Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie modelu ostrego uszkodzenia nerek u danio pręgowanego z wykorzystaniem glikozydów AMG, konkretnie gentamycyny, jako nefrotoksyny. Jest to realizowane poprzez wstrzyknięcie gentamycyny do wspólnej żyły głównej larw danio pręgowanego w drugim dniu po zapłodnieniu. Drugim krokiem procedury jest ocena fenotypów emus w wstrzykniętych larwach w czwartym dniu po zapłodnieniu.

Trzecim krokiem procedury jest poddanie czterodniowych po zapłodnieniu zarodków danio pręgowanego barwieniu immunohistochemicznemu z użyciem przeciwciała przeciwko nabłonkowi kanalików nerkowych am. Ostatnim etapem procedury jest wykonanie przekrojów larw danio pręgowanego oraz wizualizacja uszkodzonych kanalików wynikających z utraty polaryzacji komórek i zaburzenia struktury kanalików. W rezultacie można uzyskać obrazy wykazujące uszkodzone segmenty kanalików nerkowych za pomocą immunohistochemii z zastosowaniem przeciwciała przeciwko nabłonkowi nerek.

Witajcie, jestem Carala San Cosentino z Laboratorium Neila Hariego w Katedrze Biologii Rozwojowej na Uniwersytecie Pittsburgha. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę mikroiniekcji aminoglikozydu Gentamycyny do larw zebrafish w drugim dniu po zapłodnieniu. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek u larw zebrafish.

Zacznijmy zatem. Rozpocznij od rozmnożenia dorosłych rybek danio trzy noce przed planowanym eksperymentem. Aby określić stadium rozwoju embrionów w drugim dniu po zapłodnieniu, przygotuj medium E3, stosując 5 mM chlorku sodu, 0,17 mM chlorku potasu, 0,33 mM chlorku wapnia oraz 0,33 mM siarczanu magnezu; zbierz embriony i umieść je w czarodziesze Petriego z ogrzaną wodą E3 w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.

Pod koniec pierwszego dnia usuń z szalki Petriego wszystkie martwe embriony. Rozdziel embriony tak, aby w każdej szalce Petriego znajdowało się od 80 do 100 sztuk. Przygotuj szklane igły do iniekcji, wyciągając rurki kapilarne za pomocą wyciągacza elektrod do końcowej średnicy około 10 do 20 mikronów.

Po wyciągnięciu kapilary, umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą linijki zaznacz markerem permanentnym około dziesięciu linii w odstępach jednego milimetra wzdłuż igły. Przechowuj igły w dużej szalce Petriego na rampingach glinianych. Następnie przygotuj pipetę trzymającą metodą wypalania.

Polerowanie końcówki cienkościennej kapilary z borokrzemianowego szkła. Przytrzymaj kapilarę za pomocą długich kleszczy i podgrzej jej końcówkę, umieszczając ją pionowo nad jasnoniebieskim wewnętrznym stożkiem płomienia przez jedną do dwóch sekund. Obracaj kapilarę, aby uzyskać jednorodny stop.

Powtórz tę czynność kilka razy, a następnie sprawdź kapilarę pod mikroskopem z użyciem mikrometru przedmiotowego. Średnica kapilary powinna wynosić od 0,4 do 0,5 milimetra. Po przygotowaniu kapilar i uchwytów napełnij ręczną mikropompę strzykawkową olejem mineralnym, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Włóż uchwyt pipety do manipulatora joystickowego połączonego za pomocą statywu magnetycznego z płytą żelazną. Przygotuj 20 µL mieszaniny do wstrzykiwania nefrotoksyny: 2,4 nL Gentamycyny oraz 17,6 nL dekstranu z żółcią lucyferową w grupie kontrolnej rva.

Gentamycynę zastępuje się roztworem soli fizjologicznej. W pobliżu mikroskopu do iniekcji należy przygotować dwie płytki Petriego o średnicy 30 milimetrów z dwiema mililitrami oleju mineralnego, aby móc nanieść mieszaniny nefrotoksyczne i kontrolne przed iniekcją. Środek znieczulający przygotowuje się poprzez rozpuszczenie 400 miligramów proszku trica w 97,7 mililitrach wody dwukrotnie destylowanej oraz 2,1 mililitrach jednomolarnego roztworu triss, a następnie doprowadzenie do pH siedem.

Przechowywać ten roztwór zapasowy w zamrażarce w ilości 4,2 ml. Aby użyć trica jako środka znieczulającego, rozcieńczyć 4,2 ml roztworu zapasowego trica w 100 ml E3 i pozostawić w temperaturze pokojowej. W celu przygotowania larw do iniekcji pod mikroskopem stereoskopowym, ręcznie usunąć choriony za pomocą precyzyjnej pęsety. Znieczulić larwy danio pręgowanego, przenosząc je do szalki Petriego z trica ogrzanym do temperatury pokojowej.

Larwy danio pręgowanego należy poddać działaniu trica przez co najmniej 15 minut. Przed rozpoczęciem mikroiniekcji należy otworzyć końcówkę igły iniekcyjnej za pomocą żyletki. Żyletkę należy trzymać pod niewielkim kątem, aby stworzyć ścięcie, i odciąć końcówkę w taki sposób, aby uzyskać otwór o średnicy od około 10 do 20 mikronów.

Włącz zasilanie oraz dopływ powietrza do aparatu do mikroiniekcji. Włóż igłę do uchwytu na igły. Napełnij igłę, umieszczając kroplę 10 µL roztworu do iniekcji w wypełnionej olejem płytce Petriego.

Pod mikroskopem włącz manualną pompę piko i delikatnie przemyj końcówkę igły. W kropli ustaw pompę piko w tryb odpowietrzania, aby napełnić igłę. Czynność ta zajmie kilka minut.

Jeśli roztwór przemieszcza się do igły zbyt szybko, oznacza to, że średnica końcówki jest zbyt duża i wstrzykiwania nie będą dokładne. Po napełnieniu igły ustaw pompę pico w tryb hold, aby skalibrować igłę, a następnie przełącz pompę pico w tryb gated. Naciśnij pedał nożny, aby opróżnić igłę i zapisz w sekundach czas, w jakim menisk przemieści się z jednej oznaczenia milimetrowego do kolejnego; powtórz tę czynność trzy razy i podziel średni czas przez 30, co stanowi objętość w nanolitrach odpowiadającą liniowej odległości jednego milimetra, aby uzyskać liczbę milisekund wymaganą do podania jednego nanolitra roztworu.

Ustaw pokrętło zakresu okresu na tę wartość i przełącz przełącznik czasu bramkowania w pozycję timed. W ten sposób pompa perystaltyczna została ustawiona na podanie jednonanolitrowego impulsu roztworu. Następnie umieść płytkę Petriego z larwami pod mikroskopem.

Zgrupuj larwy w centrum szalki Petriego i ustaw ostrość mikroskopu. Umieść pipetę trzymającą w ręcznej mikropompce strzykawkowej po przeciwnej stronie niż mikroinżektor i przesuń jej końcówkę do szalki Petriego, do płaszczyzny ostrości mikroskopu. Zegnij ją pod dość niewielkim kątem, tak aby sam czubek pipety trzymającej dotykał dna szalki Petriego i znajdował się niemal poziomo.

Zwiększ powiększenie mikroskopu i użyj supercienkiej rzęsy z uchwytem. Ustaw larwę danio pręgowanego grzbietem w dół, tak aby worek żółtkowy znajdował się bardzo blisko pipety trzymającej. Obracaj pokrętłem mikrometru sterującego ręczną pompą strzykawkową przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby uchwycić larwę danio pręgowanego poprzez zassanie worek żółtkowy do pipety trzymającej.

Należy uważać, aby nie przekręcić zbyt mocno mikrometru, ponieważ żółtko może pęknąć. Jeśli embrion zostanie wciągnięty zbyt głęboko do pipety trzymającej, należy skupić się na formującej się wspólnej żyle przedniej, która znajduje się nad żółtkiem, tuż pod perydermą, i jest miejscem intensywnego przepływu krwi. Używając mikromanipulatora aparatury do iniekcji.

Wprowadź igłę do rozwijającej się wspólnej żyły głównej. Zazwyczaj po wprowadzeniu konieczne jest lekkie cofnięcie igły, ponieważ wspólna żyła główna znajduje się bardzo powierzchownie. Jeśli jarzmo larwy jest prawidłowo przytrzymywane za pomocą pipety chwytnej, nie będzie się ono obracać podczas wprowadzania igły.

Wstrzyknij jeden nanolitr roztworu, naciskając pedał nożny. Następnie zwolnij larwy z pipety podtrzymującej i przenieś je z powrotem do wody dla larw. Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, monitoruj obecność Lucifer yellow dextran w sercu larw zebrafish.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym barwnik Lucifer yellow pozostaje widoczny w układzie krwionośnym przez około 20 minut, po czym larwy należy przenieść do świeżego medium E3 w czwartym dniu po zapłodnieniu. Umieścić od 10 do 15 larw danio pręgowanego w szklanych fiolkach o pojemności 4 ml i utrwalić je w 1 ml paradoksykalnie (dents) przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Przeprowadzić rehydratację larw w serii roztworów metanolu i PBS (PBT) o stężeniach 25% do 75%, 50% do 50%, 25% do 75% oraz 100% PBT, odpipowując poprzedni roztwór i dodając nowy do tej samej fiolki.

Jeden mililitr roztworu na fiolkę. 20 minut w każdym roztworze. Larwy nie powinny być wystawione na działanie powietrza.

Zawsze pozostawiaj niewielką ilość roztworu zakrywającą larwy. Podczas wymiany roztworów usuń PBT i zastąp go jednym mililitrem roztworu blokującego PBS z 1%DMSO 0,5% między 20 10% normalną surowicą kozią przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze. Przenieś larwy do dwóch mililitrów eph.

Usunąć serum blokujące i zastąpić je 300 µL przeciwciała pierwszorzędowego. Przeciwciało monoklonalne przeciwko sodowo-potasowej ATPazie na poziomie rozcieńczenia 1:25 (nadnadczyn supernatant alpha 6 F) oraz 300 µL roztworu inkubacyjnego PBS z 1% DMSO, 0,5% Tween 20 i 2% normalnego surowicy koziej, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć trzy razy, po 30 minut za każdym razem, używając 1 mL roztworu inkubacyjnego w temperaturze pokojowej, umieszczając próbkę na rotatorze podczas każdego płukania.

Następnie inkubuj z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym 1:500 w roztworze inkubacyjnym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po tym czasie przemyj trzy razy, po 30 minut każdorazowo, za pomocą PBT, a następnie odwodnij larwy, stosując serię roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, mocząc przez 10 minut na każdym etapie. Przygotuj roztwór do infiltracji, używając 25 ml roztworu do zatapiania JB-4 A oraz 0,24 g katalizatora, rozpuszczając przez 20 do 30 minut. Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca.

Usunąć 100% etanol i zastąpić go roztworem do infiltracji plastikiem. Umieścić probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze i pozwolić na przebieg infiltracji przez około 30 minut, aż larwy opadną na dno probówki. Aby zatopić larwy w bloku, umieścić tacę z foremkami do odlewów plastikowych pod mikroskopem stereoskopowym.

Przenieś larwy wraz z odpowiednią ilością roztworu infiltracyjnego, aby całkowicie je przykryć, do pojemników. Plastikowe medium do zatapiania przygotowuje się w małej plastikowej probówce. Zazwyczaj zatapiamy od czterech do pięciu larw jednocześnie, wykorzystując jedną larwę na każdy pojemnik, i przygotowujemy pięć mililitrów plastiku do zatapiania.

Do każdego mililitra roztworu infiltracyjnego dodać 35 µL żywicy JB-4, roztwór zatapiający B. Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół za pomocą plastikowej pipety Pasteur lub zwykłej pipety kilka razy, aby zapewnić prawidłową polimeryzację JB-4. Po przygotowaniu 5 mL żywicy do zatapiania, usunąć plastik infiltracyjny z okrągłych próbek za pomocą pipety Pasteura. Wypełnić foremkę żywicą do zatapiania; plastik musi wypłynąć poza krawędź foremki, aby zapewnić dobre przyleganie uchwytu bloku do preparatu.

W celu wykrycia kanalików nerkowych u danio pręgowanego najlepsze są przekroje poprzeczne. Larwy muszą zostać zatopione w bloku pionowo, głową w dół, przy pomocy rzęsówki z uchwytem lub precyzyjnej pęsety.

Okresowo ustawiaj larwy w pozycji pionowej, aż plastik stwardnieje na tyle, aby nie przesuwały się one ze swojego miejsca. Trwa to około 20 do 30 minut. Następnie umieść dwublokowy uchwyt EVH nad kubkami i pozostaw tackę w temperaturze czterech stopni Celsius overnight do czasu zakończenia polimeryzacji.

Umieść preparat w uchwycie mikrotomu i ustaw ogrzewacz do szkiełek na 45 °C. Nalej wodę dejonizowaną do zlewki i ustaw ją w pobliżu mikrotomu przed rozpoczęciem krojenia. Upewnij się, że blok jest zorientowany w taki sposób, aby uzyskać idealne przekroje poprzeczne larw.

Dźwignie regulacyjne głowicy orientującej można obracać i ustawiać podświetlenie, aby odpowiednio spozycjonować preparat. Wyciąć grube skrawki przez głowę. Zorientować bloki w taki sposób, aby dla każdej larwy pobrano równoważne skrawki oczu.

W momencie pojawienia się płetw piersiowych w przekrojach rozpoczynają się cewki pronafalne. Od tego punktu należy wykonać około 32 serii przekrojów o grubości 4 mikronów z bloków. Przekroje należy zbierać pęsetą i pozwalać im opadać do zlewki z wodą, nie dotykając pęsetą powierzchni wody.

Przekrój rozszerzy się natychmiast po zetknięciu z powierzchnią wody. Teraz można go zebrać na szkiełko. Włóż szkiełko do wody pod kątem 45 stopni i zbliż się do przekroju za pomocą pędzelka z rączką, dotykając jedynie krawędzi przekroju; inkubuj szkiełka w suszarce do szkiełek aż do całkowitego wyschnięcia, a następnie wykonaj obrazowanie przekrojów za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.

Przy prawidłowym wykonaniu wstrzyknięta larwa wygląda tak, jak pokazano na górnym obrazie, z fluorescencyjnym lucyferazy żółtym dekstranem w układzie naczyniowym larwy. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt głębokie, jak na dolnym obrazie, wstrzyknięty materiał może być widoczny w worku żółtkowym lub może dojść do przebicia serca, co powoduje nadmierny krwotok. Larwy rozwinęły obrzęk osierdzia w następstwie nefrotoksyczności gentamycyny, co widać tutaj.

Larwy kontrolne u góry nie wykazują obrzęku osierdzia. Jednakże, po wstrzyknięciu gentamycyny, 80% larw zebrafish wykazuje obrzęk umiarkowany lub ciężki, na co wskazują strzałki na panelach środkowym i dolnym. Stosujemy system klasyfikacji oparty na fenotypie, w którym larwy z obrzękiem umiarkowanym wykazują wyraźny obrzęk osierdzia, ale nie wykazują żadnych innych obserwowalnych fenotypów.

Podczas gdy u larw z ciężkim obrzękiem widoczne są obrzęki osierdzia i tułowia, brak krążenia w tułowiu oraz od lekkiego do umiarkowanego wygięcia osi podłużnej przy użyciu przeciwciała do cewek nerkowych przeciwko sodowo-potasowej ATPazie. Uszkodzone cewki są widoczne w przekrojach poprzecznych, przy czym w panelach C i D widoczna jest wyraźna utrata polaryzacji komórek, a w panelach A i B rozpad cewek w naczyniach uszkodzonych w porównaniu z grupą kontrolną. Wzorzec ten pozostaje spójny w wielu przekrojach poprzecznych podczas porównywania sekcji. Płetwy i proksymalne cewki kręte służą jako markery anatomiczne.

Właśnie pokazaliśmy, jak indukować ostre uszkodzenie nerek u larw zebrafish. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o użyciu igieł do iniekcji o średnicy 10 20 micrometers. Może być konieczne wypolerowanie płomieniem kilku pipet trzymających, aby uzyskać odpowiedni rozmiar, ale po uzyskaniu właściwej pipety można jej używać wielokrotnie, ponieważ może ona wystarczyć na kilka sesji iniekcji.

Należy również upewnić się, że w aparaturze micro series JA nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ mogłoby to pogorszyć pozycjonowanie układu. Na koniec, podczas zatapiania, należy ustawić rybę pionowo, aby uzyskać idealny przekrój poprzeczny kanalików nerkowych. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.