In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila
15 października 2010
Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.
W celu zbadania, czy w chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera lub choroba Huntingtona, występują defekty w transporcie aksonalnym na długie dystanse. Przeprowadzono obrazowanie transportu pęcherzyków transportowych w żywej lawie przełykowej. Tutaj zastanawiamy się.
Po trzecie, larwy gwiazd wykazujące ekspresję białka fizycznego znakowanego GFP są wycinane na kostce żelowej, a następnie przenoszone pod mikroskop do obrazowania in vivo. Mikroskopia fluorescencyjna jest następnie wykorzystywana do śledzenia transportu fizycznego w obrębie aksonu. Główną zaletą zastosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość wizualizacji niezakłóconego ruchu pęcherzyków synaptycznych w żywych aksonach larwalnych.
Przygotuj się do sekcji, upewniając się, że następujące materiały i odczynniki są pod ręką. Bufor do sekcji. Kostka z Silgard o wymiarach jeden cal szerokości, jeden cal długości i jeden centymetr wysokości, umieszczona na szkiełku przedmiotowym.
Bardzo krótkie szpilki sekcyjne. Ostry dolny koniec szpilek manum sprawdza się najlepiej podczas sekcji. Odpowiednią długość można uzyskać, wbijając dłuższe szpilki w żel i odcinając wystającą część szpilki.
Będą również potrzebne jedna para ostrych nożyczek do mikrodysekcji oraz dwa zestawy pęset z cienkimi końcówkami. Użyj małej metalowej szpatułki, aby przenieść trzecie stadium larw wędrownych gwiazdy morskiej wykazujących ekspresję białka SLE z tagiem GFP do szalki Petriego.
Następnie zastosuj wodę dejonizowaną na larwy w szalce Petri, aby usunąć cały pokarm. Następnie za pomocą pęsety przenieś je do kostki żelu sekcyjnego w celu przeprowadzenia sekcji na żywo. Użyj pęsety, aby przenieść larwę do kostki żelu sekcyjnego.
Na szkiełko przedmiotowe nanieś bufor do sekcji, aby zanurzyć w nim preparat. Następnie przypnij larwę za pomocą szpilek w części przedniej i tylnej, układając ją grzbietem do góry. Używając nożyczek do mikrodysekcji, wykonaj niewielkie nacięcie w linii środkowej w pobliżu końca tylnego.
Od tego nacięcia wykonaj kolejne cięcie w kierunku przednim. Jelita i ciała tłuszczowe wypłyną na zewnątrz; użyj dwóch szpilek, aby je odsunąć. Przymocuj rozciętą kutykulę za krawędzie boczne do kostki sil-guard.
Użyj pipety, aby dodać kroplę buforu do sekcji. Następnie za pomocą pęsety ostrożnie usuń jelita i ciała tłuszczowe. Przyłóż chusteczkę Kimwipe do jednej strony larwy, aby usunąć bufor, jednocześnie dodając świeży bufor do sekcji za pomocą pipety.
Lawa nie może wyschnąć. Aby oznakować struktury mitochondrialne lub lizosomalne w lawie, należy zastąpić bufor do mikrodysekcji buforem do mikrodysekcji zawierającym mito tracker lub lyo tracker. Umieść kostkę do mikrodysekcji w kwadratowej komorze nawilżeniowej i przykryj ją folią aluminiową.
Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji markera in vivo wielokrotnie odsysać bufor do sekcji otaczający larwy i dodawać świeży bufor do sekcji za pomocą pipety. Powtórzyć tę czynność pięć razy, aby wypłukać pozostałości markera.
Po wymianie ostatniego płukania, wsuń piny całkowicie do osłony S i natychmiast nałóż szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec ruchom larwy. Larwa jest teraz gotowa do obserwacji. Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo wypreparowanej larwy, umieść próbkę na stoliku mikroskopu odwróconego w celu obrazowania znakowanych pęcherzyków.
W obrębie nerwów segmentarnych larwy. Obrazowanie należy przeprowadzić przy użyciu obiektywu 100x. Jeśli w obrazie zwoju brzusznego zaobserwowano silne barwienie GFP w ciałach komórkowych, można jednocześnie obserwować dwa białka znakowane in vivo w nerwach segmentarnych, wykorzystując system podwójnego widoku z filtrami dla C-F-P-Y-F-P lub R-F-P-Y-F-P oraz oprogramowanie do widoku podzielonego.
Na tej serii zdjęć poklatkowych widocznych jest wiele pęcherzyków aksonalnych na wielu torach aksonalnych w obrębie segmentowego nerwu larwalnego. Należy zwrócić uwagę na GFP reprezentujące akumulacje aksonalne oraz na dwukierunkowy ruch pęcherzyków. Tutaj widoczny jest ruch pęcherzyków aksonalnych na pojedynczym torze w obrębie segmentowego nerwu larwalnego.
Należy zauważyć, że ruch dwukierunkowy tych struktur wynosi średnio jeden mikron na sekundę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić czystą sekcję w celu obserwacji in vivo pęcherzyków oznaczonych GFP oraz aksonów larwalnych gso.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sekcję żywych larw Drosophila w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych GFP wzdłuż szlaków mikrotubularnych. Technika ta umożliwia wizualizację niezakłóconego ruchu pęcherzyków synaptycznych w żywych aksonach larwalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Transport aksonalny jest kluczowy dla funkcji neuronów.
- Zaburzenia transportu aksonalnego są powiązane z chorobami neurologicznymi.
- Larwy Drosophila służą jako organizm modelowy do badania tych procesów.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia obserwację ruchu pęcherzyków w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Zbadanie defektów w transporcie aksonalnym na długich dystansach.
- Zrozumienie wpływu tych defektów na choroby neurologiczne.
- Wykorzystanie technik obrazowania na żywo w celu usprawnienia obserwacji.
Zastosowane metody
- Disekcja larw Drosophila wykazujących ekspresję białek znakowanych GFP.
- Przeniesienie zdisekowanych larw do kostki żelowej w celu stabilizacji.
- Obrazowanie in vivo z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
- Śledzenie transportu pęcherzyków w obrębie aksonów.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja transportu aksonalnego w żywych larwach.
- Demonstracja ruchu pęcherzyków znakowanych GFP.
- Wgląd w dynamikę transportu pęcherzyków synaptycznych.
- Porównanie z istniejącymi metodami podkreślające zalety tego podejścia.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie do badania transportu aksonalnego.
- Obrazowanie żywych komórek pozwala na uzyskanie kluczowych informacji na temat funkcji neuronów.
- Metodę tę można zastosować do badania różnych schorzeń neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie dynamiki transportu aksonalnego jest kluczowe dla ograniczania ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w chorobach neurodegeneracyjnych, ponieważ defekty w transporcie pęcherzyków są mechanistycznie powiązane z chorobą Alzheimera, Huntingtona oraz stwardnieniem bocznym zanikowym (ALS). Ten model aksonu larwy Drosophila umożliwia wizualizację ruchu pęcherzyków synaptycznych w czasie rzeczywistym, zapewniając predykcyjny, istotny dla przebiegu choroby system do wczesnej walidacji celów i uzyskania wglądu w mechanizmy chorobowe. Poprzez kwantyfikację dwukierunkowego przepływu pęcherzyków i szybkości transportu, metoda ta wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu (go/no-go) programów przedklinicznych skoncentrowanych na integralności aksonalnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację transportu pęcherzyków APP lub synaptotagminy znakowanych GFP w żywych aksonach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki pęcherzyków w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie defektów transportu z dysfunkcją neuronów w modelach chorobowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy aksonalne do przesiewania związków poprzez ustalenie bazowej ruchomości pęcherzyków w warunkach fizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych odczytów ruchu pęcherzyków (np. dwukierunkowy strumień 1 µm/s) w celu standaryzacji testu.
- Wartość strategiczna: Umożliwia skalowalne, kompatybilne z platformą przepływy pracy w obrazowaniu do oceny wpływu związków na transport aksonalny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu chorób poprzez modelowanie defektów transportu obserwowanych w ludzkich schorzeniach neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki obrazowaniu na żywo transportu pęcherzyków w nienaruszonych nerwach larwalnych.
- Łagodzenie ryzyka: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju poprzez kwantyfikację naprawy lub zaostrzenia transportu przez potencjalne modulatory.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez we wczesnej fazie odkrywania, przygotowanie testów w procesie przesiewowym oraz walidację mechanistyczną w etapach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację transportu pęcherzyków w odpowiedzi na zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanym protokołom sekcji, barwienia i obrazowania, które zapewniają spójne parametry ruchliwości pęcherzyków.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (prędkość, kierunkowość, strumień), które pozwalają na porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie defektów transportu aksonalnego istotnych w kontekście ludzkich chorób neurologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę obrazowania do podłużnych badań integralności aksonów w wielu klasach celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celu poprzez bezpośrednią wizualizację dynamiki pęcherzyków synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym warunkom buforu do sekcji oraz parametrom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w hipotezach dotyczących transportu aksonalnego.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja celów z uwzględnieniem ryzyka, oparta na skuteczności przywrócenia transportu w modelach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z Drosophila, mikrodysekcji oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od użycia mikroskopu odwróconego z obiektywem 100x, systemu dual-view oraz odpowiednich zestawów filtrów dla GFP i innych fluoroforów.
- Konieczna jest standaryzacja buforu do dysekcji, etapowania larw oraz kontroli środowiskowych (komora nawilżana, temperatura).
- Kwestie adaptacyjne obejmują ekspresję różnych ładunków znakowanych GFP (np. mitochondriów, lizosomów) za pomocą neuronalnych driverów GAL4.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas przygotowania larw oraz 2–3 godzinne okno czasowe dla stabilnego transportu pęcherzykowego po dysekcji.
