Name: Protokół in situ dla skrzydeł poczwarki motyla przy użyciu rybosond (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Naucz się in situ z rybosondami do analizy ekspresji genów w skrzydłach poczwarki Bicyclus anynana. Ten protokół umożliwia badanie czasowych wzorców mRNA w rozwoju motyli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed oraz wsparciu technicznemu firmy Roche za pomoc w rozwiązywaniu problemów z tym protokołem. Dziękujemy również Williamowi Pielowi za wskazówki dotyczące montażu filmu.

DZIEŃ 1
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory: 
<ul>
<li>10x PBS </li>
<li>1x PBS </li>
<li>1x PBT </li>
<li>ddH2O
<ul>
<li>Dodać DEPC do całkowitej objętości w stężeniu 0,1% i energicznie wstrząsnąć roztworami.&nbsp; </li>
<li>Autoklawować. </li>
</ul>
</li>
<li>4% Paraformaldehyd do fiksacji - w PBS-DEPC </li>
<li>Roztwór Proteinazy K - w przypadku wystąpienia osadu, energicznie wymieszać w vortexie przed pobraniem alikwoty </li>
<li>Bufor zatrzymujący trawienie (Digestion Stop Buffer) </li>
<li>Bufor do prehybrydyzacji </li>
<li>Mieszanina 50:50 PBT:Bufor do prehybrydyzacji </li>
<li>Bufor do hybrydyzacji 
<ul>
<li>Roztwory powinny być wolne od RNaz. Należy używać szkła wypalanego (4 godziny w 250°C) lub jednorazowego plastiku. Pipety serologiczne są bardzo przydatne przy przygotowywaniu roztworów </li>
</ul>
</li>
</ul>
</li>
<li>Wypreparować skrzydła z poczwarek o określonym wieku w PBS</li>
<li>Przenieść skrzydła bezpośrednio do buforu do fiksacji w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej w temperaturze pokojowej</li>
<li>Fiksować krążki przez 2 godziny </li>
<li>Przemyć 5 x 5 minut w PBT</li>
<li>Inkubować skrzydła przez 3 minuty w roztworze Proteinazy K</li>
<li>Opłukać 2 x w buforze zatrzymującym trawienie</li>
<li>Przemyć 5 x 5 minut w PBT</li>
<li>Przemyć 2 x 5 minut w mieszaninie 50:50 PBT : PHB </li>
<li>Przemyć 1 x 10 minut w PHB</li>
<li>Inkubować w PHB przez co najmniej 1 godzinę w 55°C.</li>
<li>Denaturować termicznie sondę RNA (wymagane 20-50ng na dołek) (80°C przez 5 minut) i dodać do buforu do hybrydyzacji (wymagane 100 μl na dołek)</li>
<li>Dodać sondę do dołków i inkubować przez 48 godzin w 55°C&nbsp; </li>
</ol>
DZIEŃ 3
<ol>
<li>Przemyć 4 x 5 minut w buforze PHB w temperaturze 55°C</li>
<li>Inkubować przez noc w buforze PHB w temperaturze 55°C</li>
</ol>
DZIEŃ 4
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory: 
<ul>
<li>bufor blokujący przeciwciała</li>
</ul>
</li>
<li>Przepłukać 1 x 5 minut w mieszaninie PBT : PHB w stosunku 50:50</li>
<li>Przepłukać 4 x 5 minut w PBT</li>
<li>Inkubować skrzydła przez 1 godzinę w buforze blokującym w temperaturze 4°C</li>
<li>Inkubować skrzydła przez noc w temperaturze 4°C w roztworze przeciwciał anty-Dig w rozcieńczeniu 1:2000</li>
</ol>
DZIEŃ 5
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory: 
<ul>
<li>Bufor detekcyjny</li>
</ul>
<ul>
<li>Roztwór wywołujący – światłoczuły (owinąć folią)</li>
</ul>
</li>
<li>Przemyć 3 x 5 minut w PBT w temperaturze pokojowej</li>
<li>Przemyć 7 x 5 minut w PBT</li>
<li>Opłukać skrzydła dwukrotnie w buforze detekcyjnym</li>
<li>Wywołać skrzydła w 1 ml roztworu wywołującego – czas wywoływania musi być monitorowany przy każdym badaniu – czas wywoływania może ulec zmianie nawet przy użyciu tych samych sond i roztworu wywołującego – zazwyczaj należy sprawdzać po 5-10 minutach, a następnie wydłużać odstępy aż do inkubacji przez noc. Płytkę należy owinąć folią, aby zapobiec ekspozycji na światło w czasie, gdy próbki nie są sprawdzane.</li>
<li>Opłukać pięciokrotnie w buforze zatrzymującym wywoływanie</li>
<li>Zamontować skrzydła.</li>
</ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

Optymalizacja istniejących protokołów

Hybrydyzacje in situ na tarczach skrzydeł larwalnych zostały pomyślnie przeprowadzone z wykorzystaniem tarcz motyli Precis coenia (Carroll et al. 1994; Keys et al. 1999; Weatherbee et al. 1999). Niniejszy protokół został dostosowany z szczegółowego protokołu pisemnego dotyczącego barwienia skrzydeł larwalnych, dostępnego na prośbę z laboratorium Carrolla. Wprowadzone przez nas zmiany mają na celu uwzględnienie różnic między tkankami skrzydeł w stadium l...

<table><tbody><tr><td>Bufor utrwalający</td><td></td><td></td><td></td><td>4% Paraformaldehyd w PBS</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>0,1% Tween 20 w PBS</td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K</td><td></td><td></td><td></td><td>2,5&amp;#109;g/ml Proteinase K w PBT</td></tr><tr><td>Bufor zatrzymujący trawienie</td><td></td><td></td><td></td><td>2 mg/ml glicyny w PBT</td></tr><tr><td>Bufor przedhybrydyzacyjny</td><td></td><td></td><td></td><td>Na 50 ml PHB: 12 ml wody traktowanej DEPC + 25 ml formamidu + 12,5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml DNA nasienia łososia (wolny od RNaz, denaturowany termicznie przed dodaniem do roztworu).</td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny</td><td></td><td></td><td></td><td>Do buforu przedhybrydyzacyjnego dodać 1 mg/ml glikogenu</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-DIG</td><td>Ab</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>sprzężone z fosfatazą alkaliczną</td></tr><tr><td>Zestaw buforów do przemywania i blokowania DIG</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>Medium montażowe</td></tr></tbody></table>

protokół hybrydyzacji in situ dla skrzydeł poczwarki motyla z użyciem rybop sond

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

W niniejszym materiale wideo przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ w skrzydłach poczwarki motyla Bicyclus anynana z wykorzystaniem ryboprobn. Hybrydyzacje in situ, stanowiące fundament biologii rozwoju, są przydatne do badania przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji genów w rozwijających się tkankach na poziomie transkrypcji. Metodę in situ można zastosować w sytuacjach, gdy nie opracowano jeszcze przeciwciał skierowanych przeciwko produktom białkowym transkrypcji genu i/lub gdy w genomie występuje wiele kopii genu kodującego dane białko, których nie można rozróżnić za pomocą dostępnych przeciwciał. Choć technika in situ dla larwalnych krążków skrzydeł jest dostępna dla badaczy motyli od kilku lat, niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem większych i bardziej delikatnych skrzydeł poczwarki.

W celu zbadania ekspresji genów w tkance skrzydeł poczwarki Bicyclus anynana przedstawiamy zoptymalizowany protokół hybrydyzacji in situ z wykorzystaniem ryboprobes. Dostarczamy również wytyczne dotyczące dalszej optymalizacji tego protokołu w celu zastosowania go w skrzydłach poczwarek innych gatunków Lepidoptera.

Protokół hybrydyzacji in situ dla skrzydeł poczwarki motyla z użyciem rybop sond

W niniejszym materiale wideo przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ w skrzydłach poczwarki motyla Bicyclus anynana z wykorzystaniem ryboprobek. Hybrydyzacja in situ...

Jest to protokół ceto dla skrzydeł motyla w stadium poczwarki. Rozpoczynamy od zebrania przedpoczwarek z klatki, umieszczenia ich na tacy, a następnie fotografowania dokładnych momentów przejścia w stadium poczwarki za pomocą fotografii poklatkowej. Pozwala to na przeprowadzenie barwień w precyzyjnie określonych odstępach czasu po wystąpieniu poczwarkowania.Jest to istotne, ponieważ różne mRNA dla różnych białek są ekspresjonowane w różnych odstępach czasu po zapłodnieniu. Tutaj preparujemy skrzydła poczwarki w szalce Petriego z silikonową podstawą; kluczowe jest usunięcie skrzydeł i umieszczenie ich w roztworze utrwalającym w taki sposób, aby były całkowicie płaskie. Jeśli na tym etapie nie będą płaskie, nigdy więcej nie uda się ich wyprostować.Po odpowiednim czasie utrwalania usuwamy bufor utrwalający i płuczemy pięciokrotnie. W przypadku PBT etap z proteinazą K jest dość krytyczny i służy do permeabilizacji tkanek w celu umożliwienia wniknięcia sondy, dlatego należy go zatrzymać w odpowiednim momencie za pomocą tych płukań i myć. DNA z nasienia łososia służy jako tanie źródło DNA zapobiegające nieswoistemu wiązaniu się sondy.Plemniki są jednym ze składników buforu do prehybrydyzacji. W tym kroku dodajemy plemniki do buforu do prehybrydyzacji, w wyniku czego powstaje roztwór 50/50 PBT-PHB, składający się w połowie z PBT i w połowie z buforu do prehybrydyzacji. Roztwór ten służy jako roztwór pośredni, aby łagodnie przenieść skrzydła z roztworu PBT, w którym były namaczane, do roztworu do prehybrydyzacji.Istnieje zatem etap pośredni, w którym skrzydła będą początkowo znajdować się w tym roztworze 50:50. Tutaj skrzydła są inkubowane w PHP przez 10 minut, a następnie ponownie w PHP przez jedną godzinę w temperaturze 55°C. W międzyczasie przygotujemy bufor do hybrydyzacji, który jest po prostu buforem do prehybrydyzacji zmieszanym z glikogenem.W tym kroku dodajemy glikogen do PHV, aby przygotować niewielką ilość buforu do hybrydyzacji; do tego buforu będziemy dodawać zdenaturowaną sondę. Rozgrzewamy blok grzejny i wirujemy sondę przechowywaną w temperaturze -20 °C, a następnie przenosimy odpowiednią ilość sondy do probówki typu Eppendorf, aby przeprowadzić denaturację w temperaturze 80 °C przez około pięć minut. W tym przypadku denaturujemy dwie sondy jednocześnie, więc dodajemy bufor do hybrydyzacji do sondy, a następnie wlewamy 100 µL mieszaniny sondy do każdego dołka.Aby sfinalizować ten etap, przykryjemy wszystkie studzienki parafina, ponieważ skrzydła będą inkubowane przez następne dwa dni w temperaturze 55 stopni, a parafina zapobiega parowaniu. Po dwóch dniach inkubacji sondę usuwa się poprzez przemycie skrzydeł roztworem PHP, przy czym ostatni płukanie pozostaje na skrzydłach przez kolejne 12 do 24 godzin. Na koniec skrzydła są przemywane w serii etapów, aby przywrócić je do roztworu PBT. Ponownie stosuje się przy tym roztwór mieszany 50:50 pomiędzy poszczególnymi krokami.Na tym etapie do skrzydeł dodaje się roztwór blokujący przeciwciała, a przeciwciało anty-DIG sprzężone z fosfatazą alkaliczną dodaje się do PBT, aby uzyskać stężenie około 1:2000. Do każdego dołka należy dodać około 300 µL tego roztworu przeciwciał, a następnie umieścić skrzydła w lodówce w celu inkubacji z przeciwciałem przez noc. Następnego dnia przeciwciało usuwa się poprzez serię przemyć roztworem PBT, a następnie skrzydła płucze się dwukrotnie w buforze detekcyjnym w temperaturze pokojowej.Na koniec do każdej studzienki dodaje się 1 mL roztworu wywoływującego, a skrzydła szybko przykrywa się folią aluminiową. Po około 10 minutach sprawdzamy próbki; skrzydła zaczynają przybierać fioletowy kolor, ale są wciąż nieco jasne. Przykrywamy je ponownie, a po kilku minutach sprawdzamy je raz jeszcze – stały się nieco ciemniejsze.Należy zauważyć, że skrzydła inkubowane w różnych probówkach zdawały się ciemnieć w nieco różnym tempie, dlatego postanowiliśmy przykryć je ponownie i ostatecznie, 20 minut później, zdecydowaliśmy się zatrzymać reakcję za pomocą buforu stopującego wywoływanie. Skrzydła są teraz gotowe do zamontowania na szkiełku, więc dodajemy małą kroplę medium montażowego na opisanym szkiełku i przenosimy skrzydła na szkiełko, po prostu podnosząc je pęsetą i kładąc na kropli. Usuwamy pęcherzyki powietrza, delikatnie prostujemy skrzydło i przykrywamy je szkiełkiem nakrywkowym.W tym doświadczeniu wykorzystujemy sondę skierowaną przeciwko transkryptom genu grail, które lokalizują się w centrum przyszłego wzorca IPO skrzydła motyla Bicyclus anynana we wczesnych etapach rozwoju poczwarki.

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół in situ skrzydeł poczwarek motyli z użyciem Riboprobes

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

Ten protokół opisuje skuteczne podejście do hybrydyzacji in situ w celu wykrycia poziomów ekspresji mRNA i wzorców przestrzennych docelowych genów w płynie celomicznym Sipunculus nudus.

Hybrydyzacja in situ dla Sipunculus nudus Płyn celomiczny

Naucz się in situ z rybosondami do analizy ekspresji genów w skrzydłach poczwarki Bicyclus anynana. Ten protokół umożliwia badanie czasowych wzorców mRNA w rozwoju motyli.

Protokół hybrydyzacji in situ dla skrzydeł poczwarki motyla z użyciem rybop sond

Przeglądaj więcej filmów