Name: Wytwarzanie transgenicznych C. elegans przez transformację biologiczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Naucz się wytwarzać transgeniczne C. elegans za pomocą biolistycznej transformacji z cząstkami złota pokrytymi DNA. Ta metoda stanowi skuteczną alternatywę dla mikroiniekcji w badaniach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z funduszy zalążkowych University of Pittsburgh oraz z grantu NIH AG028977 przyznanego A.L.F.

Przegląd
Tradycyjnie nicienie transgeniczne wytwarzano poprzez mikroiniekcję DNA transgenu do linii zarodkowej C. elegans 1,2,3,4. Mimo że metoda ta jest skuteczna, wymaga ona specjalistycznego sprzętu oraz zdobycia doświadczenia w zakresie anatomii nicieni i techniki mikroiniekcji. W ostatnim czasie opracowano bombardowanie biolistyczne jako alternatywną metodę, w której wykorzystuje się pokryte DNA cząsteczki złota do wprowadzenia obcego DNA do linii zarodkowej 5,6. Podejście to wymaga mniejszego nakładu czasu w postaci praktyki w celu osiągnięcia sukcesu.
Bombardowanie biolistyczne C. elegans w celu wytworzenia robaków transgenicznych charakteryzuje się niską wydajnością na poziomie pojedynczego osobnika, dlatego sukces wymaga zastosowania dużej liczby zwierząt. Można je hodować na kilka sposobów, jednak my stosujemy płytki z jajami, aby zmniejszyć nakład pracy oraz liczbę wykorzystywanych płytek. Nasz protokół rozpoczyna się od przygotowania płytek z jajami oraz robaków, a następnie koncentruje się na protokole bombardowania z wykorzystaniem systemu Bio-Rad PDS-1000/He Hepta. Nasz protokół został częściowo zaadaptowany z pracy Berezikova i wsp. 7.
W metodzie bombardowania gen unc-119 jest zazwyczaj wykorzystywany jako marker dla zwierząt transgenicznych. Szczepy nicieni posiadające tę mutację są poważnie nieskoordynowane i prawie się nie ruszają, mają krępą budowę ciała i nie są w stanie tworzyć larw dauer 8. Dauer to alternatywny etap larwalny, który służy do opóźnienia rozwoju do stadium dorosłego osobnika zdolnego do rozrodu w niesprzyjających warunkach; wejście w stan dauer jest regulowane przez wiele genów 9. Kilka szczepów posiadających gen unc-119 jest dostępnych w C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). Pierwotny szczep DP38 (unc-119(ed3)) posiada również niezwiązaną z tym procesem konstytutywną mutację tworzenia dauer (daf-c), która mogłaby wpływać na dalsze eksperymenty. Wiele laboratoriów wyeliminowało tę mutację poprzez krzyżowanie wsteczne, a szczep HT1593 jest dostępny w CGC. Uważamy, że zwierzęta transgeniczne są nieco łatwiejsze do zidentyfikowania w szczepie DP38, dlatego zazwyczaj używamy tego szczepu do tworzenia zwierząt transgenicznych. W razie potrzeby używamy HT1593 do krzyżowania wstecznego nicieni transgenicznych w celu usunięcia mutacji daf-c. Hodowla nicieni DP38 jest jednym z najwolniejszych etapów protokołu, dlatego utrzymujemy zapas płytek hodowlanych podczas przygotowywania transgenów.
Ekspresja markera unc-119 wraz z badanym genem umożliwia łatwą identyfikację zwierząt wykazujących ekspresję transgenu na podstawie przywrócenia prawidłowej ruchliwości i wielkości ciała 5. Gen unc-119 można pozyskać z kilku źródeł; stosuje się wektory wykorzystujące genomiczne DNA unc-119, promotor i cDNA unc-119 oraz genomiczne DNA mniejszego genu C. briggsiae 8,10. Niedawno opisaliśmy prosty protokół wprowadzania kasety unc-119 do dowolnego plazmidu zawierającego gen oporności na ampicylinę poprzez rekombinację homologiczną 11 oraz metodę modyfikacji fosmidów nicieni w celu przeniesienia genu unc-119 za pomocą rekombinacji Cre-lox w celu wytworzenia zwierząt transgenicznych 12. Plazmidy są dostępne w Addgene Inc. (Cambridge, MA).
Choć nakład pracy związany z przeprowadzeniem pojedynczego bombardowania jest znaczny, lecz możliwy do opanowania, dodatkowa praca związana z wykonaniem wielu bombardowań w ciągu jednego dnia jest minimalna. W związku z tym rutynowo grupujemy produkcję nicieni transgenicznych, aby zmniejszyć nakład pracy potrzebny do wytworzenia każdego z nich.
1. Przygotowanie płytki z jajami
Mutanty nicieni unc-119 są trudne do hodowli na standardowych płytkach NGM, ponieważ ze względu na upośledioną mobilność mają tendencję do głodowania w niektórych częściach płytki, podczas gdy w innych wciąż znajduje się pożywka. Płytki z jajkami (egg plates) rozwiązują ten problem, ponieważ gruba warstwa pożywki na takich płytkach umożliwia nicieniom unc-119 łatwiejsze pełzanie i zajęcie całej powierzchni płytki 7. Płytki z jajkami mają również tę zaletę, że wspierają wzrost dużej liczby nicieni, dzięki czemu wymagane jest mniej płytek 13. Zazwyczaj 5 płytek z jajkami wystarcza do wyhodowania nicieni na jedną sesję bombardowania. Poniższa receptura pozwala na przygotowanie około 50 płytek, ale w razie potrzeby można ją zmniejszyć o połowę, aby przygotować mniejszą liczbę.
Płytki z jajami mogą ulec łatwemu zanieczyszczeniu, dlatego w płytkach stosujemy zarówno antybiotyki, jak i leki przeciwgrzybicze, a do zasiewu płytek wykorzystujemy wyłącznie jaja poddane traktowaniu podchlorynem.
Dzień 1:
<ol>
	<li>Przygotować LB (400 mL) w butelce o pojemności 500 mL. Autoklawować przez 20 min.</li>
	<li>Wylać ok. 50 płytek NGA o średnicy 10 cm, używając 1 litra NGA z 2% agar. Dodajemy nystatynę w ilości 10 mL na litr oraz streptomycynę do stężenia 200 μg/mL 13.</li>
	<li>Wyhodować 40 mL kultury nocnej OP50-1 w LB z dodatkiem 200 μg/mL streptomycyny. Szczep ten jest oporny na streptomycynę i dostępny w CGC.</li>
	<li>Autoklawować butelkę 500 mL na następny dzień.</li>
</ol>
Dzień 2:
<ol>
	<li>Oddziel żółtka z 10 kurzych jaj do sterylnej butelki. Używamy do tego separatora żółtek (dostępnego w sklepach z artykułami gospodarstwa domowego, np. w Target). Wstrząśnij.</li>
	<li>Uzupełnij objętość do 400mL za pomocą pożywki LB. Wstrząśnij.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze 60°C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Ostudź do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 40mL szczepu OP50-1. Wstrząśnij.</li>
	<li>Rozlej po 5-8 mL mieszaniny na każdą płytkę.</li>
	<li>Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na noc, aby zastygły.</li>
</ol>
Dzień 3:
<ol>
	<li>Ostrożnie odlej pozostały płyn z płytek. Pozostaw do wyschnięcia pod przykryciem w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
</ol>
Dzień 4:
<ol>
	<li>Umieść płytki w pudełku lub plastikowej torebce i przechowuj w temperaturze 4°C do momentu użycia. Płytki te wydają się być zdatne do użytku przez 1-2 miesiące.</li>
</ol>
2. Wysiewanie płytek z jajami
<ol>
	<li>Namnóż nicienie DP38 na płytkach NGA 6 cm, dodając stężony OP50 do niedawno zagłodzonych płytek. W przypadku pojedynczego bombardowania używamy około 6 małych płytek do zaszczepienia 5 płytek z jajami. Przy wielokrotnych bombardowaniach używamy małych płytek do zaszczepienia 2 płytek z peptone liofilizowanym przed zaszczepieniem płytek z jajami.</li>
	<li>Wyizoluj jaja z nicieni DP38 przy użyciu podchlorynu 13,14. Resuspenduj jaja w sterylnych buforach S-basal lub M9 13,14.</li>
	<li>Przenieś jaja (&gt;10 000 na płytkę) na odpowiednią liczbę płytek z jajami. Hoduj nicienie na płytkach z jajami w temperaturze 20°C przez 7–10 dni do czasu bombardowania. Płytki będą gotowe do użycia, gdy nicienie zaczną oczyszczać płytki z pożywki. Płytki te są bardzo trudne do zagłodzenia, a dłuższa hodowla zwiększy wydajność nicieni.</li>
</ol>
Bombardowanie
Złoty roztwór zapasowy przygotowujemy z wyprzedzeniem i przechowujemy w temperaturze 4°C do czasu użycia. Potrzebne są również płytki NGA o średnicy 10 cm, zarówno niepunktowane, jak i punktowane. Płytki niepunktowane muszą zostać wlane odpowiednio wcześniej i całkowicie wysuszone, aby ułatwić absorpcję cieczy dodawanej wraz z nicieniami.
W dniu bombardowania najpierw myjemy nicienie, a następnie przystępujemy do przygotowania nanocząsteczek złota pokrytych DNA. Następnie przenosimy nicienie na niepunktowane płytki NGA, po czym kończymy płukanie nanocząsteczek złota i przenosimy je do makronośników.
Przygotowanie cząsteczek złota:
<ol>
	<li>Odważyć 60mg cząsteczek złota do probówki 1,7mL i namoczyć w 70% etanolu przez 15min. Odwirować krótko w celu wytrącenia cząsteczek złota.</li>
	<li>Przemyć 3 razy w sterylnej wodzie, za każdym razem odwirując krótko w celu zebrania złota.</li>
	<li>Resuspendować złoto w 1mL 50% sterylnego glicerolu. Jest to roztwór zapasowy cząsteczek złota, który można przechowywać przez wiele miesięcy w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
Nicienie:
<ol>
	<li>Zmyj robaki DP38 z płytek z jajami, używając buforu S-basal lub M9, a następnie przenieś je do probówki stożkowej o pojemności 50mL.</li>
	<li>Pozostaw probówki na blacie, aż robaki opadną na dno. Następnie odessij bufor i dodaj świeży S-basal lub M9. Powtórz płukanie 2 lub 3 razy, aż bufor będzie względnie wolny od zanieczyszczeń. Przechowuj robaki na tym etapie do momentu zakończenia powlekania DNA.</li>
	<li>Odessij bufor, pozostawiając około 2-3 mL zawiesiny robaków na jedną sesję bombardowania. Przenieś zawiesinę na nieoznaczoną płytkę NGA o średnicy 10 cm umieszczoną na lodzie. Ważne jest zminimalizowanie przenoszonej objętości, ponieważ płytka NGA musi całkowicie wyschnąć przed bombardowaniem. Upewnij się, że robaki pokrywają całą powierzchnię płytki.</li>
	<li>Pozostaw płytkę do wyschnięcia na lodzie. Lód zapobiegnie zlepianiu się robaków podczas procesu suszenia.</li>
</ol>
Ten krok jest istotny: płytka powinna być sucha, a nicie równomiernie rozproszone na płytce NGA. Przechowywanie nicieni w lodzie zapobiega ich przemieszczaniu się po płytce i agregowaniu w skupiska.
Przygotowanie DNA (dla jednej serii bombardowania):
<ol>
	<li>W probówce 1,7 mL zmieszać:
	<ul>
		<li>50 μl cząsteczek złota. Przed dodaniem należy dokładnie resuspender.</li>
		<li>50 μl DNA (10-15 μg). Nie zauważyliśmy większej różnicy między DNA kolistym a liniowym. Do oczyszczania DNA zazwyczaj stosujemy wkłady Qiagen midiprep (Qiagen Inc., Valencia, CA).</li>
		<li>50 μl 2,5 M CaCl2. Roztwór ten jest stabilny przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>20 μl 0,1 M spermidyny. 
		 
		Spermidyna jest niestabilna w roztworze wodnym. Przygotowujemy alikwoty spermidyny po 16 μl i przechowujemy w -20°C. Bezpośrednio przed użyciem dodajemy 1 mL wody, aby otrzymać roztwór 0,1 M. Roztwór ten musi być świeżo przygotowany do każdego bombardowania. 
		 
		Zazwyczaj mieszamy cząsteczki złota w probówce 1,7 mL za pomocą wirówki typu vortex z niską prędkością, a następnie kroplami dodajemy CaCl2, DNA i spermidynę/protaminę podczas wciąż trwającego mieszania. Technika ta jest znana osobom, które przeprowadzały transfekcję z użyciem fosforanu wapnia. 
		 
		Stosowaliśmy również protaminę zamiast spermidyny, uzyskując bardzo dobre wyniki 15. Przygotowujemy świeży roztwór (1 mg/mL) w wodzie i używamy 50 μl zamiast 20 μl spermidyny. W przypadku stosowania protaminy zazwyczaj inkubujemy mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut zamiast umieszczać ją na lodzie. Protaminy nie trzeba przechowywać w zamrażarce i występuje ona w formie proszku, a nie cieczy.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 min, okresowo mieszając w celu utrzymania cząsteczek złota w zawiesinie. Następnie krótko wirować i odessać nadsącz.</li>
	<li>Przemyć 300 μl 70% etanolu. Krótko wirować.</li>
	<li>Przemyć 1 mL 100% etanolu. Krótko wirować.</li>
	<li>Resuspender w 170 μl 100% etanolu.</li>
</ol>
Przygotowanie makronośników:
<ol>
	<li>Wypłucz 7 makronośników (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) w 2-propanolu. Połóż je na ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nanieś 20μl mieszaniny DNA/złota na środek każdego makronośnika. Przed pipetowaniem należy dokładnie wymieszać zawiesinę w wirówce (vortex), aby złoto pozostało w zawiesinie.</li>
	<li>Pozostaw etanol do odparowania.</li>
</ol>
3. Bombardowanie
Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przeprowadzić pusty ostrzał, aby przepłukać układ hellem.
<ol>
	<li>Włącz pompę próżniową i zamknij pułapkę pompy próżniowej. Stosujemy beztłuszczową pompę próżniową.</li>
	<li>Otwórz butlę z helem. Upewnij się, że ciśnienie wynosi ≥2200psi.</li>
	<li>Namocz membranę bezpieczeństwa (1350 psi) w 2-propanolu, umieszczając ją w nakrętce mocującej adapter hepta.</li>
	<li>Wkręć adapter do systemu PDS-1000 i dokręć go za pomocą dołączonego klucza dynamometrycznego.</li>
	<li>Umieść 7 makronośników w uchwycie i osadź je za pomocą dołączonego narzędzia. Następnie na uchwycie umieść sito stopowe hepta oraz dno. Odwróć uchwyt i umieść go na drugiej półce od góry. W tym momencie strona makronośników z złotymi kropkami musi być skierowana w dół.</li>
	<li>Wyrównaj otwory w górnej części uchwytu makronośników z wylotami adaptera hepta.</li>
	<li>Umieść płytkę NGA z naniesionymi niciami (bez pokrywki) na najniższej półce w komorze bombardowania.</li>
	<li>Całkowicie otwórz pokrętło przepływu próżni w systemie PDS-1000. Naciskaj przycisk vac, aż ciśnienie w komorze osiągnie 26 In Hg. Następnie przełącz do pozycji hold, aby utrzymać próżnię.</li>
	<li>Naciśnij i przytrzymaj przycisk fire, aż membrana pęknie. Nastąpi to, gdy ciśnienie osiągnie 1350psi. Czasami trwa to od 5 do 20 sekund. Zwolnij przycisk.</li>
	<li>Zwolnij próżnię z komory (pozycja vent) i wyjmij płytkę.</li>
	<li>Wyłącz pompę próżniową i dopływ helu.</li>
	<li>Uruchom funkcję fire kilka razy, aż linia nie będzie zawierać helu (manometr helu powinien wskazywać 0 psi).</li>
	<li>Wyłącz system PDS-1000.</li>
</ol>
Odzyskiwanie nicieni po bombardowaniu:
<ol>
	<li>Pozostaw płytkę po bombardowaniu w temperaturze 20°C na 20 minut.</li>
	<li>Zmyj nicienie z płytki, używając 10 mL buforu S-basal lub M9.</li>
	<li>Przenieś po 0,5 mL zawiesiny nicieni na 20 płytek NGA o średnicy 10 cm z naniesionymi punktami.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze 20°C lub w temperaturze pokojowej (22-24°C) przez około 2 tygodnie przed sprawdzeniem obecności uratowanych nicieni.</li>
	<li>Przesiewaj nicienie pod mikroskopem stereoskopowym w poszukiwaniu fenotypu unc-119(+). Optymalnym momentem na przesiewanie jest czas po zagłodzeniu populacji na płytkach, ponieważ uratowane nicienie mają przewagę przeżywalności nad osobnikami nieuratowanymi.</li>
	<li>Wyizoluj jedną linię osobniczą z każdej płytki 10 cm, na której znajdowały się uratowane nicienie.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Sukces protokołu w zakresie uzyskania zwierząt transgenicznych zależy od konkretnego transgenu. W przypadku transgenów reporterowych promotor:GFP uzyskaliśmy do 20 linii. Typowy wynik to od 3 do 10 linii. Do 30% linii transgenicznych to linie zintegrowane, jednak dzieje się to losowo, dlatego w przypadku szczególnego zapotrzebowania na linię zintegrowaną przeprowadzamy wielokrotne bombardowania w ciągu jednego dnia.

<ol><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , 1-15 (2006).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 229, 31-35 (1999).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
<li>Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+genes+in+nematode+dauer+larva+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interacting genes in nematode dauer larva formation.</a> Nature. 290, 668-671 (1981).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+function+and+expression+of+unc-119+from+two+Caenorhabditis+species+despite+divergence+of+non-coding+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA.</a> Gene. 183, 77-85 (1996).</li>
<li>Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrofitting+ampicillin+resistant+vectors+by+recombination+for+use+in+generating+C.+elegans+transgenic+animals+by+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment.</a> Plasmid. 62, 140-145 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+JE+%22The+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode, Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine-mediated+DNA+coating+remarkably+improves+bombardment+transformation+efficiency+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells.</a> Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).</li>
<li>Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation%3A+microbes+to+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation: microbes to mice.</a> Nature. 346, 776-777 (1990).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Bombardowanie biolistyczne jest prostą metodą wprowadzania obcego DNA do wielu organizmów, w tym C. elegans 1,5,6,7,16. Opiera się ono na tworzeniu kompleksu cząsteczek złota z DNA w obecności CaCl2. Kationowe poliaminy, takie jak spermidyna, chronią DNA przed degradacją przez nukleazy in vivo. Ponieważ spermidyna jest cząsteczką labilną, ważne jest przechowywanie jej w małych aliquotach w temperaturze -20°C i przygotowanie roztworu bezpośrednio przed przeprowadzeniem bombardowania. Jak opi...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>Cząsteczki złota</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Zestaw do Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>Protamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Makronośniki</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>System PDS-1000/He Hepta</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Membrana pękająca</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie transgenicznych c. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Liczba laboratoriów wykorzystujących wolnożyjącego nicienia C. elegans szybko rośnie. Popularność tego modelu biologicznego przypisuje się szybkiemu czasowi generacji i krótkiej długości życia, łatwemu i niedrogiemu utrzymaniu, w pełni zsekwencjonowanemu genomowi oraz szerokiemu zapleczu zasobów RNAi i zwierząt mutantów. Ponadto analiza genomu C. elegans ujawniła duże podobieństwo między nicieniami a wyższymi kręgowcami, co sugeruje, że badania na nicieniach mogą stanowić istotny dodatek do badań prowadzonych na całych myszach lub hodowlach komórkowych. Potężnym i ważnym elementem badań nad nicieniami jest możliwość wykorzystania zwierząt transgenicznych do badania lokalizacji i funkcji genów. Zwierzęta transgeniczne można tworzyć albo poprzez mikroiniekcję do linii zarodkowej nicienia, albo za pomocą bombardowania biolistycznego. Bombardowanie jest nowszą techniką i jest mniej znana w wielu laboratoriach. W niniejszym materiale opisujemy prosty protokół generowania nicieni transgenicznych metodą bombardowania biolistycznego cząsteczkami złota przy użyciu systemu Bio-Rad PDS-1000. W porównaniu z mikroiniekcją DNA do linii zarodkowej hermafrodyt, protokół ten ma tę zaletę, że nie wymaga od operatora specjalnych umiejętności w zakresie identyfikacji anatomii nicienia czy wykonywania mikroiniekcji. Co więcej, z jednego bombardowania zazwyczaj uzyskuje się wiele linii transgenicznych. Ponadto, w przeciwieństwie do mikroiniekcji, bombardowanie biolistyczne pozwala na uzyskanie zwierząt transgenicznych zarówno z macierzami pozachromosomalnymi, jak i zintegrowanymi transgenami. Możliwość uzyskania zintegrowanych linii transgenicznych pozwala uniknąć stosowania protokołów mutagennych w celu integracji obcego DNA. Podsumowując, bombardowanie biolistyczne może być atrakcyjną metodą generowania zwierząt transgenicznych, szczególnie dla badaczy, którzy nie chcą poświęcać czasu i wysiłku niezbędnego do opanowania techniki mikroiniekcji.

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Liczba laboratoriów wykorzystujących wolnożyjącego nicienia C. elegans szybko rośnie. Popularność tego modelu biologicznego przypisuje się szybkiemu...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie nicieni transgenicznych za pomocą transfekcji biotycznej lub za pomocą armatki genowej. W pierwszej kolejności hoduje się duże ilości nicieni, następnie nanocząsteczki złota pokrywa się DNA, a następnie poddaje się nicienie bombardowaniu; potomstwo transgeniczne jest następnie izolowane i odzyskiwane, a następnie tworzy się nowe linie transgeniczne. Witam, nazywam się Daniel Owa i pracuję w laboratorium dr. Alfreda Fishera w Departamencie Medycyny na Uniwersytecie w Pittsburghu.Dzisiaj przedstawimy procedurę generowania nicieni transgenicznych. Metody tej używamy do badania regulacji genów przez czynniki transkrypcyjne. Zapraszamy do oglądania.Przygotowanie płytek z agarem rozpoczyna się od wlania mieszaniny 2% agaru w pożywce NGA uzupełnionej o nystatynę i streptomycynę. W płytkach o średnicy od 10 do 50 centymetrów należy pozwolić na wyschnięcie w temperaturze pokojowej. Następnie należy wysterylizować w autoklawie 400 mililitrów pożywki LB w butelce o pojemności 500 mililitrów oraz 40 mililitrów pożywki LB w kolbie o pojemności 250 mililitrów.Autoklawować również pustą butelkę o pojemności 500 mililitrów przez 20 minut. Po autoklawowaniu dodać streptomycynę do 40 mililitrów pożywki LB do stężenia końcowego 200 mikrogramów na mililitr. Następnie zaszczepić szczepem e coli.OP 50 dash one. Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia umieścić żółtka z 10 kurzych jaj do sterylnej butelki o pojemności 500 mL.Uzupełnić objętość do 400 mililitrów pożywką LB i wstrząsać do uzyskania jednorodnego roztworu. Inkubować roztwór w temperaturze 60 stopni Celsius przez jedną godzinę. Po ochłodzeniu mieszaniny LB do temperatury pokojowej dodać do butelki 40 mililitrów kultury ELI i wstrząsnąć.Następnie pipetuj od 5 do 8 ml kultury na przygotowane płytki NGA. Pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia odlej pozostałą ciecz i susz przez kolejną noc w temperaturze pokojowej.Na tym etapie płytki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius przez jeden do dwóch miesięcy lub niezwłocznie zasiać na nich nicienie. Aby ponownie zwiększyć populację DP 38 CL, należy nanieść skoncentrowaną kulturę e coli OP 50 na płytki NGA o średnicy sześciu centymetrów zawierające niedawno głodzone nicienie DP 38 i inkubować. Do izolacji jaj z nicieni DP 38 stosuje się roztwór podchlorynu alkalicznego.Procedurę opisano w załączonym protokole. Po wyizolowaniu jaj resuspenduj je w buforach S basil lub M9. Przenieś ponad 10 000 jaj na każdą przygotowaną płytkę do jaj o średnicy 10 cm i inkubuj nicienie w temperaturze 20 °C przez okres od 7 do 10 dni.Gdy nicienie zaczną zjadać pokarm, płytki są gotowe do bombardowania. Aby pokryć cząsteczki złota DNA do bombardowania, należy dodać 60 mg cząsteczek złota do probówki o objętości 1,7 ml. Następnie dodaj 70% etanol i pozostaw złoto do namoczenia na 15 minut.Krótko odwiruj probówkę, aby zgranulować cząsteczki złota. Odlej etanol. Następnie trzykrotnie przemyj cząsteczki złota w wodzie sterylnej.Resuspenduj złoto w jednym mililitrze 50% sterylnego glicerolu. Roztwór zapasowy nanocząsteczek złota można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zbierz nicienie, wypławiając je z płytek z jajami, używając buforów s basil lub M line.Następnie przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozostaw nicienie do czasu, aż opadną na dno probówki. Następnie odessaj z probówki cały bufor, pozostawiając jedynie od dwóch do trzech ml.Przenieś nicienie na 10-centymetrową, gładką płytkę NGA, która została schłodzona na lodzie. Rozmieść nicienie równomiernie na całej powierzchni płytki. Następnie pozostaw płytkę na lodzie do całkowitego wyschnięcia.Zapobiegnie to zlepianiu się nicieni podczas procesu suszenia. Ważne jest, aby nicienie były równomiernie rozłożone, a płytka całkowicie sucha przed procedurą bombardowania. Aby przygotować nanocząsteczki złota powlekane DNA, należy dodać 50 µL resuspendowanych nanocząsteczek złota do probówki o pojemności 1,7 ml.Odwiruj cząsteczki złota i usuń supernatant. Następnie dodaj mieszaninę od 10 do 15 µg oczyszczonego, kolistego lub zlinearyzowanego DNA zainteresowania oraz 20 µL świeżo przygotowanej 0,1 M sperminy. Na koniec, podczas delikatnego mieszania próbki w probówce za pomocą wortexa, dodaj 50 µL 2,5 M chlorku wapnia i inkubuj mieszaninę w lodzie przez 30 minut, okresowo mieszając, aby utrzymać cząsteczki złota w zawiesinie.Po 30 minutach odwirować mieszaninę cząsteczek złota. Krótko odessać nadsącz, przemyć 300 µL 70% etanolu, a następnie 1 mL 100% etanolu; na koniec zawiesić powlekane DNA cząsteczki złota w 170 µL 100% etanolu. Przed każdym ostrzałem wypłukać siedem nośników makroskopowych, w których znajdą się cząsteczki złota, w propanolu, a następnie pozostawić je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.Wymieszaj mieszaninę DNA i złota za pomocą wkrętaka (vortex). Następnie nanieś pipetą 20 µL na środek każdego makronośnika. Pozostaw do odparowania etanolu.Włóż membranę bezpieczeństwa do adaptera Hector i zamocuj adapter w aparaturze do bombardowania. Następnie umieść siedem nośników makroskopowych w uchwycie i za pomocą dostarczonego narzędzia dociśnij je do miejsca osadzenia. Następnie na uchwycie umieść ekran ograniczający Hector oraz dno.Odwróć uchwyt tak, aby strona z złotymi kropkami nośników makro była skierowana w dół. Następnie umieść go na drugiej półce od góry. Dopasuj otwory w górnej części uchwytu nośników makro do wylotów adaptera Hector.Zdejmij pokrywkę z płytki NGA pokrytej nicieńcami i umieść ją na najniższej półce w komorze bombardowania. Całkowicie otwórz pokrętło przepływu próżni i naciśnij oraz przytrzymaj przycisk vac, aż w komorze zostanie osiągnięta wartość 26 cali słupa rtęci. Następnie przełącz urządzenie w pozycję hold. Aby utrzymać próżnię, naciśnij i przytrzymaj przycisk fire do momentu pęknięcia membrany.Zdarzy się to, gdy ciśnienie osiągnie 1, 350 PSI, co może potrwać od pięciu do 20 sekund. Zwolnij przycisk, usuń próżnię z komory, przełączając urządzenie do pozycji odpowietrzania (vent), a następnie wyjmij płytkę. Wyłącz próżnię w helu.Następnie naciśnij spust kilka razy, aż linia helu zostanie przedmuchana, a manometr helu wskaże 0 PSI. Na koniec wyłącz system PDS 1000. Po dokonaniu transformacji nicienie mogą zostać odzyskane i inkubowane po bombardowaniu.Pozostaw płytkę w temperaturze 20 °C przez 20 minut. Następnie zmyj nicienie z płytki, używając 10 ml buforu S basil lub M nine, a następnie zaszczep 20 płytek NGA z dodatkiem spotten, nakładając na każdą 0,5 ml zawiesiny nicieni w buforze. Następnie pozostaw płytki w temperaturze pokojowej przez około dwa tygodnie.Przeprowadź przesiew w celu wykrycia uratowania fenotypu UNC-19 przez transgen i wygeneruj jedną linię osobniczą z każdej płytki o średnicy 10 cm, na której znajdowały się uratowane nicienie. Skuteczność protokołu w zakresie uzyskania zwierząt transgenicznych zależy od konkretnego transgenu. W przypadku transgenów reporterowych z promotorem GFP uzyskaliśmy do 20 linii.Bardziej typowym wynikiem jest uzyskanie od trzech do 10 linii. Do 30% linii transgenicznych to linie zintegrowane, jednak proces ten jest losowy, dlatego w przypadku szczególnego zapotrzebowania na linię zintegrowaną przeprowadzamy wielokrotne bombardowania w jednym dniu. Przedstawiono reprezentatywną płytkę o średnicy 10 centymetrów z 19 zmutowanymi robakami uratowanymi dzięki bombardowaniu transgenem.Uratowane nicienie można zidentyfikować po większym rozmiarze i znacznie lepszej mobilności w porównaniu do osobników nietransformowanych. Na jednej płytce znajduje się 19 mutantów. Izolacja uratowanych nicieni transformowanych transgenem GFP prowadzi do ekspresji GFP.Ten transgen silnie wykazuje ekspresję GFP w jelicie i hipodermie transgenicznych nicieni. Ten konkretny transgen jest zintegrowany z chromosomem nicienia, a 100% potomstwa wykazuje ekspresję transgenu. Przedstawiliśmy właśnie sposób przeprowadzania biolistycznego bombardowania C. elegans podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby wyhodować odpowiednią liczbę nicieni i używać świeżych preparatów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie transgenicznych C. elegans poprzez transformację biolistyczną

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Ten film opisuje zasady leczenia RNAi u C. elegans i demonstruje protokół do eliminacji lin-35 w transgenicznym szczepie robaków.

Posiewanie RNAi dla karmienia C. elegans: technika indukowania docelowej ekspresji dsRNA w E. coli

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Ten protokół opisuje, jak badać procesy komórkowe podczas przekształcania losu komórki u Caenorhabditis elegans in vivo. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, można zaobserwować in vivo nadekspresję czynnika transkrypcyjnego CHE-1 indukującego los neuronu pod wpływem promotora szoku cieplnego i pośredniczące w RNAi wyczerpanie komórki rozrodczej czynnika regulującego chromatynę LIN-53 do przeprogramowania neuronów.<br...

Zastosowanie RNAi i ekspresji czynnika transkrypcyjnego wywołanej szokiem cieplnym do przeprogramowania komórek rozrodczych na neurony u C. elegans

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Naucz się wytwarzać transgeniczne C. elegans za pomocą biolistycznej transformacji z cząstkami złota pokrytymi DNA. Ta metoda stanowi skuteczną alternatywę dla mikroiniekcji w badaniach genetycznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Przeglądaj więcej filmów