Name: Identyfikacja rozregulowanych genów indukowanych przez herpeswirusa opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj technikę podwójnego oznaczania immunohistochemicznego tkanek mięsaka Kaposiego w celu identyfikacji białek wirusowych i komórkowych. Metoda ta pozwala wykryć czynniki komórkowe zmienione przez KSHV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi E.K. Hildrethowi z Meharry Medical College za rady i recenzję niniejszego manuskryptu. Dziękujemy również Dianie Marver za redakcję tekstu. Praca ta była wspierana przez Meharry Vanderbilt Center for AIDS Research (grant NIH P30 AI054999-05); Center for AIDS Health Disparities Research (grant NIH 5U54 RR019192-05); Meharry Center for Clinical Research (grant NIH P20RR011792) oraz przez grant NIH P01 CA113239. D.J.A. otrzymał częściowe finansowanie z grantów pilotażowych z Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) oraz Meharry Center for Clinical Research (CRC).

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metodologie opisane w niniejszym raporcie mogą być realizowane w różnych warunkach laboratoryjnych. Wymagają one specjalistycznego sprzętu lub dostępu do jednostek wsparcia badawczego (core facilities). Podczas prowadzenia eksperymentów z udziałem zakaźnych patogenów wirusowych, takich jak KSHV, należy zachować odpowiednie środki ostrożności, co może wymagać korzystania z laboratoriów o 3. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3). Pozyskiwanie tkanek musi zostać również zatwierdzone przez odpowiednie instytucjonalne...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Masłczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ suplement bullet kits</td></tr><tr><td>Komórki DMVEC (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z komorą</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne KSHV LANA</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>rozcieńczenie 1:50/IFA</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne przeciw galectinie-3 (kozie)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat Rho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>rozcieńczenie 1:100/IFA</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>Vectashield z DAPI</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat Donkey-anti-goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Substrat do Western blot</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotynowane przeciwciało królicze przeciw kozim</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat AP-Strepawidyna</td><td>Dako</td><td>K 0492 (zestaw)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania RNaz i DNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Fotometr</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka RC 6 Plus</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Coulter Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>System detekcji Real Time PCR MYiQ iCycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny TE 2000S</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem kaposiego (kshv)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Obecnie KS jest najbardziej rozpowszechnionym nowotworem złośliwym związanym z HIV/AIDS w Afryce Południowej, a tym samym na świecie.1,2 Jest on definiowany jako guz angioproliferacyjny komórek śródbłonka naczyniowego i wywołuje rzadkie chłoniaki limfoproliferacyjne komórek B w postaci chłoniaków wysięku opłucnowego (PEL) oraz niektóre formy wieloogniskowej choroby Castlemana.3-5 Tylko 1-5% komórek w zmianach KS aktywnie wspiera lityczną replikację wirusa herpes związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV), czynnika etiologicznego związanego z KS; oczywiste jest zatem, że czynniki komórkowe muszą oddziaływać z czynnikami wirusowymi w procesie onkogenezy i progresji guza.6,7 Identyfikacja nowych determinantów czynników gospodarza, które przyczyniają się do patologii KS, jest niezbędna do opracowania markerów prognostycznych progresji guza i przerzutów, a także do opracowania nowych metod terapeutycznych w leczeniu KS.8 Towarzyszące wideo szczegółowo opisuje metody, których używamy do identyfikacji programów ekspresji genów komórek gospodarza, które uległy zmianie w komórkach śródbłonka mikro naczyniowego skóry (DMVEC) po infekcji KSHV oraz w tkance nowotworowej KS.9 Po zidentyfikowaniu genów o zaburzonej regulacji za pomocą analizy mikromacierzy, zmiany w ekspresji białek są potwierdzane metodą immunoblotingu i podwójnie znakowanej immunofluorescencji. Zmiany w ekspresji transkrypcyjnej genów o zaburzonej regulacji są potwierdzane in vitro za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Walidacja wyników in vitro z wykorzystaniem archiwalnej tkanki nowotworowej KS jest również przeprowadzana za pomocą podwójnie znakowanej immunochimii oraz mikromacierzy tkankowych.8,10 Nasze podejście do identyfikacji genów o zaburzonej regulacji w mikrośrodowisku tkanki nowotworowej KS pozwoli na opracowanie systemów modelowych in vitro, a następnie in vivo w celu odkrycia i oceny potencjalnych nowych środków terapeutycznych do leczenia KS.

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

Obecnie KS jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym związanym z HIV/AIDS w Afryce Południowej, a co za tym idzie, na świecie.1,2 Charakteryzuje się on jako angioproliferacyjny ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie podwójnego znakowania tkanki guza mięsaka Kaposiego za pomocą immunohistochemii w celu wykrycia białek wirusowych i komórek gospodarza. Jest to osiągane poprzez wstępne odsłonięcie antygenów z wykorzystaniem ciepła. Drugim etapem procedury jest zastosowanie przeciwciała pierwszorzędowego sprzężonego z biotyną.Trzecim krokiem procedury jest dodanie koniugatu enzymatycznego strep din. Ostatnim krokiem procedury jest dodanie substratu enzymatycznego do tkanki w celu wywołania zabarwienia. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące lokalizację białek wirusowych oraz białek komórek gospodarza w tkance guza za pomocą barwienia immunohistochemicznego.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patologii, takie jak identyfikacja czynników zakaźnych oraz rozregulowanych genów komórkowych w tej samej próbce. W dygestorium umieść do ośmiu szkiełek z pięciomikronowymi skrawkami utrwalonej w parafinie tkanki w naczyniu Coplan z ksylenem. Inkubuj przez 10 minut, aby odparafinizować preparaty i przygotować je do podwójnego znakowania immunohistochemicznego.Rehydratuj tkankę w serii roztworów etanolu o stężeniach 100%, 95% i 70% przez pięć minut w każdym z nich. Przenieś preparaty do wody na co najmniej 10 minut przed odsłonięciem antygenów, znanym również jako regeneracja antygenów. Zanurz preparaty w plastikowym pojemniku zawierającym świeżo przygotowany roztwór w temperaturze 95 °C.Bufor cytrynianowy 50 mM podgrzać w kuchence mikrofalowej, utrzymując temperaturę wrzenia 95°C przez 15 minut. Bezzwłocznie przenieść preparaty na szkiełka do naczynia coplan wypełnionego wodą destylowaną w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść szkiełka do czystego naczynia coplan wypełnionego świeżo przygotowanym roztworem gaszącym.Inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Przemyto trzy razy w temperaturze pokojowej w 1×PBS przez pięć minut każdego płukania. Wyjęto preparaty z kąpieli w PBS, strzepnięto nadmiar cieczy, a tkankę pokryto 200 µL lodowatego roztworu blokującego i przykryto paskiem parafiny, aby zapobiec wysychaniu.Umieść preparaty na szkiełkach w komorze nawilżonej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Zdejmij pasek parafiny i strząśnij nadmiar roztworu blokującego ze szkiełka, a następnie nałóż od 50 do 100 µL lodowatego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko KSHV Lana, rozcieńczonego w buforze blokującym, aby pokryć tkankę. Przykryj tkankę nowym paskiem parafiny i inkubuj w komorze nawilżonej przez jedną do dwóch godzin.Przemyj preparaty trzy razy w 1x PBS przez pięć minut. Przy każdym płukaniu dodaj od 50 do 100 µL biotynylowanego przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w 1x PBS i inkubuj w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 30 do 45 minut. Podczas inkubacji preparatów przygotuj streptawidynę sprzężoną z peroksydazą.Używając zestawu daco animation duet, dodaj 10 µL roztworu A do 1 mL 1X PBS w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 mL i wymieszaj za pomocą wortexa. Dodaj 10 µL roztworu B, ponownie wymieszaj wortexem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Płucz preparaty na szkiełkach w 1X PBS trzy razy, przez pięć minut podczas każdego płukania.Podobnie jak poprzednio, nanieść na preparaty od 100 do 200 µl koniugatu streptawidyny z peroksydazą chrzanową. Inkubować w temperaturze pokojowej w komorze nawilżonej przez 30 do 45 minut. Ponownie przemyć preparaty trzy razy w 1x PBS, wykonując każde płukanie przez pięć minut.Na pięć minut przed zakończeniem płukania wrzuć jedną tabletkę DAB do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów zawierającej 20 mililitrów 1x PBS oraz 25 mikrolitrów 3% nadtlenku wodoru. Przefiltruj roztwór DAB przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 mikrometra, pracując z jednym preparatem na raz. Przykryj tkankę jednym mililitrem roztworu DAB, korzystając z oświetlenia w polu jasnym mikroskopu świetlnego.Monitoruj rozwój barwy dla KSHV Lana w zainfekowanych komórkach, aż zostanie osiągnięta pożądana intensywność zabarwienia. Zanurz preparaty w wodzie destylowanej na pięć minut, aby zatrzymać reakcję przed podwójnym znakowaniem. Rozpocznij ponownie proces odsłaniania antygenów w buforze cytrynianowym o temperaturze 95 °C, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście, a następnie przeprowadź barwienie.Stosując tę samą procedurę, zamocuj tkankę za pomocą medium montażowego per mount i przykryj szkiełkiem podstawowym, a następnie wykonaj obraz w oświetleniu w polu jasnym. Często zaleca się wysłanie wielu pojedynczych próbek zatopionych w blokach parafinowych w celu wykonania wycinków i ułożenia ich w macierzy tkankowej (TMA) do dalszej analizy statystycznej. Brązowe komórki wykazujące pozytywną reakcję na białko komórkowe pcam one CD 31, wskazane szarą strzałką, skupiają się wokół naczyń krwionośnych.Krwinki czerwone wykazujące pozytywny wynik w kierunku białka wirusowego. Lana zaznaczona czarnymi strzałkami wskazuje komórki zainfekowane wirusem herpes powiązanym z mięsakiem Kaposiego. Przedstawiono tutaj powiększenie mniejsze komórek barwiących się na brązowo, wykazujących pozytywny wynik w kierunku białka komórkowego pcam.CD 31 wskazany szarymi strzałkami w obszarze wokół naczyń krwionośnych. Komórki czerwone wykazujące pozytywny wynik w kierunku białka wirusowego. LANA zaznaczona czarną strzałką wskazuje komórki zainfekowane wirusem herpes powiązanym z mięsakiem Kaposiego.Oto biopsja tkanki nowotworowej KS na mikrotablicy tkanek nowotworowych; brązowe komórki są dodatnie pod kątem białka wirusowego. Lana wskazuje komórki zainfekowane wirusem herpes powiązanym z ziarniakiem Kaposiego, które wykazują tworzenie komórek wrzecionowatych. Oto kolejna biopsja tkanki nowotworowej KS na mikrotablicy tkanek nowotworowych; brązowe komórki są dodatnie pod kątem białka wirusowego.Białko LANA wskazuje komórki zainfekowane wirusem herpes powiązanym z mięsakiem Kaposiego wykazujące wysoki stopień tworzenia komórek wrzecionowatych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przeprowadzania podwójnego barwienia immunohistochemicznego w tkance utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie. Podczas wykonywania tego eksperymentu bardzo ważne jest monitorowanie rozwoju barwy pod mikroskopem oraz przerwanie reakcji w wodzie.

identifying-dysregulated-genes-induced-kaposi-s-sarcoma-associated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Identyfikowanie deregulowanych genów indukowanych przez wirusa sarkoma Kaposiego związanego z wirusem opryszczki (KSHV)

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Fabryki transkrypcji wirusa to odrębne struktury, które są wzbogacone o komórkową polimerazę RNA II w celu zwiększenia transkrypcji genów wirusa podczas reaktywacji. W tym miejscu opisano metodę lokalizacji miejsc aktywnej transkrypcji chromatyny wirusowej w przestrzeni jądrowej 3D poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego i hybrydyzacji RNA in situ.

Obrazowanie funkcjonalne fabryk transkrypcji wirusów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj technikę podwójnego oznaczania immunohistochemicznego tkanek mięsaka Kaposiego w celu identyfikacji białek wirusowych i komórkowych. Metoda ta pozwala wykryć czynniki komórkowe zmienione przez KSHV.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

Przeglądaj więcej filmów