Name: Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznego danio pręgowanego: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez celowaną ablację komórek neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj wielokolorowe obrazowanie poklatkowe w transgenicznych danio pręgowanych do badania aktywacji komórek macierzystych siatkówki po celowanej ablacji neuronów. Ta metoda pozwala wizualizować procesy regeneracji nerwów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr Meera Saxena i dr. Jonathanowi Mathiasowi za pomocne uwagi do manuskryptu. Dziękujemy dr. Michaelowi Parsonsowi, dr Pameli Raymond i dr Rachel Wong za udostępnienie linii transgenicznych. Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi w protokole 07-12-003*B zatwierdzonym przez MCG IACUC. Praca ta była finansowana przez NIH R21 MH083614 oraz stypendium March of Dimes Basil O Conner Starter Scholar Award przyznane J.S.M.

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

J.S.M. otrzymał patent na wykorzystanie systemu ablacji komórek opartego na nitroreduktazie u rybek zebrafish (Mumm J.S., and Schroeter, E.H. „Targeted and Regional Ablation Cellular Ablation in Zebrafish” US Patent 7514595. 7 Apr. 2009). Technika ta służy jako ogólna platforma dla firmy biotechnologicznej Luminomics, Inc., oferującej narzędzia i usługi, którą J.S.M. założył i w której pozostaje udziałowcem.

W tym filmie przedstawiono przegląd technik stosowanych do wielokolorowego obrazowania konfokalnego w trybie time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Wykorzystujemy obrazowanie time-lapse do monitorowania zachowania wielu interesujących nas typów komórek in vivo, natomiast celowana ablacja komórek służy do badania funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danych komórek. Przedstawione przykłady podkreślają szereg zalet wynikających z zastosowania tych podejść. Być może najważniejszym jest to, że obrazowanie time-lapse zapewnia paradygmat z kontrolą wewnętrzną; wszelkie zaobserwowane zjawiska mogą być odnoszone do stanów poprzednich. Pozwala to na dokonywanie bezpośrednich, a nie wnioskowanych porównań pomiędzy punktami czasowymi eksperymentu, co ułatwia kwantyfikację zmian względnych i redukuje „szum” eksperymentalny związany z wariancją w obrębie populacji. Zaletą obrazowania wielokolorowego jest możliwość wizualizacji zmian w oddziałujących i/lub sąsiadujących typach komórek. Na przykład, wykorzystując linię transgeniczną znakującą glej Müllera, charakteryzujemy obecnie odpowiedź tych potencjalnych, indukowanych urazem komórek macierzystych na utratę dyskretnych subpopulacji komórek siatkówki. Podejście to wykorzystaliśmy również do zdefiniowania nowych mechanizmów formowania obwodów neuronalnych 2. Wreszcie, oprócz badań nad regeneracją komórkową, zaczęliśmy ostatnio stosować system ablacji oparty na NTR w celu zbadania funkcjonalnej roli podtypów neuronów – a zatem dyskretnych obwodów neuronalnych – przy użyciu różnych paradygmatów behawioralnych i testów elektrofizjologicznych. Wyjątkową zaletą wykorzystania rybek danio w takich badaniach jest fakt, że dzięki ich zdolnościom regeneracyjnym indukowane deficyty są przejściowe. Dzięki temu, korelując wyniki z testami obrazowania time-lapse, możemy typować mechanizmy reinnerwacji prowadzące do powrotu funkcji, a także określać zakres reinnerwacji niezbędny do pełnej regeneracji funkcjonalnej.
Przedstawione metody można dostosować do wielu różnych zagadnień badawczych. Na przykład podobne analizy ablacji i regeneracji można zastosować do dowolnego podtypu komórkowego, który można zdefiniować transgenicznie. Wspólnie badania te mają potencjał, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat regeneracji na poziomie poszczególnych typów komórek oraz w obrębie odrębnych nisz komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">1. Odczynniki:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Roztwór Danieau:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;chlorek sodu (Fisher, S271 1)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;chlorek potasu (Fisher, P217 500)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;HEPES (Fisher, BP310500)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;siarczan magnezu (Fisher, M65 500)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;azotan wapnia (Fisher, C109500)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;penicylina-streptomycyna (Fisher, ICN1670049)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Pozostałe odczynniki:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;agaroza o niskiej temperaturze topnienia (Fisher, BP165-25)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;metanosulfonian trikanu (Fisher, NC9435281)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;N-fenylotiomocznik (Fisher, NC9968868)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;metronidazol (Fisher, AC21034-1000)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">2. Materiały:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;głębokie szalki Petriego (Fisher Scientific/Corning, 08-772-32)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;precyzyjne pęsety Dumont #5 (Fisher, NC9404145)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">3. Sprzęt:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;stereomikroskop z zoomem (Olympus, SZ51)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;fluorescencyjny stereomikroskop z zoomem (Olympus, SZX16)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;mikroskop konfokalny (Olympus FV1000)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;cyfrowy grzejnik blokowy Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;inkubator stołowy Barnstead/Thermolyne (Fisher, 11-702-4).&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Obrazowanie poklatkowe o wysokiej rozdzielczości żywych larw zebrafish może być wykorzystywane do wizualizacji przebiegu procesów biologicznych (w ramach przeglądu patrz 1). Złożone ryby transgeniczne, które wykazują ekspresję różnych reporterów fluorescencyjnych w sąsiadujących typach komórek, umożliwiają śledzenie interakcji komórkowych 2 i/lub reakcji na poziomie tkankowym na manipulacje eksperymentalne w czasie. W niniejszym filmie prezentujemy metody, które mogą być stosowane do seryjnego obrazowania wielu transgenicznie znakowanych typów komórek u poszczególnych osobników w przebiegach czasowych trwających od kilku minut do wielu dni. Opisane techniki mają zastosowanie w każdym badaniu mającym na celu powiązanie „zachowania” sąsiadujących typów komórek w czasie, w tym: 1) seryjnych metod „wychwytywania i uwalniania” (catch and release) do obrazowania dużej liczby ryb w kolejnych dniach, 2) uproszczonych podejść do rozdzielania fluoroforów o nakładających się profilach wzbudzenia/emisji (np. GFP i YFP), 3) wykorzystania linii mutantów hipopigmentowanych w celu wydłużenia okna czasowego dostępnego dla obrazowania o wysokiej rozdzielczości w późnych stadiach rozwoju larwalnego, 4) zastosowania fluorescencyjnych reporterów celowanych w błonę w celu ujawnienia szczegółów morfologicznych pojedynczych komórek, jak i szczegółów komórkowych w większych populacjach komórek oraz 5) wcześniej opisaną metodę chemicznie indukowanej ablacji transgenicznie celowanych typów komórek; tj. konwersji substratów proleków, takich jak metronidazol (MTZ), do pochodnych cytotoksycznych za pośrednictwem nitroreduktazy (NTR) 3,5.
Jako przykład tych podejść, zwizualizujemy ablację i regenerację podtypu neuronów bipolarnych siatkówki u poszczególnych ryb w ciągu kilku dni. Jednocześnie będziemy monitorować kilka innych typów komórek siatkówki, w tym sąsiednie, niedocelowe komórki bipolarne oraz potencjalne komórki macierzyste siatkówki stymulowane degeneracją (tj. glej Mϋllera). Strategia ta jest stosowana w naszym laboratorium w celu charakterystyki odpowiedzi na poziomie komórkowym i tkankowym (np. nisza komórek macierzystych) w reakcji na selektywną utratę i regenerację docelowych typów komórek neuronalnych.

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse żywych larw danio prążkowanego może być wykorzystane do wizualizacji przebiegu procesów biologicznych (pow. przegląd 1). Związek ...

Ekspresja fluorescencyjnych reporterów u zwierząt transgenicznych umożliwia śledzenie odpowiedzi komórkowych na manipulacje eksperymentalne w żywych modelach chorób. W niniejszej pracy u rybek zebrafish farmakologicznie indukuje się selektywną utratę komórek, a następnie wykonuje wielokolorowe obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości. Obrazy komórek docelowych oraz ich bezpośrednich sąsiadów są pozyskiwane bezpośrednio przed i po podaniu leku, a także w określonych odstępach czasu po jego zastosowaniu. Analiza obrazów wykazuje aktywację endogennych populacji komórek macierzystych i następujące po niej zastąpienie komórek docelowych w fazie regeneracji.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii regeneracyjnej, takie jak: jakie są komórkowe i molekularne mechanizmy wykorzystywane do regeneracji poszczególnych typów komórek. Rozpocznij od przeniesienia jaj transgenicznich zebranych z kopulacji do szalki Petriego zawierającej 0,3 x danio solution w 16 godzinach po zapłodnieniu. Dodaj PTU, aby zahamować aktywność tyrozynazy przed pojawieniem się jakichkolwiek oznak pigmentacji w badanej tkance. Jeśli embrion nie jest albinosem, inkubuj embriony w temperaturze 28,5 °C.Gdy reportery staną się widoczne, należy umieścić szalkę Petriego pod fluorescencyjnym stereomikroskopem i wyselekcjonować osobniki z pożądaną ekspresją transgenu. Przed obrazowaniem należy przygotować 0,5% roztwór montażowy aeros low melt w medium do embrionów i przechowywać go w temperaturze 40 °C.W razie potrzeby dodać trica i PTU. Delikatnie wymieszać i powrócić do temperatury 40°C. Znieczulić ryby, umieszczając je w medium do embrionów zawierającym trica.Przez około trzy minuty ryby będą nieaktywne. Aby przenieść ryby za pomocą mikropipety, należy pobrać pojedyncze osobniki do przyciętego końcówki pipety w objętości około 30 µL roztworu anestetyka. Następnie należy odwrócić pipetę i pozwolić rybom opaść na dno.Dotknąć końcówki roztworu montującego i pozwolić mu przenieść się pod wpływem grawitacji. Należy uważać, aby nie rozcieńczyć agaru, tak aby można go było ponownie wykorzystać. Pozostały roztwór anestetyka z mikropipety należy odrzucić.Następnie, używając tej samej końcówki, przenieś rybę do szalki Petriego. W około 30 µl medium montażowego delikatnie ustaw rybę tak, aby obszar zainteresowania znajdował się w centrum kropli aeros. Upewnij się, że ryba pozostaje w pożądanej orientacji aż do momentu zastygnięcia aeros.Jeśli jest taka potrzeba, w jednej szalce Petriego można zamontować wiele ryb. Po zastygnięciu aerosu przenieś ryby na stolik mikroskopu konfokalnego i ostrożnie dolej do szalki medium dla embrionów zawierającego trica plus lub minus PTU, aż ryby zostaną całkowicie zanurzone. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania, aby uzyskać optymalny obraz szczegółów komórkowych i/lub molekularnych.W oprogramowaniu należy użyć obiektywów o dużej odległości roboczej i wysokiej aperturze numerycznej. Z listy rozwijanej należy wybrać odpowiednie filtry fluorochromowe. Kliknij ustawienia widma i dostosuj zakresy emisji.Aby uzyskać czystą separację sygnałów reporterowych i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, należy wybrać odpowiedni obiektyw z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wszelkie zdefiniowane programowo ustawienia wstępne zostały prawidłowo dostosowane. W celu ustawienia ostrości laserów i poziomów mocy, wybierz z tabeli wyszukiwania wyjście, które wykazuje saturację pikseli dla każdego kanału.Następnie należy ustawić czułość detektora, aby uzyskać pożądaną jakość obrazu, stopniowo zwiększając moc lasera, aż natężenie obrazu będzie odpowiednie. Należy unikać nasycenia pikseli w obszarze zainteresowania i utrzymywać poziomy mocy lasera tak nisko, jak to możliwe, aby ograniczyć problemy związane z fotobleachingiem i fototoksycznością.Należy upewnić się, że każda linia lasera generuje wykrywalny sygnał tylko w odpowiednim kanale, ręcznie włączając i wyłączając lasery podczas monitorowania wszystkich kanałów obrazowania. Jeśli nie stwierdzono przesłuchów, wszystkie kanały mogą być rejestrowane jednocześnie. Następnie, korzystając z funkcji zoomu i rotacji, należy wykadrować obszar zainteresowania.Następnie ustaw prędkość skanowania i rozmiar obrazu; zastosowanie większych prędkości skanowania minimalizuje czas przebywania lasera i zwiększa rozdzielczość czasową. Ustaw wielkość kroku w wymiarze Z zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. W tym przypadku zastosowano krok o wielkości 10 mikronów w celu obrazowania siedmiu przekrojów optycznych tkanki siatkówki.Po ustaleniu odpowiednich ustawień należy pozyskać obrazy Zack i zapisać je. Następnie należy przejść do kolejnej ryby. Obrazowanie w systemie seryjnego odłowu i wypuszczenia może być przeprowadzone w celu śledzenia zmian komórkowych w kolejnych dniach, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie pisemnym.Podczas przeprowadzania eksperymentu z obrazowaniem wielu reporterów najlepiej jest stosować fluorofory dobrze odseparowane spektralnie, jednak nie zawsze jest to praktyczne. Przedstawiamy tutaj prostą metodę odejmowania obrazów z wykorzystaniem oprogramowania open source ImageJ, aby rozdzielić fluorofory o nakładających się profilach wzbudzenia i emisji. W naszym przypadku są to GFP i YFP.Techniki obrazowania w czasie rzeczywistym opisane w tym filmie zostały wykorzystane do monitorowania komórek macierzystych siatkówki znakowanych białkiem GFP podczas ablacji i regeneracji neuronów bipolarnych siatkówki. Aby przeprowadzić separację spektralną, należy zarejestrować obrazy w trybach obrazowania sekwencyjnego i przy zmiennych ustawieniach filtrów barierowych, co pozwala na niezależne pozyskiwanie nakładających się fluoroforów i ich częściową separację. Po zarejestrowaniu obrazów należy użyć wtyczki importu plików loci bio w programie ImageJ, aby otworzyć pliki obrazów i uruchomić narzędzie importu. Następnie należy przeciągnąć wybrany plik do okna programu ImageJ.Podziel kanały na poszczególne stosy, zaznaczając pole wyboru „split channels” w oknie importu podczas uruchamiania wtyczki „align three TP”. Kliknij „plugins”, następnie „align stacks”, a potem „align three tp”.Stosy muszą zostać wyrównane, aby zapewnić prawidłowe odejmowanie. W pierwszym polu rozwijanym wybierz stos referencyjny, a w drugim stos niewyrównany. Zaznacz pola use XY relative origin oraz use Z relative origin, a następnie kliknij okay.Aby rozpocząć proces dopasowania, kliknij przycisk rejestracji wolumetrycznej. Pojawi się nowe okno zawierające parametry dopasowania. Kliknij OK.Ta sekcja została zoptymalizowana przez dystrybutora wtyczki, zatem nie są wymagane żadne modyfikacje. Po zakończeniu pojawi się okno z wyrównanymi stosami. Wybierz wynik z wyrównanego okna, aby otworzyć okno wyjściowe.To okno jest również zoptymalizowane i nie wymaga modyfikacji. Kliknij OK. W obszarze roboczym pojawi się nowy stos, a do tytułu pliku zostanie dopisane słowo aligned.Aby usunąć przesłuchy (crosstalk) za pomocą kalkulatora obrazów, kliknij proces, a następnie kalkulator obrazów. W rozwijanym polu obraz jeden wybierz stos obrazów, z którego ma zostać wykonane odjęcie, oraz stos obrazów wykorzystywany do odejmowania. W rozwijanym polu obraz dwa wybierz odejmowanie w polu operacji, a następnie kliknij OK.Program ImageJ zapyta o przetworzenie stosu. Wybierz tak. Powinien pojawić się nowy stos, w którym usunięto przesłuchy między nakładającymi się kanałami.Połącz stosy, aby odtworzyć tę samą strukturę obrazu sprzed wyrównania i odejmowania. Poprzez wybranie połączonych kanałów w oknie narzędzi kanałów, narzędzie to umożliwia połączenie do czterech stosów w tzw. hyperstack. Na koniec nadaj kanałom kolory, dostosuj jasność oraz kontrast i zapisz pliki w formacie tiff, aby zbadać ukierunkowaną utratę i regenerację nitroreduktazy.Retinalne komórki bipolarne wykazujące ekspresję M cherry. Seria obrazów konfokalnych została wykonana w poszczególnych osobnikach danio pręgowanego przed rozpoczęciem zabiegu. Widoczna jest mozaikowa ekspresja reportera YFP z markerem błonowym w kontrolowanych komórkach bipolarnych (kolor żółty) oraz białka fuzyjnego nitroreduktazy z cherry w komórkach bipolarnych docelowych (kolor czerwony).Transgen CFP znakujący błonę, widoczny w kolorze cyjanowym, dostarcza informacji kontekstowych na temat większości pozostałych komórek siatkówki dla zwiększenia przejrzystości. To samo zdjęcie bez sygnału CFP przedstawiono po zastosowaniu metronidazolu. Czerwone komórki dwubiegunowe wykazujące ekspresję nitroreduktazy ulegają zanikowi, podczas gdy żółte komórki dwubiegunowe kontrolne zostają oszczędzone.Obrazuje to wysoką specyficzność tej metody ablacji. Ponownie, dla przejrzystości przedstawiono ten sam obraz bez CFP. Po usunięciu metro NIAZ, w tym miejscu powracają komórki wykazujące ekspresję NTR.Przykład metody odejmowania G-F-P-Y-F-P przedstawiono na tej rycinie: komórki Muellera znakowane GFP. Komórki glejowe są zaznaczone na zielono, a bipolarne komórki znakowane YFP na fioletowo. Nakładanie się obu barwników daje kolor biały, co umożliwia wykonanie odejmowania.Obrazy GFP i YFP muszą zostać najpierw wyrównane. Proces odejmowania pozwala następnie na usunięcie komórek dwubiegunowych znakowanych YFP z obrazu GFP, co umożliwia przejrzystą reprezentację komórek Müllera znakowanych GFP oraz wykrycie słabiej świecących komórek Müllera. Można teraz zweryfikować nakładanie się słabo świecących komórek Müllera oraz komórek dwubiegunowych znakowanych M cherry, przedstawionych na czerwono.Przedstawione tutaj dane sugerują, że ablacja komórek bipolarnych wyzwala komórki glejowe Müllera do zastąpienia utraconych komórek. Interpretacja ta jest zgodna z niedawnymi badaniami nad regeneracją siatkówki, które wskazują na komórki glejowe Müllera jako indukowane urazem komórki progenitorowe zarówno u ssaków, jak i ryb. Technika ta pozwala badaczom badać mechanizmy regulujące regenerację specyficznych typów komórek poprzez wizualizację komórek macierzystych u danio pręgowanego.

multicolor-time-lapse-imaging-transgenic-zebrafish-visualizing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wielokolorowe zdjęcia w czasie rzeczywistym transgenicznych danio rzeczowych: wizualizowanie komórek macierzystych siatkówki aktywowane przez ukierunkowane usuwanie komórek neuronowych

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Źródło: Muto, A., et al. Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego. J. vis. exp. (2018) W tym filmie  Zademonstrowano procedurę dwufotonowej ablacji laserowej, umożliwiającą selektywne niszczenie neuronów fluorescencyjnych w unieruchomionych agarozą larwach danio pręgowanego. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przed i po zabiegu potwierdza skuteczne uszkodzenie neuronów, co obserwuje...

Celowana ablacja neuronów przy użyciu mikroskopii dwufotonowej u danio pręgowanego Larava

Źródło: Lahne, M., et.al. Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera w eksplantatach siatkówki danio pręgowanego osadzonych w agarozie po uszkodzeniu fotoreceptorów wywołanym światłem. Czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α) uwalniany przez uszkodzone fotoreceptory aktywuje komórki glejowe Mullera,...

Obrazowanie żywych komórek migracji jądrowej gleju Mullera podczas regeneracji siatkówki danio pręgowanego

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Poznaj wielokolorowe obrazowanie poklatkowe w transgenicznych danio pręgowanych do badania aktywacji komórek macierzystych siatkówki po celowanej ablacji neuronów. Ta metoda pozwala wizualizować procesy regeneracji nerwów w czasie rzeczywistym.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznego danio pręgowanego: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez celowaną ablację komórek neuronalnych (Wideo) | JoVE Journal

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów