoryjny pracujący w certyfikowanych warunkach bezpieczeństwa biologicznego.

Protokół przedstawiony w niniejszym materiale może być realizowany w pomieszczeniach do hodowli tkankowej poziomu BSL-2+ lub BSL-3. Praca z zakaźnym wirusem HIV w placówkach obrazowania musi zostać zatwierdzona przez lokalny instytucjonalny urząd ds. bezpieczeństwa biologicznego. Komórki JERK przekraczające linię kotów, wykorzystywane jako komórki donora, należy utrzymywać w stężeniu od 2×10⁵ do 8×10⁵ komórek/ml.

W hodowli komórek Jurkat, stężenie komórek w medium przekraczające 8 × 10⁵ komórek/ml prowadzi do obniżenia wydajności transfekcji. Aby rozpocząć procedurę, należy przetransfekować 5 × 10⁶ komórek Jurkat wirusowym plazmidem HIV gag IGFP. Stosując metodę nukleofekcji Amax zgodnie z opisem w załączonym protokole pisemnym, należy pozostawić komórki do regeneracji przez noc. Mononuklearne komórki krwi obwodowej są oczyszczane z warstwy leukocytarnej (buffy coat) pełnej krwi ludzkiej poprzez wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll.

Pierwotne limfocyty T CD4+ są oczyszczane z mononuklearnych komórek krwi obwodowej metodą selekcji negatywnej przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD4+. Wyselekcjonowane negatywnie limfocyty T CD4+ są zbierane z kolumny magnetycznej i hodowane w naszym PMI z 10% FPS, uzupełnionym o 10 units/mL rekombinowanego ludzkiego IL-2. Izolowane pierwotne limfocyty T CD4+ można również rozdzielić na alykwoy i zamrozić przy użyciu pojemników do mrożenia kriogenicznego. Pojemniki do mrożenia umieszcza się w zamrażarce w temperaturze -70 °C na minimum trzy do czterech godzin.

Następnie komórki przenosi się do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania. Po przeprowadzeniu transfekcji komórek Jurkat oraz izolacji docelowych pierwotnych limfocytów T CD4+, w dniu następującym po transfekcji należy przystąpić do oczyszczania i znakowania komórek. Komórki Jurkat wykazują obecnie ekspresję zakaźnego fluorescencyjnego konstruktu HIV.

Podczas pracy z próbkami zakaźnymi nosimy fartuch laboratoryjny zapinany z przodu oraz dwie pary rękawiczek. Usuń szczątki komórkowe z transfektowanych komórek poprzez wirowanie nad medium o wysokiej gęstości fial high pack. Najpierw odmierz 1,5 milliliters fial pack na dno stożkowatej probówki o pojemności 15 milliliter.

Następnie delikatnie nałóż na materiał gradientowy transfekowane komórki Jurkat w objętości 5 mL medium PMI. Na tym etapie transfekowane komórki Jurkat są zdolne do produkcji zakaźnego HIV. W związku z tym wszystkie końcówki do pipet, które miały kontakt z komórkami ekspresyjnymi HIV, muszą zostać zdezynfekowane 10% roztworem wybielacza.

Przed wyrzuceniem do pojemnika wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, należy zakryć probówkę zakrętką, spryskać jej zewnętrzną powierzchnię roztworem 70% etanolu i wytrzeć suchą chusteczką Kimwipe. Następnie wirować komórki przy 400 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamulcem. Po wirowaniu, za pomocą pipety ostrożnie usunąć komórki z granicy fazy medium i przenieść je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć komórki w naszym medium PMI do całkowitej objętości 15 ml i wirować przy 300 G przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej resuspensujemy osad w trzech mililitrach pożywki kultur Hodgkina i przenosimy do studzienki o średnicy dwóch centymetrów w płytce sześciodołkowej. Płytkę umieszczamy w inkubatorze do hodowli tkankowych do czasu wykorzystania następnego dnia. Wieczorem tego samego dnia znakujemy pierwotne limfocyty T CD4+, które będą służyć jako komórki docelowe, aby odróżnić je od komórek donora. Najpierw otrzymujemy osad z 4 × 10⁶ pierwotnych limfocytów T CD4+ poprzez wirowanie przy 400 G przez 10 minut.

Następnie przemyć komórki 5 mL PBS i resuspenduj w 2 mL PBS, dodaj barwnik Cell Tracker Orange do stężenia końcowego 1,5 µM i inkubuj w temperaturze 37 °C przez kilka minut. Po zakończeniu inkubacji dodaj 8 mL pełnej pożywki chica i odwiruj z prędkością 400 ×g przez 10 minut.

Resuspenduj komórki w trzech mililitrach kompletnego medium uzupełnionego o 10 jednostek na mililitr IL-2 i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowej na noc. Po inkubacji nocnej komórki dawcy i komórki docelowe są gotowe do eksperymentu transferu komórka-komórka. Przed przygotowaniem eksperymentu transferu komórka-komórka przygotuj komorę obrazowania, aby zabezpieczyć platformę przed wahaniami temperatury w pomieszczeniu.

Aby zablokować światło tła w pomieszczeniu, nad całą instalacją grzewczą mikroskopu rozpościera się dużą czarną osłonę, tworząc wokół systemu izolowaną kieszeń powietrzną. W komorze obrazowania utrzymywana jest stabilna temperatura 37 °C przy użyciu grzałki termostatycznej z termoparą typu T umieszczoną obok próbki w celu sprzężenia zwrotnego temperatury. Należy przeprowadzić wstępne podgrzewanie przez 30 minut przed zamocowaniem próbki.

Do tworzenia trójwymiarowych obrazów konfokalnych transferu HIV z komórki do komórki wykorzystuje się obrazowanie konfokalne z dyskiem obrotowym w odwróconym mikroskopie optycznym. Cały sprzęt oraz proces akwizycji, w tym sterowanie stolikiem Z, są kontrolowane przez oprogramowanie IQ w wersji 1.8. Skanowanie jest realizowane przez jednostkę konfokalną z dyskiem obrotowym CS U 10, która wykorzystuje jednocześnie ponad 800 punktów konfokalnych, aby znacznie zwiększyć szybkość skanowania. Jednostka CS U 10 jest sprzężona z wysokoczułą kamerą z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem z mnożeniem elektronów (EMCCD), co umożliwia szybkie obrazowanie przy słabym oświetleniu, ograniczając tym samym fotobleakowanie oraz fototoksyczność.

Źródłem światła fluorescencyjnego jest wielodługościowy laser gazowy jonowy argonowo-kryptonowy. Do wyboru odpowiednich długości fal, które w tym przypadku wynoszą 488 nanometrów i 568 nanometrów, stosuje się optyczny filtr przestrajalny AOTF (akusto-optyczny), który kontroluje również ich moc w celu dalszego ograniczenia fotoblaknięcia oraz wydłużenia czasu obrazowania. AOTF szybko wyłącza laser po każdym 15- do 30-milisekundowym czasie ekspozycji w momentach, gdy kamera nie rejestruje obrazów, co zapobiega niepotrzebnej ekspozycji podczas przesyłania obrazów z kamery EMCCD do komputera.

Światło laserowe jest wprowadzane do systemu z wirującym dyskiem za pomocą czteropasmowego lustra dichroicznego 405 488 568 647; emisja fluorescencyjna jest rozdzielana według długości fali przy użyciu lustra dichroicznego długoprzepustowego 560 nm z rozdzielaczem obrazu. Kanał zielony jest filtrowany za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 525/50 nm, a kanał czerwony za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 609/54 nm. Oba kanały są rzutowane obok siebie na kamerę E-M-C-C-D.

Podczas rozgrzewania się komory obrazowania, przygotuj komórki do eksperymentu z transferem międzykomórkowym. Użyj komory countingowej (hemocytometru), aby zliczyć komórki ette wykazujące ekspresję HIV gag IGFP. Umieść hemocytometr w szalce Petriego, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z komórkami wykazującymi ekspresję wirusa.

Przemyj komórki pożywką niezależną od dwutlenku węgla i resuspenduj w pożywce do obrazowania żywych komórek w stężeniu od 1 do 3 × 10⁷ komórek/ml. Zastosowanie pożywki niezależnej od dwutlenku węgla eliminuje konieczność użycia komory inkubacyjnej z dwutlenkiem węgla do obrazowania.

Następnie należy policzyć, przemyć i resuspendować znakowane pierwotne limfocyty T CD4+, analogicznie jak w przypadku komórek Jurkat. Dalej, aby rozpocząć transfer komórka-komórka, zmieszać 20 µL transfektowanych HIV gag IGFP komórek Jurkat z 40 µL znakowanych pierwotnych limfocytów T CD4+, a następnie nanieść 50 µL do mikrokomory EBD przepuszczającej gazy, przeznaczonej do hodowli tkankowej. Zamknąć komorę za pomocą korków i zabezpieczyć je, owijając miejsce styku korka z komorą EBD parafinią.

Przetrzyj komorę obrazowania chusteczką chemiczną nasączoną 70% etanolem i pozostaw do krótkiego wyschnięcia w dygestorium. Transportuj zamkniętą komorę obrazowania w szczelnym pojemniku, aby uniknąć przypadkowej ekspozycji. W przypadku upuszczenia komory podczas transportu, niezwłocznie po załadowaniu komory obrazowania IBD komórkami, zamontuj urządzenie na mikroskopie.

Wykonaj obrazy par komórek, używając obiektywu immersyjnego olejowego 60 x 1,42 NA, ponieważ wysoka apertura numeryczna znacznie poprawia rozdzielczość, co pozwala zmaksymalizować szybkość akwizycji dla stosów obrazów 3D. Otnij obszar rejestracji kamery EM CD do bezpośredniej okolicy pary komórek. Ponadto, zastosowanie dużego kroku Z w zakresie od 0,45 do 0,75 micrometers może również pomóc w przyspieszeniu akwizycji w tych warunkach.

Obrazy są rejestrowane w sposób ciągły w odstępach od 20 do 60 minut. Powtarzalne obrazowanie tego samego miejsca próbki może trwać do sześciu godzin przy minimalnym fotobleachingu podczas akwizycji. Każdy segment danych składa się z dziesiątek tysięcy obrazów, które mogą zajmować łącznie od 5 do 20 gigabajtów.

Aby ułatwić transport i analizę dużych plików, każdy plik jest dzielony i eksportowany jako segmenty plików obrazów TIFF o rozmiarze jednego gigabajta. Do analizy pozyskanych obrazów należy użyć jednego z kilku programów do analizy obrazu. Szczegółowe informacje na temat analizy obrazów, w tym korekcji wyblaknięcia intensywności oraz automatycznego i ręcznego śledzenia punktów gag, znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym.

W ciągu 10 do 15 minut od zmieszania można zaobserwować komórki HeLa (Jerk cat) wykazujące ekspresję gag IGFP przylegające do pierwotnych limfocytów T CD4+. W tych koniugatach można ocenić ruch punktów gag w komórkach zainfekowanych, a także w komórkach docelowych. Po utworzeniu synapsy, w czasie od 30 minut do trzech godzin, można zaobserwować przemieszczanie się punktów gag IG FP do komórek docelowych oznakowanych barwnikiem CellTracker.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wizualizacji transferu HIV z komórki do komórki pomiędzy limfocytami T. Podczas wykonywania tych procedur bardzo ważne jest przestrzeganie wszystkich środków ostrożności dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego dwa plus lub trzy podczas pracy z próbkami, które miały kontakt z komórkami ekspresyjnymi HIV. Należy również pamiętać o stosowaniu dobrze utrzymanych komórek JCA oraz DNA wolnego od endotoksyn w celu optymalizacji transfekcji.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.