Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznego danio pręgowanego: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez celowaną ablację komórek neuronalnych

Ekspresja fluorescencyjnych reporterów u zwierząt transgenicznych umożliwia śledzenie odpowiedzi komórkowych na eksperymentalne manipulacje w żywych modelach chorób. W tym przypadku selektywna utrata komórek jest farmakologicznie indukowana u danio pręgowanego, wielokolorowego konfokalu o wysokiej rozdzielczości. Obrazy docelowych komórek i bezpośrednich sąsiadów są uzyskiwane przed i bezpośrednio po, a ich odstępy czasu po leczeniu farmakologicznym analiza obrazu wykazują aktywację endogennych populacji komórek macierzystych i późniejszą wymianę komórek docelowych w fazie rekonwalescencji.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii regeneracji, takie jak: Jakie są mechanizmy komórkowe i molekularne używane do regeneracji dyskretnych typów komórek Zacznij od przeniesienia transgenicznych jaj zebranych z krzyżowania na szalkę Petriego zawierającą 0,3 x roztwór danio w 16 godzin po zapłodnieniu. DODAĆ PTU, aby zahamować aktywność tyrozyny ACE przed pojawieniem się jakichkolwiek dowodów pigmentacji w tkance będącej przedmiotem zainteresowania. Jeśli zarodek nie jest albinosem, wysiaduj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza.

Gdy reporterzy będą widoczni, umieść szalkę Petriego pod fluorescencyjnym mikroskopem stereo i posortuj pod kątem pożądanej ekspresji transgenu. Przed obrazowaniem. Przygotuj 0,5% niskotopliwy roztwór montażowy aeros w pożywce dla zarodków i przechowuj go w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

W razie potrzeby dodać trica i PTU. Delikatnie wymieszaj i wróć do 40 stopni Celsjusza. Znieczulić ryby, umieszczając je w pożywce embrionalnej zawierającej triki.

Przez około trzy minuty ryba przestanie reagować. Aby dotknąć za pomocą mikropipety, należy narysować pojedyncze ryby do przyciętej końcówki pipety w objętości około 30 mikrolitrów roztworu znieczulającego. Następnie odwróć pipetę i pozwól rybie osiąść na dnie.

Przyłóż końcówkę do roztworu montażowego i pozwól im przenieść się grawitacyjnie. Uważaj, aby nie rozcieńczyć agro, aby można je było ponownie wykorzystać. Wyrzuć pozostały roztwór znieczulający z mikropipety.

Następnie, używając tej samej końcówki, przenieś rybę na szalkę Petriego. W około 30 mikrolitrach roztworu montażowego delikatnie ustaw rybę tak, aby obszar zainteresowania był wyśrodkowany w kropli aeros. Upewnij się, że ryby pozostają w pożądanej orientacji, dopóki aeros nie zestale się.

W razie potrzeby na jednej szalce Petriego można zamontować wiele ryb. Po zestaleniu się aerosu przetransportuj rybę do etapu mikroskopu konfokalnego i delikatnie dodaj pożywkę zarodkową zawierającą trica plus lub minus PTU do naczynia, aż ryby zostaną całkowicie zanurzone. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i skoncentruj się na obszarze zainteresowania, aby uzyskać optymalne obrazowanie szczegółów komórkowych i/lub molekularnych.

W oprogramowaniu należy używać obiektywów o dużej odległości roboczej z dużymi otworami numerycznymi. Wybierz odpowiednią czwórkę flory z listy wybierania. Kliknij ustawienie widma i dokonaj regulacji zakresów emisji.

Aby uzyskać czystą separację sygnałów reporterowych i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu. Wybierz odpowiedni cel z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia wstępne zdefiniowane przez oprogramowanie są prawidłowo dostosowane. Aby ustawić ostrość laserów i ustawić poziomy mocy, wybierz wyjście z tabeli przeglądowej, które ujawnia nasycenie pikseli dla każdego kanału.

Następnie ustaw czułość detektora, aby uzyskać pożądaną jakość obrazu, stopniowo zwiększaj moc lasera, aż intensywność obrazu będzie akceptowalna. Unikaj nasycenia pikseli w obszarze zainteresowania i utrzymuj poziom lasera na jak najniższym poziomie. Aby zmniejszyć problemy z fotowybielaniem i fototoksycznością.

Upewnij się, że każda linia laserowa wytwarza wykrywalny sygnał tylko w odpowiednim kanale, ręcznie włączając i wyłączając lasery podczas monitorowania wszystkich kanałów obrazowania. Jeśli nie jest widoczny przesłuch, wszystkie kanały można odbierać jednocześnie. Następnie wykadruj obszar zainteresowania za pomocą funkcji powiększania i obracania.

Następnie ustaw prędkość skanowania i rozmiar obrazu, korzystając z szybszych prędkości skanowania, minimalizując czas przebywania lasera i zwiększając rozdzielczość czasową. Ustaw rozmiar kroku wymiaru Z zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. W tym przypadku krok o wielkości 10 mikronów jest używany do obrazowania siedmiu optycznych odcinków tkanki siatkówki.

Po ustaleniu odpowiednich ustawień pobierz obrazy Zacka i zapisz. Następnie przejdź do następnej ryby. Obrazowanie seryjne typu "złów i wypuść" można wykonać w celu śledzenia zmian komórkowych w kolejnych dniach zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie pisemnym.

Podczas wykonywania eksperymentu z obrazowaniem wieloreporterowym najlepiej jest używać podłóg podłogowych, które są dobrze oddzielone, spektralne, jednak nie zawsze jest to praktyczne. Tutaj pokazujemy prostą metodę odejmowania obrazu przy użyciu obrazu J w oprogramowaniu open source do oddzielania pięter podłogowych z nakładającymi się profilami wzbudzenia i emisji. W naszym przypadku GFP i YFP.

Techniki obrazowania osi czasu opisane w tym filmie zostały wykorzystane do monitorowania komórek macierzystych siatkówki znakowanych GFP podczas ablacji i regeneracji dwubiegunowych neuronów siatkówki Aby przeprowadzić separację spektralną, zbierz obrazy przy użyciu trybów obrazowania sekwencyjnego i zmiennych ustawień filtra barierowego, które umożliwiają niezależne i częściowo oddzielone nakładające się na siebie cztery. Po pobraniu obrazów użyj importu ImageJ loci bio formas, aby otworzyć pliki obrazów i uruchomić narzędzie do importowania. Przeciągnij interesujący Cię plik do okna obrazu J.

Podziel kanały na indywidualne stosy za pomocą pola wyboru podziel kanały w oknie importu, aby uruchomić wtyczkę align three TP. Kliknij wtyczki, a następnie wyrównaj stosy. Następnie wyrównaj trzy tp.

Stosy muszą być wyrównane, aby zapewnić prawidłowe odejmowanie. Wybierz stos odwołań w pierwszym polu listy rozwijanej i nieprawidłowo wyrównany stos w drugim. Zaznacz pola Użyj względnego początku XY i Użyj względnego początku Z, a następnie kliknij przycisk OK.

Aby rozpocząć proces wyrównywania, kliknij przycisk rejestracji woluminu. Pojawi się nowe okno zawierające parametry wyrównania. Kliknij w porządku.

Ta sekcja została zoptymalizowana przez dystrybutora wtyczki, więc nie są konieczne żadne modyfikacje. Po zakończeniu pojawi się wyrównane okno stosów. Wybierz dane wyjściowe z wyrównanego okna, aby otworzyć okno danych wyjściowych.

To okno jest również zoptymalizowane i nie wymaga modyfikacji. Kliknij w porządku. W przestrzeni roboczej pojawi się nowy stos z wyrównanym dołączonym na końcu tytułu pliku.

Aby usunąć przesłuch za pomocą kalkulatora obrazu, kliknij proces, a następnie kalkulator obrazu. Wybierz stos do odjęcia w polu rozwijanym obrazu o jeden i stos, który ma być używany w odejmowaniu. W polu rozwijanym obrazu dwa wybierz opcję odejmij w polu rozwijanym operacji i kliknij przycisk OK.

Obraz J poprosi o przetworzenie stosu. Wybierz opcję Tak. Powinien pojawić się nowy stos, który usunął przesłuchy między nakładającymi się kanałami.

Scal stosy, aby odtworzyć tę samą strukturę obrazu przed wyrównaniem i odjęciem. Wybierając scalone kanały w oknie narzędzi kanałów, narzędzie umożliwia połączenie maksymalnie czterech stosów w hiperstos. Na koniec pokoloruj kanały, dostosuj jasność i kontrast oraz zapisz pliki jako tiffs, aby zbadać ukierunkowaną utratę i regenerację nitroreduktazy.

M wiśnia wyrażająca dwubiegunowe komórki siatkówki. Seria czasowa obrazów konfokalnych została wykonana u poszczególnych danio pręgowanych przed leczeniem. W kontrolowanych komórkach dwubiegunowych występuje mozaikowa ekspresja reportera YFP znakowanego błoną, a w komórkach dwubiegunowych białka fuzyjnego nitroreduktazy w ukierunkowanych chorobach dwubiegunowych.

Oznakowany błoną transgen CFP pokazany w kolorze cyjanu dostarcza informacji kontekstowych o większości innych komórek siatkówki w celu zwiększenia przejrzystości. Ten sam obraz bez sygnału CFP jest wyświetlany po leczeniu metronidazolem. Czerwona reduktaza nitroreduktaza wykazująca ekspresję komórek dwubiegunowych jest tracona, podczas gdy żółte kontrolowane komórki dwubiegunowe są oszczędzane.

Świadczy to o bardzo specyficznym charakterze tej metodologii ablacji. Ponownie, ten sam obraz bez CFP jest pokazany dla przejrzystości. Po usunięciu metro NIAZ wracają tu komórki wyrażające ekspresję NTR.

Przykład metody odejmowania G-F-P-Y-F-P pokazano na tym rysunku GFP oznaczonym jako Mueller. Komórki GL są pokazane na zielono, a komórki dwubiegunowe oznaczone YFP są pokazane na fioletowo. Nakładanie się między nimi powoduje utworzenie koloru białego w celu wykonania odejmowania.

Obrazy GFP i YFP muszą być najpierw wyrównane. Proces odejmowania pozwala następnie na usunięcie komórek dwubiegunowych znakowanych YFP z obrazu GFP, co pozwala na czystą reprezentację ggl Muellera oznaczoną GFP i wykrycie ciemniejszych komórek Muellera. Można teraz zweryfikować nakładanie się przyciemnionych komórek dwubiegunowych oznaczonych kolorami Muellera, ggl i M oznaczonych wiśnią, pokazanych na czerwono.

Przedstawione tutaj dane sugerują, że ablacja komórek dwubiegunowych wyzwala mullar ggl w celu zastąpienia utraconych komórek. Ta interpretacja jest zgodna z ostatnimi badaniami nad regeneracją siatkówki, które sugerują, że Mueller Ggl jest prekursorem wywołanym urazem zarówno u ssaków, jak i ryb. Technika ta pozwoliła naukowcom na zbadanie mechanizmów regulujących regenerację określonych typów komórek poprzez wizualizację komórek macierzystych u danio pręgowanego.