Name: In vivo (in vivo) Wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w obrębie aksonów segmentowych larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji transportu pęcherzyków aksonalnych w żywych larwach Drosophila przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki synaptycznych pęcherzyków w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG jest wspierany przez fundusze z State University of New York at Buffalo oraz John R. Oishei Foundation.
MK otrzymał wsparcie w ramach Student Research Award przyznanego przez CURCA na UB.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować bufor do sekcji, dodając następujące składniki: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl2, 2mM KCl, 5mM HEPES oraz 36 mM sacharozy do 1000 mL; dostosować pH do 7,2 i poddać sterylizacji przez filtrowanie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do sekcji
<ol>
	<li>Sześcian Siligard: Żel wycina się do rozmiarów około 1 cala szerokości, 1 cala długości i około 1 cm wysokości. Sześcian żelu umieszcza się na szkiełku przedmiotowym podczas sekcji. Sześciany można wykorzystać wielokrotnie.</li>
	<li>Szpilki: Szpilki używane do sekcji muszą być wyjątkowo krótkie. Do sekcji najlepiej nadaje się ostra dolna część szpilek minutien.</li>
	<li>Wymagane są jedne ostre nożyczki sprężynowe do mikrodysekcji.</li>
	<li>Wymagane są dwie pincety z cienkimi końcówkami.</li>
</ol>
3. Zbieranie larw
<ol>
	<li>Błądzenie 3rd larwy w stadium poczwarki wykazujące ekspresję białka pęcherzykowego znakowanego GFP są zbierane na szalkę Petriego.</li>
	<li>Larwy przemywa się wodą dejonizowaną, aby usunąć pozostałości pokarmu.</li>
</ol>
4. Żywa dyssekcja larw
<ol>
	<li>Larwę przenosi się do kostki żelu do sekcji na szkiełku przedmiotowym. Larwę zanurza się w buforze do sekcji.</li>
	<li>Larwę przypina się w części przedniej i tylnej za pomocą dwóch cienkich szpilek, stroną grzbietową do góry.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek do mikrosekcji wykonuje się niewielkie nacięcie w linii środkowej w pobliżu końca tylnego. Od tego nacięcia prowadzi się cięcie w kierunku przednim. Za pomocą dwóch szpilek przypina się rozciętą kutykulę na krawędziach bocznych.</li>
	<li>Dodaje się kroplę buforu do sekcji. Za pomocą pęsety ostrożnie usuwa się przewód pokarmowy, jelita i ciała tłuszczowe. Większość tych tkanek zazwyczaj wypływa podczas cięcia grzbietowego.</li>
	<li>Bufor wymienia się na świeży bufor do sekcji. Larwa nigdy nie powinna wyschnąć i musi stale znajdować się w buforze do sekcji.</li>
	<li>W tym momencie przeprowadza się inkubacje z użyciem markerów in vivo MitoTracker lub LysoTracker, rozcieńczając marker in vivo w buforze do sekcji. Po inkubacji z markerem in vivo zdyssekowaną larwę płucze się kilkukrotnie (5 szybkich płukań) świeżym buforem do sekcji.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu szpilki wciska się w syligard i natychmiast nakłada szkiełko nakrywką. Larwa jest teraz gotowa do obserwacji.</li>
</ol>
5. Obrazowanie na żywo wypreparowanych larw
<ol>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe i żel na stoliku mikroskopu i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu odwróconego.</li>
	<li>Do obrazowania znakowanych pęcherzyków w nerwach segmentowych larw stosujemy obiektyw 100x. W pierwszej kolejności ocenia się ekspresję GFP w ciałach komórek zwoju brzusznego, a następnie przystępuje się do obrazowania nerwów segmentowych. Jeśli w ciałach komórek w zwoju brzusznym zaobserwowano silne barwienie GFP, nerwy są obrazowane i wykorzystywane do oceny.</li>
	<li>Dzięki zastosowaniu systemu podwójnego obrazowania z filtrami dla CFP/YFP lub RFP/YFP oraz oprogramowania do podziału obrazu możemy jednocześnie obrazować dwa znakowane białka in vivo.</li>
</ol> 
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający rozkład białka wzdłuż struktury komórkowej, skala 10 µm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Reprezentatywny obraz przedstawiający liczne pęcherzyki aksonalne na wielu torach aksonalnych w obrębie segmentowego nerwu larwy. Zwróć uwagę na skupiska GFP, reprezentujące akumulacje aksonalne.
<img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy aksonu neuronu z markerami fluorescencyjnymi w skali 10 µm, mikroskopia fluorescencyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Reprezentatywny obraz przedstawiający pojedynczy tor aksonalny z licznymi pęcherzykami aksonalnymi w obrębie segmentowego nerwu larwalnego.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

In vivo obrazowanie transportu pęcherzyków synaptycznych w nerwach segmentowych larw Drosophila jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Wcześniej wykorzystaliśmy ten protokół do oceny dynamiki transportu w nerwach larwalnych wykazujących ekspresję rozszerzonych powtórzeń polyQ, aby wyjaśnić, w jaki sposób rozszerzenie powtórzeń wpływa na dynamikę transportu pęcherzyków 3. Stosując ten protokół, prędkość ruchu pęcherzyków można określić poprzez przekształcenie s...

<table><tbody><tr><td>1 para nożyczek do mikrodisekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Nożyczki sprężynowe &amp;#8211; ostrze 6mm, średnica końcówki 0.125 mm</td></tr><tr><td>2 pary pęset</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pęsety mikro-Adsona do dyssekcji Fisherbrand z ząbkowaną końcówką</td></tr><tr><td>Pudełko szpilek do dyssekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Szpilki Minutien o średnicy 0.1mm</td></tr></tbody></table>

in vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw drosophila

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Wyjaśnienie mechanizmów transportu aksonalnego okazało się niezwykle istotne w określaniu, w jaki sposób defekty w transporcie na duże odległości wpływają na różne choroby neurologiczne. Zaburzenia w tym kluczowym procesie mogą mieć szkodliwy wpływ na funkcjonowanie i rozwój neuronów. Opracowaliśmy protokół sekcji, który został zaprojektowany w celu odsłonięciaDrosophilanerwy segmentowe larw, aby obserwować transport aksonalny w czasie rzeczywistym. Protokół ten, służący do obrazowania na żywo, zaadaptowaliśmy na podstawie metody opublikowanej przez Hurda i Saxtona (1996), stosowanej do immunolokalizacji w nerwach segmentowych larw. Staranna dyssekcja oraz odpowiednie warunki buforu są kluczowe dla maksymalizacji czasu przeżycia wypreparowanych larw. Przy prawidłowym wykonaniu, w dyssekowanych larwach obserwowano intensywny transport pęcherzyków przez 2-3 godziny w warunkach fizjologicznych. Stosujemy metodę UAS-GAL41do ekspresji APP znakowanego GFP lub pęcherzyków synaptotagminy w obrębie pojedynczego aksonu lub wielu aksonów w nerwach segmentowych larw, wykorzystując różne neuronalne linie GAL4. Przed obserwacją larw można zastosować również inne markery znakowane fluorescencyjnie, na przykład do mitochondriów (MitoTracker) lub lizosomów (LysoTracker). Ruch pęcherzyków GFP oraz ruch cząsteczek można obserwować jednocześnie, korzystając z oddzielnych długości fal.

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Wyjaśnienie mechanizmów transportu aksonalnego okazało się bardzo istotne dla określenia, w jaki sposób defekty w transporcie na duże odległości wpływają na różne ...

W celu zbadania, czy w chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera lub choroba Huntingtona, występują defekty w transporcie aksonalnym na długie dystanse. Przeprowadzono obrazowanie transportu pęcherzyków transportowych w żywej lawie przełykowej. Tutaj zastanawiamy się.Po trzecie, larwy gwiazd wykazujące ekspresję białka fizycznego znakowanego GFP są wycinane na kostce żelowej, a następnie przenoszone pod mikroskop do obrazowania in vivo. Mikroskopia fluorescencyjna jest następnie wykorzystywana do śledzenia transportu fizycznego w obrębie aksonu. Główną zaletą zastosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość wizualizacji niezakłóconego ruchu pęcherzyków synaptycznych w żywych aksonach larwalnych.Przygotuj się do sekcji, upewniając się, że następujące materiały i odczynniki są pod ręką. Bufor do sekcji. Kostka z Silgard o wymiarach jeden cal szerokości, jeden cal długości i jeden centymetr wysokości, umieszczona na szkiełku przedmiotowym.Bardzo krótkie szpilki sekcyjne. Ostry dolny koniec szpilek manum sprawdza się najlepiej podczas sekcji. Odpowiednią długość można uzyskać, wbijając dłuższe szpilki w żel i odcinając wystającą część szpilki.Będą również potrzebne jedna para ostrych nożyczek do mikrodysekcji oraz dwa zestawy pęset z cienkimi końcówkami. Użyj małej metalowej szpatułki, aby przenieść trzecie stadium larw wędrownych gwiazdy morskiej wykazujących ekspresję białka SLE z tagiem GFP do szalki Petriego.Następnie zastosuj wodę dejonizowaną na larwy w szalce Petri, aby usunąć cały pokarm. Następnie za pomocą pęsety przenieś je do kostki żelu sekcyjnego w celu przeprowadzenia sekcji na żywo. Użyj pęsety, aby przenieść larwę do kostki żelu sekcyjnego.Na szkiełko przedmiotowe nanieś bufor do sekcji, aby zanurzyć w nim preparat. Następnie przypnij larwę za pomocą szpilek w części przedniej i tylnej, układając ją grzbietem do góry. Używając nożyczek do mikrodysekcji, wykonaj niewielkie nacięcie w linii środkowej w pobliżu końca tylnego.Od tego nacięcia wykonaj kolejne cięcie w kierunku przednim. Jelita i ciała tłuszczowe wypłyną na zewnątrz; użyj dwóch szpilek, aby je odsunąć. Przymocuj rozciętą kutykulę za krawędzie boczne do kostki sil-guard.Użyj pipety, aby dodać kroplę buforu do sekcji. Następnie za pomocą pęsety ostrożnie usuń jelita i ciała tłuszczowe. Przyłóż chusteczkę Kimwipe do jednej strony larwy, aby usunąć bufor, jednocześnie dodając świeży bufor do sekcji za pomocą pipety.Lawa nie może wyschnąć. Aby oznakować struktury mitochondrialne lub lizosomalne w lawie, należy zastąpić bufor do mikrodysekcji buforem do mikrodysekcji zawierającym mito tracker lub lyo tracker. Umieść kostkę do mikrodysekcji w kwadratowej komorze nawilżeniowej i przykryj ją folią aluminiową.Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji markera in vivo wielokrotnie odsysać bufor do sekcji otaczający larwy i dodawać świeży bufor do sekcji za pomocą pipety. Powtórzyć tę czynność pięć razy, aby wypłukać pozostałości markera.Po wymianie ostatniego płukania, wsuń piny całkowicie do osłony S i natychmiast nałóż szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec ruchom larwy. Larwa jest teraz gotowa do obserwacji. Aby przeprowadzić obrazowanie na żywo wypreparowanej larwy, umieść próbkę na stoliku mikroskopu odwróconego w celu obrazowania znakowanych pęcherzyków.W obrębie nerwów segmentarnych larwy. Obrazowanie należy przeprowadzić przy użyciu obiektywu 100x. Jeśli w obrazie zwoju brzusznego zaobserwowano silne barwienie GFP w ciałach komórkowych, można jednocześnie obserwować dwa białka znakowane in vivo w nerwach segmentarnych, wykorzystując system podwójnego widoku z filtrami dla C-F-P-Y-F-P lub R-F-P-Y-F-P oraz oprogramowanie do widoku podzielonego.Na tej serii zdjęć poklatkowych widocznych jest wiele pęcherzyków aksonalnych na wielu torach aksonalnych w obrębie segmentowego nerwu larwalnego. Należy zwrócić uwagę na GFP reprezentujące akumulacje aksonalne oraz na dwukierunkowy ruch pęcherzyków. Tutaj widoczny jest ruch pęcherzyków aksonalnych na pojedynczym torze w obrębie segmentowego nerwu larwalnego.Należy zauważyć, że ruch dwukierunkowy tych struktur wynosi średnio jeden mikron na sekundę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić czystą sekcję w celu obserwacji in vivo pęcherzyków oznaczonych GFP oraz aksonów larwalnych gso.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vivo wizualizację ziarnino synaptycznych wewnątrz Drosophila segmentowych aksonów larw

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Poznaj metodę wizualizacji transportu pęcherzyków aksonalnych w żywych larwach Drosophila przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki synaptycznych pęcherzyków w czasie rzeczywistym.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów