Wielobarwne obrazowanie time-lapse transgenicznych rybek danio: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Ekspresja fluorescencyjnych reporterów u zwierząt transgenicznych umożliwia śledzenie odpowiedzi komórkowych na manipulacje eksperymentalne w żywych modelach chorób. W niniejszym materiale u danio pręgowanego indukuje się farmakologicznie selektywną utratę komórek, a następnie pozyskuje wielokolorowe obrazy konfokalne o wysokiej rozdzielczości komórek docelowych oraz ich najbliższych sąsiadów przed, bezpośrednio po oraz w określonych odstępach czasu po podaniu leku. Analiza obrazów wykazuje aktywację endogennych populacji komórek macierzystych i następujące po niej zastąpienie komórek docelowych w fazie regeneracji.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii regeneracyjnej, takie jak: jakie są komórkowe i molekularne mechanizmy wykorzystywane do regeneracji poszczególnych typów komórek? Należy rozpocząć od przeniesienia jaj transgenicznych, pobranych z par hodowlanych, do szalki Petriego zawierającej 0,3 x roztwór danio w 16 godzinach po zapłodnieniu. Należy dodać PTU w celu zahamowania aktywności tyrozynazy przed pojawieniem się jakichkolwiek oznak pigmentacji w badanej tkance. Jeśli embrion nie jest albinosem, należy inkubować embriony w temperaturze 28,5 °C.

Po pojawieniu się reporterów należy umieścić szalkę Petriego pod fluorescencyjnym stereomikroskopem z zoomem i wyselekcjonować osobniki z pożądaną ekspresją transgenu. Przed obrazowaniem należy przygotować 0,5% roztwór montażowy aeros low melt w medium do embrionów i przechowywać go w temperaturze 40 °C.

W razie potrzeby dodać trica oraz PTU. Delikatnie wymieszać i ponownie inkubować w temperaturze 40 °C. Znieczulić ryby, umieszczając je w medium do embrionów zawierającym trica.

Przez około trzy minuty ryby będą nieodpowiednie na bodźce. Aby dotknąć rybę za pomocą mikropipety, należy pobrać pojedyncze osobniki do przyciętego końcówki pipety w objętości około 30 µL roztworu anestetyka. Następnie należy odwrócić pipetę i pozwolić rybie opaść na dno.

Dotknij końcówki roztworu montującego i pozwól im przenieść się pod wpływem grawitacji. Należy uważać, aby nie rozcieńczyć agaru, aby można go było ponownie wykorzystać. Usuń pozostały roztwór anestetyka z mikropipety.

Następnie, używając tej samej końcówki, przenieś rybę do szalki Petriego. W około 30 µl roztworu montażowego delikatnie ustaw rybę tak, aby obszar zainteresowania znajdował się w centrum kropli aeros. Upewnij się, że ryba pozostaje w pożądanej orientacji do momentu zastygnięcia aeros.

Jeśli jest to pożądane, w jednej szalce Petriego można zamontować kilka ryb. Po zestaleniu aerosu przenieś ryby na stolik mikroskopu konfokalnego i ostrożnie dodaj do szalki medium dla embrionów zawierające trica plus lub minus PTU, aż ryby zostaną całkowicie zanurzone. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania, aby uzyskać optymalny obraz szczegółów komórkowych i/lub molekularnych.

W oprogramowaniu należy użyć obiektywów o dużej odległości roboczej i wysokiej aperturze numerycznej. Z listy rozwijanej wybierz odpowiednie filtry fluorochromowe. Kliknij ustawienia widmowe i dostosuj zakresy emisji.

Aby uzyskać czystą separację sygnałów reporterowych i zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, należy wybrać odpowiedni obiektyw z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wszelkie predefiniowane ustawienia oprogramowania zostały właściwie dostosowane. W celu skupienia laserów i ustawienia poziomów mocy należy wybrać z tabeli wyszukiwania wyjście, które wykazuje saturację pikseli dla każdego kanału.

Następnie należy ustawić czułość detektora, aby uzyskać pożądaną jakość obrazu, stopniowo zwiększając moc lasera, aż intensywność obrazu będzie odpowiednia. Należy unikać nasycenia pikseli w obszarze zainteresowania i utrzymywać poziomy mocy lasera tak nisko, jak to możliwe, aby ograniczyć zjawisko fotobielenia oraz problemy związane z fototoksycznością.

Należy upewnić się, że każda linia lasera generuje wykrywalny sygnał tylko w odpowiednim kanale, ręcznie włączając i wyłączając lasery podczas monitorowania wszystkich kanałów obrazowania. Jeśli nie stwierdzono przenikania sygnałów (crosstalk), wszystkie kanały mogą być rejestrowane jednocześnie. Następnie, za pomocą funkcji przybliżenia i obrotu, należy wykadrować obszar zainteresowania.

Następnie ustaw prędkość skanowania i rozmiar obrazu; zastosowanie większych prędkości skanowania minimalizuje czas przebywania lasera i zwiększa rozdzielczość czasową. Ustaw wielkość kroku w wymiarze Z zgodnie z potrzebami eksperymentowymi. W tym przypadku zastosowano krok o wielkości 10 micronów w celu obrazowania siedmiu przekrojów optycznych tkanki siatkówki.

Po ustaleniu odpowiednich ustawień należy pozyskać obrazy Zack i zapisać je. Następnie przechodzi się do kolejnej ryby. Zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym dokumencie pisanym, można przeprowadzić seryjne obrazowanie w systemie chwytaj i wypuść, aby śledzić zmiany komórkowe w kolejnych dniach.

Podczas przeprowadzania eksperymentu obrazowania z użyciem wielu reporterów najlepiej stosować fluorofory dobrze odseparowane spektralnie, jednak nie zawsze jest to praktyczne. Przedstawiamy tutaj prostą metodę odejmowania obrazów z wykorzystaniem oprogramowania open source ImageJ w celu rozdzielenia fluoroforów o nakładających się profilach wzbudzenia i emisji. W naszym przypadku są to GFP oraz YFP.

Techniki obrazowania w czasie opisane w tym filmie zostały wykorzystane do monitorowania komórek macierzystych siatkówki znakowanych GFP podczas ablacji i regeneracji neuronów bipolarnych siatkówki. Aby przeprowadzić separację spektralną, należy zebrać obrazy, korzystając z trybów obrazowania sekwencyjnego i zmiennych ustawień filtrów barierowych, co pozwala na niezależne pozyskiwanie nakładających się fluoroforów i ich częściową separację. Po pozyskaniu obrazów należy użyć wtyczki importu loci bio w programie ImageJ, aby otworzyć pliki obrazów i uruchomić narzędzie importu. Następnie należy przeciągnąć interesujący plik do okna programu ImageJ.

Podziel kanały na oddzielne stosy za pomocą pola wyboru „split channels” w oknie importowania, aby uruchomić wtyczkę „align three TP”. Kliknij „plugins”, następnie „align stacks”, a potem „align three tp”.

Stosy muszą być wyrównane, aby zapewnić prawidłowe odejmowanie. W pierwszym polu rozwijanym wybierz stos referencyjny, a w drugim stos niewyrównany. Zaznacz pola use XY relative origin oraz use Z relative origin, a następnie kliknij OK.

Aby rozpocząć proces dopasowania, kliknij przycisk rejestracji wolumetrycznej. Pojawi się nowe okno zawierające parametry dopasowania. Kliknij OK.

Ta sekcja została zoptymalizowana przez dystrybutora wtyczki, więc nie są wymagane żadne modyfikacje. Po zakończeniu pojawi się okno z wyrównanymi stosami. Wybierz wynik z wyrównanego okna, aby otworzyć okno wyjściowe.

To okno jest również zoptymalizowane i nie wymaga modyfikacji. Kliknij OK. W obszarze roboczym pojawi się nowy stos z dopiskiem aligned na końcu tytułu pliku.

Aby usunąć przesłuchy (crosstalk) za pomocą kalkulatora obrazów, kliknij proces, a następnie kalkulator obrazów. W rozwijanym menu obraz jeden wybierz stos do odjęcia, a w rozwijanym menu obraz dwa wybierz stos, który ma zostać odjęty. W rozwijanym menu operacji wybierz odejmowanie i kliknij OK.

Program Image J zapyta o przetworzenie stosu. Wybierz tak. Powinien pojawić się nowy stos, w którym usunięto przesłuchy między nakładającymi się kanałami.

Połącz stosy obrazów, aby odtworzyć tę samą strukturę obrazu sprzed wyrównania i odejmowania. Poprzez wybranie połączonych kanałów w oknie narzędzi kanałów, narzędzie to umożliwia połączenie do czterech stosów w tzw. hyper stack. Na koniec nadaj kolor kanałom, dostosuj jasność oraz kontrast i zapisz pliki w formacie tiff, aby zbadać ukierunkowaną utratę i regenerację nitroreduktazy.

Retinalne komórki bipolarne wykazujące ekspresję mCherry. Seria obrazów konfokalnych została wykonana w poszczególnych rybach zebrafish przed rozpoczęciem zabiegu. Widoczna jest mozaikowa ekspresja reportera YFP z markerem błonowym w kontrolowanych komórkach bipolarnych (kolor żółty) oraz białka fuzyjnego nitroreduktazy z cherry w ukierunkowanych komórkach bipolarnych (kolor czerwony).

Oznaczony białkiem CFP transgen błonowy, widoczny w kolorze cyjanowym, dostarcza informacji kontekstowych o większości pozostałych komórek siatkówki dla zwiększenia przejrzystości. Ten sam obraz bez sygnału CFP pokazano po zastosowaniu metronidazolu. Czerwone komórki dwubiegunowe wykazujące ekspresję nitroreduktazy uległy zanikowi, podczas gdy żółte kontrolne komórki dwubiegunowe zostały oszczędzone.

Demonstruje to wysoce specyficzny charakter tej metodologii ablacji. Ponownie, dla jasności przedstawiono ten sam obraz bez CFP. Po usunięciu metro NIAZ, w tym miejscu pojawiają się ponownie komórki wykazujące ekspresję NTR.

Przykład metody subtrakcji G-F-P-Y-F-P przedstawiono na tej figurze GFP labeled Mueller. Komórki GL są zaznaczone na zielono, a komórki bipolarne znakowane YFP na fioletowo. Nakładanie się obu barwników daje kolor biały, co umożliwia wykonanie subtrakcji.

Obrazy GFP i YFP muszą zostać najpierw wyrównane. Proces odejmowania pozwala następnie na usunięcie komórek dwubiegunowych znakowanych YFP z obrazu GFP, co umożliwia przejrzyste przedstawienie komórek Müllera znakowanych GFP oraz wykrycie słabiej fluorescencyjnych komórek Müllera. Można teraz zweryfikować nakładanie się słabo fluorescencyjnych komórek Müllera oraz komórek dwubiegunowych znakowanych M cherry, przedstawionych na czerwono.

Przedstawione tutaj dane sugerują, że ablacja komórek dwubiegunowych wywołuje proces, w którym komórki Müllera zastępują utracone komórki. Interpretacja ta jest zgodna z niedawnymi badaniami nad regeneracją siatkówki, które wskazują na komórki Müllera jako indukowane urazem komórki progenitorowe zarówno u ssaków, jak i ryb. Technika ta pozwala badaczom zgłębiać mechanizmy regulujące regenerację konkretnych typów komórek poprzez wizualizację komórek macierzystych u danio pręgowanego.