Iniekcja embrionów An. stephensi w celu wytworzenia komarów odpornych na malarię

Co 15 sekund na świecie umiera dziecko z powodu malarii; tutaj, w laboratorium Jamesa, staramy się stworzyć francuskie komary, które nie będą w stanie przenosić pasożytów malarii. Nazywam się TIUs. Przebywam na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, w Katedrze Biologii Molekularnej i Biochemii, w laboratorium Anthony'ego Jamesa.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować transgeniczne i nietransgeniczne linie komórek oka. Robimy to, aby uczynić komary przenoszące malarię odpornymi, tak aby nie mogły one być nosicielami pasożyta malarii. Przygotowałem fiolkę z buforem izotonicznym, w którym komary złożą jaja.

Użyję tego aspiratora, aby odessać komary i umieścić je w probówce. Probówkę tę umieścimy następnie w inkubatorze w temperaturze 30 °C i pozostawimy w niej przez około jedną godzinę. Teraz wyjmiemy igły do mikroiniekcji.

Są to igły wykonane z kwarcu, które muszą posiadać bardzo cienką końcówkę. W związku z tym potrzebujemy wyciągacza do igieł. Używamy wyciągacza do igieł marki Suter Instruments oraz igieł marki Suter Instruments.

Teraz wyjmuję komary i przekładam jaja do szalki Petriego, w której znajduje się papier filtracyjny nasączony buforem izotonicznym; służy on do utrzymania wilgotności embrionów podczas procesu wstrzykiwania. Ilość wody na papierze filtracyjnym jest kluczowa. Jaja nie powinny pływać, ale papier nie może również wyschnąć.

Teraz przeniosę zarodek z papieru do jaj na inny papier Whatman 3 mm, który został namoczony w buforze izotonicznym. Teraz zrobię to, aby usunąć chorion przed ustawieniem ich do mikroiniekcji. Teraz usunę chorion, który jest tą srebrzystą powierzchnią na jajach.

Robię to, usuwając je pędzlem. Tutaj na górze mamy embrion, na którym wciąż znajduje się Corian, a on ma tę srebrzystą, błyszczącą część. Gdzie jest ten poniżej?

Z powodzeniem usunąłem Corian; górna część prawdopodobnie będzie się przesuwać po taśmie, natomiast dolna będzie przylegać. Jest to kluczowe przy wyrównywaniu bocznych krawędzi. Teraz przystępuję do wyrównywania embrionów.

Zarodki są grubsze na końcu przednim, który układam po prawej stronie. Po lewej stronie znajduje się koniec tylny, który jest smuklejszy i w który będę wstrzykiwać zarodki. Staram się ułożyć je razem, aby wzajemnie stabilizowały swoją pozycję.

Zazwyczaj układam około 10 w jednej linii. Mam teraz linię z embrionami i przeniosę je na szkiełko nakrywkę. Na szkiełko nakrywkę.

Przykleiłam taśmę do peruk, aby zapewnić przyczepność. Po zakończeniu tej czynności osuszę papier filtracyjny, na którym znajdują się embriony, używając innego papieru filtracyjnego, następnie przeniosę embriony na szkiełko nakrywkę i pozostawię do wyschnięcia na 30 s przed nałożeniem oleju. Obecnie embriony zostały ustawione w jednej linii i znajdują się pod warstwą oleju.

Na stoliku mikroskopu wstrzykniemy DNA zmieszane z barwnikiem spożywczym, używając do tego specjalnej końcówki wzoru mikrobów, a następnie wprzeprowadzimy tę substancję do igieł w porcie. Teraz, gdy igła jest wypełniona, umieścimy ją z powrotem w mikroinjektorze. Jesteśmy teraz gotowi do przeprowadzenia mikroiniekcji.

Teraz przesuwam igłę, aby ją wyostrzyć i uzyskać ostry obraz. Po wykonaniu tej czynności przesuwam igłę kontrolną, następnie przesuwam zarodki i również je ustawiam w ostrości. Gdy to zostanie zrobione, ponownie przesuwam igłę, aż znajdzie się w odpowiedniej pozycji, a następnie przesuwam ją w stronę zarodków.

Gdy igła przechodzi przez olej, obraz staje się niewyraźny i należy go ponownie ustawić. Więc to jest dokładnie ten moment. Dokładnie, ten moment.

Teraz jestem gotowy do wykonania iniekcji. Widać, że dotknąłem igłą embrionu, a robiąc to, przerwałem napięcie powierzchniowe w końcówce, co spowodowało wydzielenie się małej kropli, która zostanie wstrzyknięta do embrionu. Tutaj wykonuję iniekcję, a następnie wyjmuję igłę.

Za każdym razem, pomiędzy kolejnymi embrionami, sprawdzam, czy na końcówce igły pojawia się mała kropla. Jak widać, przy każdym embrionie muszę skorygować ustawienie, aby uzyskać idealną pozycję. W tym przypadku nastąpił wyciek.

Jak widać, podczas drugiego wstrzyknięcia w oleju pęcherzyk staje się bardzo duży i muszę ponownie dostosować ciśnienie mikroinjektora. Zakończyliśmy teraz mikroiniekcje i przeniesiemy zarodki z mikroskopu do szalki Petriego wypełnionej buforem izotonicznym. Zetrę olej z szkiełka nakrywkowego i odetnę mały fragment, który umieszczę w szalce Petriego.

Teraz pozostawimy je tutaj w temperaturze pokojowej do końca dnia. Następnie przeniesiemy je do insekterium. Dzisiaj pokazałem Państwu, jak wykonać wstrzyknięcie do przeciwstawnej strony, aby uzyskać przejściowe komary.

Teraz musimy jedynie poczekać, aż wszystkie larwy się wyklują. Hodujemy je do stadium dorosłego, po czym nastąpi proces kojarzenia. Następnie będziemy czekać trzy tygodnie, zanim będziemy mogli rozpocząć przesiew w celu sprawdzenia, czy są to re-factor, czy nie.