Name: IP-FCM: Immunoprecypitacja wykryta za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Poznaj metodę IP-FCM do badania natywnych interakcji białkowo-białkowych przy użyciu immunoprecypitacji i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia analizę złożonych białkowych bez konieczności inżynierii genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez Eagles Innovation Award (Fraternal Order of Eagles) oraz Mayo Foundation.

**Ten protokół wideo opiera się na powiązanej publikacji 1: High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Adam G. Schrum, Diana Gil, Elaine P. Dopfer, David L. Wiest, Laurence A. Turka, Wolfgang W. A. Schamel, Ed Palmer. Science's STKE 2007 (389): pl2, 5 czerwca 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">Kliknij tutaj, aby przejrzeć tę publikację</a>.
Przed rozpoczęciem należy przygotować następujące wodne roztwory stokowe:
<table>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Bufor sprzęgający MES:</td>
 <td>Przechowywać w 25°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MES, pH 6,0</td>
 <td>50 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>1 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor wygaszający/blokujący/do przechowywania (QBS):</td>
 <td>Przechowywać w 4°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Azydek sodu</td>
 <td>0.02%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS, pH 7,4</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor FCM:</td>
 <td>Przechowywać w temperaturze 4°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris, pH 7,4</td>
 <td>50 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>100 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Azotek sodu</td>
 <td>0.02%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td>
 <td>5%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS, pH 7,4</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Przygotować bezpośrednio przed użyciem:
<table>
<tbody>
 <tr>
 <td>EDAC-MES:</td>
 <td>Rozpuścić proszek EDAC w stężeniu 50 mg/ml w buforze sprzęgającym MES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór digitoniny (2% m/v):</td>
 <td>Rozpuścić proszek digitoniny w dH2O2poprzez podgrzanie do 95°C przez 5 min, a następnie chłodzenie na lodzie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor lizujący:</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris, pH 7,4</td>
 <td>50 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>150 Mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór digitoniny </td>
 <td>1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inhibitory proteaz</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przechowywać w lodzie</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
 
1. Sprzęganie mAb z kuleczkami
<ol>
<li>Wyznaczyć stężenie kulek z zakupionego roztworu zapasowego poprzez rozcieńczenie w PBS i przeliczenie za pomocą komory liczydłowej (hemacytometru). Do liczenia zastosować rozcieńczenie kulek 1:10000.</li>
<li>Pipetować 18 x 106 kulek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
<li>Przemyć kulki 2-3 razy w 0,5 do 1,0 mL buforu sprzęgającego MES, wirując przy 20 000g przez 3 minuty w temperaturze 25°C po każdym przemyciu.</li>
<li>Resuspendować kulki w 50 μL buforu sprzęgającego MES.</li>
<li>Aktywować grupy karboksylowe na kuleczkach poprzez dodanie 20 μL świeżo przygotowanego EDAC-MES.</li>
<li>Mieszać delikatnie przez 15 min w temperaturze 25°C, pipetując roztwór w górę i w dół.</li>
<li>Przemyć aktywowane kulki 2-3 razy w 0,5 do 1,0 mL PBS, wirując przy 20 000g przez 3 minuty w temperaturze 25°C po każdym przemyciu.</li>
<li>Resuspendować aktywowane kulki w 50 μL PBS.</li>
<li>Dodać 50 μL przeciwciała mAb do immunoprecypitacji (IP) (o stężeniu zapasowym 0,2-1,0 mg/mL) do roztworu aktywowanych kulek.</li>
<li>Mieszać przez 3 do 4 godzin w temperaturze 25°C, umieszczając probówkę na wytrząsarce wibracyjnej. Wstrząsać wystarczająco mocno, aby zapobiec osadzaniu się kulek na dnie probówki.</li>
<li>Przemyć kulki sprzężone z przeciwciałami mAb 2-3 razy w 0,5 do 1,0 mL PBS, wirując przy 20 000g przez 3 minuty w temperaturze 25°C po każdym przemyciu.</li>
<li>Resuspendować kulki w 100 μL buforu QBS. Można je przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
<li>Po dokładnym zawieszeniu kulek rozcieńczyć je 1:200-1:10 000 w PBS i przeliczyć za pomocą komory liczydłowej. Stężenie musi być mierzone dla każdej partii preparatywnej, aby można było precyzyjnie kontrolować liczbę kulek użytych w każdym eksperymencie IP lub pull-down.</li>
</ol>
2. Przygotowanie lizatu ponuklearnego i immunoprecypitacja
Metoda lizy oraz optymalne warunki lizy będą zależeć od typu komórek oraz badanych oddziaływań białko-białko. Istnieje wiele protokołów, które można zmodyfikować pod kątem konkretnego zastosowania.
<ol>
<li>Poddać lizie 20 x 106 „małych” komórek, takich jak limfocyty, lub 5 x 106 „dużych” komórek, takich jak makrofagi lub komórki nowotworowe, w 100 μL świeżego buforu do lizy w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL przez 20 min na lodzie. Dostosować objętość lizy w zależności od potrzeb.</li>
<li>Aby usunąć jądra komórkowe i nierozpuszczalne szczątki komórkowe, odwirować lizat przy 20 000g przez 10 min w temperaturze 4°C. Zebrać nadsącz, a osad odrzucić.</li>
<li>Do oczyszczonego lizatu dodać od 0,5 x 105 do 2,5 x 105 kulek sprzężonych z mAb, delikatnie mieszając za pomocą pipety. Minimalna objętość stosowana do przeprowadzenia pojedynczego IP wynosi 5 μL.</li>
<li>Umieścić na pionowym rotatorze na 4 godziny lub przez noc w pomieszczeniu chłodniczym. Ustawić prędkość wystarczającą, aby zapobiec osiadaniu kulek. W przypadku IP o małej objętości dopuszczalne jest, aby ciecz pozostawała na dnie probówki podczas rotacji.</li>
</ol>
3. Detekcja białka wychwyconego na kuleczkach za pomocą przeciwciał koniugowanych z fluorochromem
<ol>
<li>Przemyć koraliki IP dwukrotnie w 0,2 do 1,0 mL lodowatego buforu FCM, wirując z prędkością 20 000g w temperaturze 4°C przez 3 min po każdym przemyciu.</li>
<li>Resuspendować koraliki w 100 μL buforu FCM i rozdzielić po 20 μL do każdej z pięciu lub więcej probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL lub do dołków płytki z dnem w kształcie kominka.</li>
<li>Dodać przeciwciała mAb sprzężone z fluorochromem do próbek. Przeprowadzić barwienie FCM zgodnie z instrukcjami producenta lub zgodnie z empirycznie określonymi stężeniami. Jako punkt wyjścia dodać od 0,2 do 1 μL roztworu przeciwciał zapasowych (o stężeniu 0,2-1,0 mg/mL) na probówkę lub dołek i inkubować przez 40 min na lodzie.</li>
<li>Przemyć probe-owane koraliki w probówkach 1,5-ml dwukrotnie w 1,0 mL lodowatego buforu FCM, wirując z prędkością 20 000g w temperaturze 4°C przez 3 min po każdym przemyciu. Ostrożnie usunąć nadosad po każdym przemyciu, uważając, aby nie naruszyć osadu koralików. W przypadku płytki z dnem w kształcie kominka przemyć dwukrotnie 0,2 mL lodowatego buforu FCM, wirując z prędkością 1000g przez 5 min w temperaturze 4°C po każdym przemyciu. W tym kroku pomocne jest użycie pipety wielokanałowej. Aby usunąć nadosad z koralików w płytce z dnem w kształcie kominka, należy raz „potrząsnąć” płytką, a następnie, trzymając ją w pozycji odwróconej, osuszyć krople z krawędzi dołków. Objętość pozostała w każdym dołku zawierającym koraliki wyniesie około 20 μL.</li>
<li>Resuspendować koraliki w 200 μL buforu FCM na próbkę. Przenieść do oznakowanych probówek FACS. Próbki są teraz gotowe do analizy FCM.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie danych FCM
Kule CML opisane w niniejszym protokole mają średnicę od 3 do 5 μm, co stanowi około połowy średnicy spoczywającego limfocytu mysiego. W związku z tym może być konieczne ręczne zwiększenie wzmocnienia (gain) dla rozproszenia światła w przód (FSC) oraz napięcia dla rozproszenia światła pod kątem (SSC), aby zdarzenia związane z populacją kulek mieściły się w skali. Poszczególne kulki IP powinny tworzyć jedną, ściśle zgrupowaną populację. Ustawienia i bramkowanie należy dostosować tak, aby wykluczyć dublety kulek oraz zanieczyszczenia.
<ol>
<li>Przed analizą kulek lub standardów kuleczkowych należy zdjąć tuleję zabezpieczającą krople, która otacza wlot próbek w niektórych cytometrach. Należy dopuścić do ściekania płynu osłonowego pomiędzy próbkami, co oczyści wlot i zapobiegnie przeniesieniu kulek z jednej próbki do drugiej.</li>
<li>Należy użyć kulek nieznakowanych, jako ujemnej kontroli fluorescencji, oraz kulek kalibracyjnych Rainbow Calibration Particles (RCPs), jako dodatniej kontroli fluorescencji, aby dostosować ustawienia w taki sposób, aby zarówno ujemne, jak i dodatnie ekstrema fluorescencji pojawiały się jednocześnie na osi x w skali logarytmicznej. Zapewnia to, że fluorescencja z próbek eksperymentalnych również znajdzie się w zakresie skali. Należy pamiętać, że RCPs są mniejsze od kulek CML, zatem parametry FSC i SSC, a także położenie bramki, mogą wymagać tymczasowej zmiany dla tej próbki.</li>
<li>Po zakończeniu kalibracji przy użyciu RCPs należy powrócić do ustawień dla kulek nieznakowanych. Jeśli w jednej próbce stosowana jest tylko jedna sonda fluorescencyjna, kompensacja fluorescencji nie jest konieczna. Zazwyczaj badamy kompleksy wielobiałkowe za pomocą pojedynczego przeciwciała mAb sprzężonego z fluorochromem w jednej próbce FCM, a wielu partnerów oddziaływań analizujemy poprzez barwienie równoległych próbek kuleczkowych przeciwciałami mAb specyficznymi dla różnych podjednostek.</li>
<li>Należy pozyskać i zapisać pliki z danymi fluorescencji. Analizę można następnie przeprowadzić za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej, takiego jak CellQuest, FlowJo lub CFlow.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="Histogram cytometrii przepływowej pokazujący fluorescencję PE; piki TCR-β, CD3-ε; analiza markerów powierzchni komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. IP-FCM dla kompleksu multiproteinowego TCR/CD3. Limfocyty T od myszy szczepu BALB/c poddano lizie w 1% digitoninie, a lizat poddano analizie IP-FCM z użyciem kulek anty-CD3ε. Wychwycone kompleksy zawierały znaczne ilości TCR-β (obszar fioletowy) i współasocjowanego CD3-ε (zielony), natomiast poziomy innych białek, takich jak Thy1.2, CD45 lub H-2K(d) (odpowiednio linie brązowa, pomarańczowa i niebieska), były zbliżone do poziomu tła (zdefiniowanego przez sondę z nieistotną immunoglobuliną, linia różowa). Patrz podobne wyniki opublikowane wcześniej1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

Informacje o oddziaływaniach białko-białko są niezwykle istotne dla analizy wielu procesów komórkowych, takich jak transdukcja sygnału, dojrzewanie linii komórkowych, progresja cyklu komórkowego oraz kaskady apoptozy. Metoda IP-FCM zapewnia szybki, ilościowy i czuły sposób badania oddziaływań białek oraz definiowania składników kompleksów multiproteinowych w ich natywnej konformacji. Kulek może być sprzęganych i inkubowanych z lizatami komórkowymi w ciągu jednego dnia, a następnie poddawanych sondowaniu i analizie następnego dnia. Format płytki 96-dołkowej pozwala na jednoczesną analizę dużej liczby próbek, co zapewnia efektywne gromadzenie danych do celów statystycznych lub przesiewowych. Dzięki zastosowaniu fluorescencyjnych standardów kulek można oszacować liczbę białek uchwyconych przez każdą z nich. Do wychwytu i detekcji wymagana jest bardzo mała ilość materiału wyjściowego, dzięki czemu można analizować wielokrotne oddziaływania nawet w przypadku ograniczonych próbek i rzadkich analitów. Chociaż IP-FCM nie wymaga inżynierii genetycznej, znakowania epitopami, denaturacji ani mieszania białek in-vitro w środowisku nie fizjologicznym, może być łączona z tymi i innymi technikami, co czyni ją wartościowym i dostępnym narzędziem z zastosowaniem w wielu systemach biologicznych.
Rozwiązywanie problemów:
Wiele eksperymentów IP-FCM generuje użyteczne dane o oddziaływaniach białek już przy pierwszej próbie. Niemniej jednak optymalizacja IP-FCM może poprawić konjugację przeciwciał z kuleczkami, wychwyt kompleksów białkowych oraz wiązanie sond fluorescencyjnych.
Wydajność koniugacji przeciwciał IP można określić poprzez bezpośrednią analizę sprzęgniętych kulek za pomocą przeciwciała przeciwciał przeciwciałom (anty-immunoglobuliny). Jeśli wydajność ta jest niska, zwiększenie stężenia przeciwciał podczas reakcji sprzęgania może pozwolić na przyłączenie większej liczby przeciwciał IP do każdej kulki. Może to zwiększyć pojemność wiązania partii kulek IP, co skutkuje usprawnionym wychwytywaniem i detekcją analitów. Podczas reakcji sprzęgania nie powinny być obecne inne cząsteczki zawierające grupy aminowe pierwotne (np. Tris, albuminy surowicy bydlęcej), ponieważ mogą one konkurować z mAb o przyłączenie do kulek i prowadzić do niskiego stopnia sprzęgania mAb. Jeśli koniugacja mAb z kulkami okaże się problematyczna z innych powodów, kulki można zamiast tego sprzęgnąć z awidyną/streptawidyną, a następnie niewiązalnie przyłączyć i wykorzystać do immunoprecypitacji przeciwciała biotynilowane.
Mimo prawidłowej konjugacji przeciwciał, początkowe wykrycie fluorescencji związanej z kuleczkami może być niskie. Po pierwsze, samo wychwytywanie kompleksów może być mało efektywne. Ponieważ metoda IP-FCM zależy od stężenia analitów, zwiększenie liczby komórek lizowanych w jednostce objętości lizatu może zwiększyć wychwyt i wykrywalność analitu. Dodatkowo wychwyt można usprawnić poprzez zmniejszenie liczby kuleczek IP inkubowanych z lizatem, co rozkłada wychwycone kompleksy na mniejszą liczbę kuleczek i skutkuje zwiększoną średnią fluorescencją każdej kuleczki podczas analizy. Po drugie, możliwe jest, że dostęp przeciwciała sondy do wychwyconych kompleksów jest sterycznie blokowany przez przeciwciało immunoprecypitujące. W takim przypadku problem można rozwiązać, stosując inne przeciwciała do wychwytu i/lub sondowania.

<table><tbody><tr><td>kuleczki z lateksu polistyrenowego modyfikowanego grupami karboksylowymi (CML) (5mm bez surfaktanta)</td><td>Odczynnik</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>Przechowywać w temperaturze 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Cząsteczki kalibracyjne Rainbow</td><td>Odczynnik</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>Przechowywać w temperaturze 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy (MES)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDAC)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>Przechowywać w temperaturze -20&amp;#x00B0;C w warunkach osuszania.</td></tr><tr><td>Ogólny koktajl inhibitorów proteaz, zawierający AEBSF, Bestatynę, Aprotininę, EDTA, E-64 i Leupeptynę</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>Przygotować 100-krotny roztwór zapasowy w H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20&amp;#x00B0;C. Operować w rękawiczkach.</td></tr><tr><td>Płytki PCR, 96-dołkowe 0,2mL, naturalne, z wysokim kominkiem</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>Do użycia zamiast probówek do mikrowirówki podczas barwienia do FCM</td></tr></tbody></table>

ip-fcm: immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej (IP-FCM) jest wydajną metodą wykrywania i kwantyfikacji oddziaływań białko-białko. Podstawowa zasada wywodzi się z metody sandwich ELISA, w której przechwycony główny analityk może być wykrywany wraz z innymi cząsteczkami fizycznie powiązanymi w obrębie kompleksów wielobiałkowych. Procedura obejmuje kowalencyjne sprzęganie polistyrenowych mikrokulek lateksowych z immunoprecypitującymi przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) specyficznymi dla białka zainteresowania, inkubowanie tych kulek z lizatami komórkowymi, sondowanie przechwyconych kompleksów białkowych za pomocą sond sprzężonych z fluorochromami oraz analizę fluorescencji związanej z kulekami za pomocą cytometrii przepływowej. IP-FCM jest niezwykle czuła, pozwala na analizę białek w ich natywnym (niedenaturowanym) stanie i nadaje się do analizy półilościowej lub ilościowej. Dodatkowymi zaletami IP-FCM jest brak konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub specjalistycznego sprzętu, poza cytometrem przepływowym, a także łatwa adaptacja do zastosowań wysokoprzepustowych.

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Immunoprecypitacja z detekcją metodą cytometrii przepływowej (IP-FCM) jest wydajną metodą wykrywania i kwantyfikowania oddziaływań białko-białko. Podstawowe...

W eksperymentach IP FCM kompleksy białkowe są wychwytywane na kuleczkach w celu identyfikacji i badania różnych białek wchodzących ze sobą w interakcje. W pierwszym kroku przeciwciało immunoprecypitujące, specyficzne dla białka docelowego, jest kowalencyjnie sprzęgane z lateksowymi kuleczkami polistyrenowymi. W drugim kroku kuleczki te są inkubowane z lizatami komórkowymi, co pozwala na związanie specyficznego białka oraz białek oddziałujących z nim z kuleczkami.Kuleczki wraz z wychwyconymi białkami są następnie płukane i inkubowane z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, specyficznymi dla różnych cząsteczek, które mogą być związane z immunoprecypitowanym białkiem. Na koniec kuleczki znakowane fluorescencyjnie są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić, które białka są obecne, a które nie występują w wychwyconych kompleksach. Przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak immunoprecypitacja z następującym po niej western blottingiem, jest zdolność I-P-F-C-M do umożliwienia oceny natywnych oddziaływań białko-białko bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.Metoda I-P-F-C-M może zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu nawet przy bardzo niewielkiej ilości dostępnego do analizy biomateriału, ponieważ można ją przeprowadzić z użyciem małych objętości i niskich stężeń analitów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować następujące roztwory: bufor sprzęgający MES, bufor blokujący i przechowywania po wygaszeniu (ang. quenching blocking storage buffer), w skrócie QBS, oraz bufor do cytometrii przepływowej (FCM). Stężenie lateksowych kulek polistyrenowych modyfikowanych grupami karboksylowymi (kulek CML) należy określić poprzez rozcieńczenie w PBS i policzenie za pomocą cytometru hematologicznego.Po wyznaczeniu stężenia kulek, pipetować 18 × 10⁶ kulek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki dwa do trzech razy w 0,5 do 1 ml buforu sprzęgającego MES, odwirowując przy 20 000 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Powtarzać po każdym przemywaniu podczas wirowania kulek.Przygotuj świeży bufor MES z edc i nac do aktywacji kulek. Po zakończeniu etapów płukania przechowuj bufor w temperaturze pokojowej lub w lodzie. Po ostatnim płukaniu zawieś kulki ponownie w 50 µL buforu sprzęgającego MES.Następnie dodać 20 µL EEC MES do zawiesiny kulek. Aby aktywować grupy karboksylowe na kulek, mieszać delikatnie w temperaturze pokojowej, wykonując ręcznie ciągłe pipetowanie w górę i w dół przez 15 minut. Choć etap ten jest pracochłonny, taka metoda mieszania daje najlepsze rezultaty po zakończeniu procesu.Przemyć aktywowane kuleczki dwa lub trzy razy w 0,5 do 1 ml PBS, wirując przy 20 000 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po każdym przemyciu, a po ostatnim etapie płukania, resuspendować aktywowane kuleczki w 50 µL PBS, aby sprzęgnąć przeciwciało IP z kuleczkami. Dodać 50 µL monoklonalnego przeciwciała IP o stężeniu zapasowym od 0,2 do 1 mg/mL.Należy upewnić się, że w układzie nie znajdują się żadne inne cząsteczki zawierające grupy aminowe niż przeciwciała. Cząsteczki zawierające grupy aminowe, takie jak tris lub albuminy surowicy bydlęcej, konkurują z przeciwciałami o wiązanie z kuleczkami. Zawiesinę kuleczek z przeciwciałami należy mieszać na wytrząsarce wibracyjnej przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej.Wstrząsać wystarczająco, aby zapobiec osiadaniu kulek na dnie probówki. Po związaniu przemyć kuleczki z przeciwciałami dwa do trzech razy w 0,5 do 1 ml PBS, wirując przy 20 000 ×g.Odstawić do sedymentacji grawitacyjnej na trzy minuty w temperaturze pokojowej po każdym płukaniu. Na koniec ponownie zawiesić kuleczki w 100 µL buforu QBS. Połączenie przeciwciał monoklonalnych z kuleczkami CML można sprawdzić, barwiąc kuleczki przeciwciałami przeciwko IgG sprzężonymi z fluorochromem.Po przeprowadzeniu analizy FCM kulki pokryte przeciwciałem monoklonalnym można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ich użycia w eksperymencie IP. Najpierw należy dobrze zawiesić kulki, rozcieńczając je w PBS w stosunku od 1:200 do 1:10 000, a następnie policzyć je za pomocą hematocytometru. Stężenie musi być mierzone dla każdej partii preparatywnej, aby można było precyzyjnie kontrolować liczbę kulek wykorzystywanych w każdym eksperymencie IP.Następnie należy przygotować świeży roztwór digesteru w wodzie o stężeniu 2% masy w objętości. Podgrzewać do 95 °C przez pięć minut, a następnie schłodzić na lodzie.Rozcieńczyć, wprowadzić do świeżo przygotowanego buforu do lizy w stężeniu 1% w/v i przechowywać w lodzie. Określić liczbę komórek do lizy, korzystając z przedstawionej tabeli jako wskazówki. Należy jednak pamiętać, że wymagana liczba komórek zależy od badanego białka i musi zostać określona empirycznie.W tym doświadczeniu wykorzystuje się 30 × 10⁶ komórek z linii komórkowej małego guza limfatycznego. Przenieś wymaganą objętość zawiesiny komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwiruj komórki przy 20 000 ×g.Wiruj przez 30 sekund w temperaturze 4°C i odessaj pożywkę. Dodaj odpowiednią ilość świeżo przygotowanego buforu do lizy DIG do osadu, mieszając delikatnie poprzez pipetowanie w górę i w dół.Następnie pozostawić komórki na 20 minut na lodzie. Należy pamiętać, że w zależności od typu komórek i badanych oddziaływań białko-białko warunki lizy komórkowej mogą się różnić i muszą zostać określone empirycznie, aby uzyskać pełną lizę. Usunąć jądra komórkowe i nierozpuszczalne szczątki komórkowe poprzez odwirowanie lizatu przy 20 000 ×g.Odwiruj przez 10 minut w temperaturze 4°C. Zachowaj supernatant (SNA) i odrzuć osad, aby związać białko docelowe z kuleczkami pokrytymi przeciwciałami. Delikatnie pipetując, dodaj od 50 000 do 250 000 kuleczek sprzężonych z przeciwciałami monoklonalnymi do oczyszzczonego lizatu.Minimalna objętość lizatu używana do pojedynczej immunoprecypitacji (IP) wynosi 5 µL. Umieść oczyszczony lizat z mieszanką kulek na obrotowym kole pionowym na cztery godziny lub na noc w chłodni, ustawiając prędkość wystarczającą do zapobiegania opadaniu kulek na dno; podczas rotacji ciecz może pozostawać na spodzie probówki. Następnie następuje wiązanie białka docelowego z przeciwciałem do IP.Następnie należy przeprowadzić fluorescencyjne znakowanie kompleksu immunologicznego. Kuleczki IP należy przemyć dwukrotnie w 1 ml schłodzonego do temperatury 0°C buforu FCM, wirując przy 20 000 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4°C. Po każdym przemyciu kuleczki należy ponownie zawiesić w 100 µL buforu FCM, a następnie odmierzyć i przenieść 20 µL do każdej z pięciu lub więcej probówek.Probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra lub dołki płytki z okrągłym dnem. Oba rodzaje przedstawiono tutaj. Do próbek należy dodać przeciwciała monoklonalne koniugowane z fluorochromem.Przeprowadź barwienie FCM zgodnie z instrukcjami producenta lub stosując empirycznie określone stężenia jako punkt wyjścia. Dodaj od 0,2 do 1 µL roztworu przeciwciał ze zapasu o stężeniu co najmniej 0,1 mg/mL na probówkę lub do dołka i inkubuj przez 40 minut na lodzie. Przemyj znakowane kuleczki w probówkach 1,5 ml dwukrotnie za pomocą 1 ml lodowatego buforu.Bufor FCM, wirowanie z prędkością 20 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty. Po każdym myciu delikatnie usuń nadsącz, uważając, aby nie zakłócić osadu z kulek.Alternatywnie, w przypadku komina, płytkę dolną należy przemyć dwukrotnie 0,2 milliliters lodowatego buforu FCM, wirując przy 1000 times gravity przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsius. Po każdym płukaniu, po każdym płukaniu. Aby usunąć nadmiar cieczy znad kulek, należy raz stuknąć płytką, a następnie, trzymając ją wciąż do góry dnem, osuszyć krople z krawędzi dołków.Objętość pozostała w każdej studzience zawierającej kuleczki wyniesie około 20 µL. Zawiesić kuleczki w 200 µL buforu FCM na próbkę i przenieść do oznakowanych probówek typu fax. Próbki są teraz gotowe do cytometrii przepływowej lub analizy FCM na cytometrach przepływowych Becton Dickinson.Zdejmij osłonę zabezpieczającą kropelki, która może otaczać wlot próbki lub rurkę ssącą. Pozwól rurce ssącej ociekać pomiędzy próbkami, co zapobiegnie przenoszeniu kulek z jednej próbki do drugiej. Stosowane tutaj kulki CML mają średnicę od 3 do 5 µm, co stanowi w przybliżeniu połowę średnicy spoczywającego limfocytu mysiego.W związku z tym może być konieczne ręczne zwiększenie wzmocnienia amplitudy rozproszenia przedniego (forward scatter amp gain) oraz napięcia rozproszenia bocznego, aby populacja zdarzeń z kulek została zarejestrowana przez cytometr. W tym celu należy użyć kulek nieznakowanych lub pustych. Ustawienia bramkowania są dostosowywane w taki sposób, aby przed odczytem wykluczyć kuleczki, dublety i zanieczyszczenia.Próbki eksperymentalne zapewniają, że fluorescencja będzie mieścić się w odpowiedniej skali. Nieoznakowane kulek służą jako kontrola negatywna fluorescencji, natomiast cząsteczki do kalibracji tęczowej (RCP) mogą być wykorzystane jako kontrola pozytywna fluorescencji. Ponieważ RCP są mniejsze od kulek CML, parametry rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter), a także pozycja bramkowania, mogą wymagać tymczasowej korekty dla tej próbki.Po tych kalibracjach ujemne i dodatnie ekstrema fluorescencji są wizualizowane na osi logarytmicznej. Po zakończeniu kalibracji za pomocą RCP należy powrócić do ustawień dla nieznakowanych kulek w odniesieniu do rozproszenia światła przedniego i bocznego. Dopóki w każdej próbce stosowana jest tylko jedna sonda fluorescencyjna, tak jak w przedstawionym tutaj eksperymencie, kompensacja fluorescencji nie jest konieczna.Następnie należy pozyskać i zapisać pliki z danymi fluorescencji; analiza jest przeprowadzana w dalszej kolejności przy użyciu oprogramowania do cytometrii przepływowej, takiego jak cell Quest lub FlowJo. Poniżej przedstawiono wynik analizy IP FCM limfocytów T myszy w 1%digit toin. Kompleks niebiałkowy TCR CD three został wyizolowany przy użyciu kulek anty-CD three epsilon.Przechwycone kompleksy zawierają znaczne ilości TCR beta oraz stowarzyszony CD three epsilon. Poziomy innych białek, określone przy użyciu nieistotnej sondy immunoglobulinowej lub przeciwciał przeciwko białkom TH 1.2, CD 45 lub H two KD, były bliskie poziomom tła. Przewagą tej techniki nad innymi metodami, takimi jak immunoprecypitacja z następującym po niej western blottingiem, jest możliwość zastosowania I-P-F-C-M do oceny natywnych oddziaływań białko-białko bez konieczności inżynierii genetycznej lub stosowania dużych próbek. I-P-F-C-M może zapewniać wysoki stosunek sygnału do szumu nawet przy bardzo małej ilości dostępnego materiału biologicznego do analizy, ponieważ metoda ta może być wykonywana przy użyciu małych objętości i niskich stężeń analitów.

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

IP-FCM:  Immunoprecypitacja wykryta przez cytometrię przepływową

W tym filmie demonstrujemy technikę opartą na cytometrii przepływowej, aby określić proporcję indukowanych przez cytokiny limfocytów T, komórek CIK, rozwiniętych z hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Rozpoznawanie markerów CD ludzkich komórek zabójczych indukowanych cytokinami za pomocą cytometrii przepływowej

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Ten artykuł opisuje metodę analizy zawartości komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej poprzez izolację komórek odpornościowych z tkanki tłuszczowej i późniejszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej.

Charakterystyka komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej człowieka za pomocą cytometrii przepływowej

Obrazowanie cytometrii przepływowej stanowi idealne podejście do wykrywania morfologicznych i funkcjonalnych zmian komórek na poziomie indywidualnym i populacyjnym. Zakłóconą funkcję endocytarną w prezentacji antygenu lipidowego w ludzkich komórkach dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia wykazano za pomocą połączonego profilowania transkryptomicznego ekspresji genów i morfologicznej demonstracji transportu białek.

Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.

Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę IP-FCM do badania natywnych interakcji białkowo-białkowych przy użyciu immunoprecypitacji i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia analizę złożonych białkowych bez konieczności inżynierii genetycznej.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów