Name: Myszy transjądrowe z predefiniowaną specyficznością receptora limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane za pośrednictwem SCNT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj metodę SCNT do generowania myszy transgenicznych z predefiniowanymi specyficznościami receptora TCR przeciwko Toxoplasma gondii. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie modeli do badań nad odpowiedzią immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są wdzięczni H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao oraz G. Yap za owocne dyskusje i odczynniki. Dziękujemy J. Dausman, R. Flannery oraz J. Jackson za pomoc w zarządzaniu kolonią myszy. Dziękujemy P. Wisniewski za przeprowadzenie sortowania FACS. EMF otrzymał wsparcie z programu Human Frontiers Science Program. R.J. otrzymał wsparcie z grantów National Institute of Health RO1-HD045022 oraz R37-CA084198. HLP otrzymał wsparcie z grantów National Institute of Health.

Metoda ta została zastosowana w badaniach opisanych w pracy <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a>.
1. Izolacja komórek dawcy
Zanim specyficzne limfocyty T lub B zostaną wykorzystane jako komórki donora do generowania transnuklearnych modeli mysich, myszy muszą zostać zainfekowane odpowiednim patogenem lub uodpornione za pomocą odpowiedniego antygenu. Ponieważ w naszych badaniach wykorzystaliśmy komórki CD8+ specyficzne dla Toxoplasma gondii, poniższy protokół opisuje generowanie i izolację tych komórek; należy go dostosować w zależności od konkretnych potrzeb badawczych.
<ol>
 <li>Cysty pochodzące z homogenatu mózgu mysiego (około 40) są wstrzykiwane do jamny brzusznej myszy BL/6 x Balb/c F1 (B6CF1), co umożliwia izolację limfocytów T CD8+ z ograniczeniem do H-2b oraz H-2d.</li>
 <li>W szczycie odpowiedzi immunologicznej zakażoną mysz uśpiono, izolując śledzionę i umieszczając ją w naczyniu zawierającym 6 mL buforu do lizy erytrocytów (RBC).</li>
 <li>Przy użyciu matowych stron dwóch szkiełek nakrywkowych śledzionę ostrożnie rozdrabnia się i inkubuje w buforze do lizy RBC przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Należy dodać 14 mL PBS, przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki typu Falcon o pojemności 50 mL i wirować przez 5 min przy 300g.</li>
 <li>Po usunięciu supernatantu osad komórkowy resuspenduje się w 1 mL PBS i przenosi do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 mL. Następnie wiruje się przez 5 min przy 300g i ponownie usuwa supernatant.</li>
 <li>Osad komórkowy resuspenduje się w 50 μL PBS, a do zawiesiny komórkowej dodaje przeciwciała znakowane fluorescencyjnie w celu identyfikacji interesującego typu komórek (np. CD3, B220, CD8 i CD4) oraz znakowany fluorescencyjnie tetramer MHC-I (tetramer MHC-II dla limfocytów T CD4) z załadowanym odpowiednim peptydem, a następnie inkubuje przez 30 min w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Należy dodać 1 mL PBS, wirować przez 5 min przy 300 g, resuspender osad w 3 ml PBS i przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki.</li>
 <li>Należy przeprowadzić sortowanie FACS, ustawiając bramki w sposób rygorystyczny (Rysunek 1B).</li>
</ol>
2. Transfer jądra komórki somatycznej
Istnieje kilka protokołów transferu jąder komórek somatycznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu wykorzystuje oocyty zatrzymane w metafazie II oraz hamowanie drugiego podziału mejotycznego przy użyciu cytochalazyny B. W związku z tym wymagane są komórki dawcy znajdujące się w fazie G0/G1.
<ol>
 <li>Przygotowanie oocytów
 <ol>
 <li>Samicom myszy o pochodzeniu BDF1 wstrzykuje się dopłciennie 5IU PMS na mysz w godzinach od 17:00 do 19:00.</li>
 <li>Około 47 godzin później każdej myszy wstrzykuje się dopłciennie 5IU HCG.</li>
 <li>W dniu wstrzyknięcia HCG przygotowuje się naczynie hodowlane (krople KSOM-AA pod warstwą oleju) dla oocytów i umieszcza je w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO2. Należy również przygotować igły niezbędne do SCNT (7μm do enukleacji oraz 4 lub 5μm do transferu jąder limfocytów), wypełniając je rtęcią.</li>
 <li>Myszami uśmierca się i izoluje jajowody około 13 godzin po podaniu HCG (około godziny 8:00). Jajowody zbiera się w 1-2 kroplach HCZB.</li>
 <li>Jajowody przenosi się pojedynczo do kropli zawierającej M2 z hialuronidazą. Jajowód ostrożnie nacinamy pęsetą i przenosimy kompleks oocyt-cumulus do kropli. Po wyizolowaniu wszystkich kompleksów oocyt-cumulus naczynie inkubuje się w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Po 2-5 minutach (dokładny czas zależy od partii hialuronidazy) zbiera się oocyty, przemywa w HCZB i nanosi na krople KSOM-AA.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Enukleacja oocytów
 <ol>
 <li>Do przygotowania płytki SCNT należy użyć pokrywki od szalki Petriego. Następnie ustawia się mikroskop oraz mikromanipulator.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem enukleacji igłę do enukleacji (7 μm) przemywa się w PVP.</li>
 <li>Do enukleacji grupę oocytów (10-30) umieszcza się w kropli HZCB z cytochalazyną B (5 μg/mL). Podczas inkubacji (minimum 5 min) oocyty ustawia się w linii poziomej.</li>
 <li>Pobiera się jeden oocyt i umieszcza go przed igłą trzymającą. Oocyt unieruchamia się na igle trzymającej poprzez zastosowanie próżni. Za pomocą igły do enukleacji obraca się oocyt, aż kompleks wrzeciono-chromosomy (CSC, często nazywany „jądrem”) znajdzie się na pozycji godziny 3:00.</li>
 <li>Za pomocą impulsu piezoelektrycznego ostrożnie przebija się zonę pellucida, nie uszkadzając oocytu. Otwór igły umieszcza się obok wrzeciona w stadium metafazy II i stosuje się próżnię. „Jądro” powinno powoli przesunąć się do wnętrza igły, a błona powinna zamknąć się automatycznie po jego całkowitym usunięciu.</li>
 <li>Enukleowane oocyty przenosi się z powrotem do kropli KSOM-AA i wielokrotnie przemywa. Kroki enukleacji powtarza się dla nowej grupy oocytów. Czynność kontynuuje się, aż wszystkie komórki zostaną enukleowane lub do około godziny 11:00.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Transfer jąder
 <ol>
 <li>W celu wykonania transferu jąder wymienia się igłę do enukleacji (7 μm) na igłę do transferu jąder (4 lub 5 μm) i przemywa ją w PVP.</li>
 <li>Analizowane komórki (np. limfocyty T CD8+) umieszcza się w kropli z PVP, dobrze miesza i inkubuje przez minimum 10 min.</li>
 <li>Grupę enukleowanych oocytów (10-30) umieszcza się w kropli HCZB z cytochalazyną B (2,5 μg/mL). Podczas inkubacji (min. 5 min) oocyty ustawia się poziomo za pomocą igły do transferu jąder.</li>
 <li>Z zawiesiny komórek w PVP pobiera się komórkę dawcy i aspiruje ją wielokrotnie, aż do rozpadu błony zewnętrznej (powinny być widoczne fragmenty błony i cytozolu). W razie potrzeby można zastosować impuls piezoelektryczny. Po wyizolowaniu jądra przesuwa się je nieco w górę igły i kontynuuje pobieranie jąder, aż uzyska się ich 10-30.</li>
 <li>Przenosi się do kropli z ustawionymi enukleowanymi oocytami. Jeden oocyt unieruchamia się na igle trzymającej za pomocą próżni. Igłę do transferu jąder (jądra powinny znajdować się w pewnej odległości od otworu) umieszcza się przy zonie pellucida i stosuje impulsy piezoelektryczne, aż igła przejdzie przez zonę pellucida. Ostrożnie przesuwa się jedno jądro do czubka igły, wsuwa igłę do wnętrza oocytu, aż jej czubek znajdzie się w 2/3 głębokości. Stosuje się niewielkie podciśnienie, aby niewielka część błony oocytu znalazła się w igle.</li>
 <li>Kolejny krok jest krytyczny, ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie „otwarty”. Stosuje się pojedynczy impuls piezo, wypycha się jądro z igły za pomocą nadciśnienia, ostrożnie wycofuje igłę, tak aby jej czubek znajdował się w około 1/3 oocytu, a następnie stosuje się podciśnienie i kontynuuje wycofywanie igły, aby zamknąć oocyt. Krok ten powtarza się dla każdego oocytu.</li>
 <li>Po otrzymaniu jądra przez wszystkie oocyty w grupie, są one przemywane i hodowane w medium KSOM-AA. Procedurę powtarza się dla wszystkich oocytów.</li>
 <li>Po inkubacji ostatniej grupy w KSOM-AA przez minimum 30 min, embriony SCNT przenosi się do kropli medium aktywacyjnego wolnego od Ca, zawierającego SrCl2.</li>
 <li>Po 6 godzinach aktywacji określa się liczbę embrionów SCNT z obecnością pseudo-prądzierzy (PPN). Następnie embriony są przemywane i hodowane w kroplach KSOM-AA przez dodatkowe 3,5 dnia, aż osiągną stadium blastocysty.</li>
 <li>Do mediów aktywacyjnych i hodowlanych można dodać wybrane leki lub związki chemiczne (takie jak Trichostatin A).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Pozyskiwanie embrionalnych komórek macierzystych
Blastocysty powstałe w wyniku SCNT można wykorzystać albo do transferu do pseudaciążowych samic (znane również jako klonowanie bezpośrednie lub jednowstępowe), albo do pozyskania embrionalnych komórek macierzystych (znane również jako klonowanie pośrednie lub dwustępowe). Ze względu na znacznie wyższą efektywność generowania komórek ES, wybieramy procedurę dwustępową. W przypadku, gdy badacza interesuje klonowanie bezpośrednie, blastocysty mogą zostać przeniesione bezpośrednio do pseudaciążowych samic, zgodnie z opisem w sekcji 5.
Istnieje wiele protokołów opisujących metodę otrzymywania embrionalnych komórek macierzystych. Opisana tutaj technika jest metodą standardową, w której wykorzystuje się komórki karmione oraz płodową surowicę bydlęcą.
<ol>
 <li>Drugiego dnia po transferze jąder przygotuj płytkę 96-dołkową z dołkami w kształcie U do wyprowadzenia komórek ES.</li>
 <li>Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodaj 100 μL żelatyny, inkubuj przez co najmniej 10 min, a następnie usuń ją z dołków.</li>
 <li>Rozmroź komórki zasilające i resuspenduj w odpowiedniej objętości medium ESD; na przykład komórki zasilające odpowiadające powierzchni 25 cm2 resuspenduje się w 10 mL medium ESD, a następnie 200 μL zawiesiny komórkowej dodaje się do każdego dołka potraktowanego żelatyną.</li>
 <li>Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj w temperaturze 37°C, przy 5% CO2.</li>
 <li>Po 3,5 dniach zarodki powinny osiągnąć stadium blastocysty.</li>
 <li>Przygotuj sterylną szalkę bakteriologiczną, nanosząc kilka kropel medium do komórek ES oraz kwasowego roztworu tyrode.</li>
 <li>Blastocysty przenieś najpierw z kropel KSOM-AA do kropel zawierających standardowe medium do komórek ES i przemyj dwukrotnie.</li>
 <li>Ostrożnie przenieś grupę blastocyst (5-10 sztuk) do jednej kropli kwasowego roztworu tyrode i pozostaw w niej do czasu rozpuszczenia błony przejrzystej (zona pellucida).</li>
 <li>Następnie przenieś blastocysty do kropli z medium ES, przemyj dwukrotnie, a następnie umieść w płytce 96-dołkowej z dołkami w kształcie U pokrytej komórkami zasilającymi (jedna blastocysta na jeden dołek).</li>
 <li>Zarodki hoduj następnie przez 5-7 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO2, nie zakłócając ich wzrostu. Pozwala to zarodkowi przytwierdzić się do warstwy zasilającej i utworzyć wypustkę (outgrowth).</li>
 <li>Przygotuj płytki 24-dołkowe, nanosząc do każdego dołka komórki zasilające w medium ESD; na przykład resuspenduj komórki zasilające odpowiadające powierzchni 50 cm2 w 12 mL medium ESD i dodaj 500 μL zawiesiny komórkowej do każdego dołka.</li>
 <li>Ostrożnie usuń medium ESD z płytki 96-dołkowej z zarodkami, przemyj każdy dołek dwukrotnie 250 μL Hepes (lub PBS), dodaj 50 μL trypsyny i inkubuj przez około 5 min w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Pipetuj zawiesinę wielokrotnie w górę i w dół, aż wypustka rozpadnie się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, przenieś ją do płytki 24-dołkowej i inkubuj w temperaturze 37°C, przy 5% CO2.</li>
 <li>Jeśli wyprowadzenie ESC zakończyło się sukcesem, kolonie ESC powinny być widoczne po 7-10 dniach.</li>
</ol>
4. Iniekcja do blastocysty
Iniekcja blastocyst jest rutynową techniką służącą do generowania dowolnego rodzaju transgenicznego modelu mysiego. Należy zaznaczyć, że iniekcja blastocyst i następujący po niej transfer do samic w stanie pseudociąży muszą być odpowiednio zsynchronizowane czasowo.
<ol>
 <li>Przygotuj samice myszy poprzez podanie PMS i HCG zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Po iniekcji HCG umieść samice razem z samcami (jedna samica i jeden samiec na klatkę).</li>
 <li>Następnego dnia sprawdź obecność czopów pochwowych u samic. Dzień ten uznaje się za 0,5dpc (dni po kopulacji).</li>
 <li>Zapłodnione embriony są następnie izolowane z jajowodów zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i hodowane w KSOM-AA przez kolejne 3 dni.</li>
 <li>Przygotuj komórki ES w dniu iniekcji blastocyst (3,5dpc).</li>
 <li>Usuń medium z komórek ES, przemyj je dwukrotnie roztworem Hepes (lub PBS), dodaj trypsynę i inkubuj przez 5 min w 37°C.</li>
 <li>Resuspenduj trypsynizowane komórki w medium ES, wysiej na szalkę i inkubuj przez 45-60 min w 37°C, 5% CO2, aby zredukować liczbę komórek feeder (komórki feeder przylegają szybciej niż komórki ES).</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki i wiruj przez 5 min przy 1000rpm.</li>
 <li>Usuń nadosad, resuspenduj osad komórkowy w 500 μL medium ES i przechowuj na lodzie do czasu użycia.</li>
 <li>Przygotuj pokrywkę sterylnej szalki bakteriologicznej, nanosząc krople zawierające PVP oraz HCZB.</li>
 <li>Przygotuj igłę 15 μm, ładując ją rtęcią, ustawiając w odpowiedniej pozycji i przemywając PVP.</li>
 <li>Umieść grupę blastocyst (10-30 blastocyst) w kropli z HCZB, a do drugiej kropli HCZB dodaj 5-50 μL zawiesiny komórek ES (zależnie od stężenia).</li>
 <li>Pobierz komórki ES (50-100 komórek) za pomocą igły do iniekcji.</li>
 <li>Przejdź do kropli z blastocystami. Ustaw blastocysty poziomo i unieruchom jedną z nich igłą trzymającą, stosując podciśnienie.</li>
 <li>Używając igły do iniekcji, obracaj blastocystę, aż masa komórkowa wewnętrzna (ICM) znajdzie się na pozycji godziny 9.</li>
 <li>Umieść igłę do iniekcji na pozycji godziny 3, upewnij się, że na końcówce igły nie ma komórek ES, i stosuj impuls piezoelektryczny, aż igła do iniekcji przebije zonę pellucida i trofektodermę, wnikając do blastocele.</li>
 <li>Wprowadź kilka komórek ES (5-15 komórek), tak aby przywarły do ICM. Kontynuuj, aż wszystkie blastocysty w grupie zostaną zainfekowane komórkami ES.</li>
 <li>Po zakończeniu procedury dla jednej grupy blastocyst, przemyj je dwukrotnie w KSOM-AA i przechowuj w kropli z KSOM-AA, aż wszystkie blastocysty zostaną poddane iniekcji.</li>
</ol>
5. Transfer embrionów
Transfer embrionów do samic w stanie pseudociąży jest procedurą chirurgiczną, która musi być przeprowadzona bardzo starannie i zgodnie z wytycznymi instytutu badawczego.
<ol>
 <li>Zanurz myszy biorczynie w narkozie, ogól prawy dolny kwadrant brzucha i zdezynfekuj obszar zabiegu.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek rozetnij skórę i oddziel otrzewną od skóry.</li>
 <li>Zlokalizuj jajnik przez otrzewną (czerwony punkt) i rozetnij otrzewną w bezpośrednim sąsiedztwie jajnika.</li>
 <li>Używając pęsety, ostrożnie chwyć jajowód i wyciągnij macicę.</li>
 <li>Pobierz grupę około 10 blastocyst za pomocą kapilary połączonej z pipetą ustną.</li>
 <li>Ustabilizuj macicę jedną pęsetą, wykonaj w niej mały otwór za pomocą cienkiej igły i wprowadź kapilarę z blastocystami do światła macicy.</li>
 <li>Ostrożnie wprowadź embriony do macicy, a następnie wyjmij kapilarę.</li>
 <li>Wprowadź macicę z powrotem do jamy brzusznej.</li>
 <li>Zlokalizuj brzegi otrzewnej i zamknij ją za pomocą kilku szwów.</li>
 <li>Zamknij skórę myszy za pomocą kilku zszywek.</li>
 <li>W celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego podaj 5 μg Carprofen na mg masy ciała.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Wykres wydajności klonowania; wykres słupkowy porównujący wskaźniki SCNT, PPN i ESC przy zastosowaniu leczenia TSA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Transfer jąder komórek somatycznych zdefiniowanych wcześniej limfocytów T w tle B6CF1. Bezwzględna i względna liczba embrionów uzyskanych z limfocytów T CD8+ oraz embrionalnych komórek macierzystych pochodzących z blastocyst SCNT.
<img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej analizujące interakcje CD8 i tetrameru MHC-I; wykres przedstawia wyniki dla chimer." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływowa myszy chimerycznych po wstrzyknięciu embrionalnych komórek macierzystych uzyskanych metodą SCNT. Bramka i liczba (procent w stosunku do całkowitej liczby limfocytów T CD8+) wskazują na obecność specyficznych limfocytów T CD8+ w myszach chimerycznych.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

Złożono wniosek patentowy.

Wykazaliśmy tutaj, że SCNT może być wykorzystane do generowania myszy transjądrowych z limfocytów T o zdefiniowanej specyficzności. Chociaż nie zostało to tutaj przedstawione, technika ta powinna być również możliwa do zastosowania w celu generowania myszy transjądrowych z limfocytów B o zdefiniowanej specyficzności.
Ważnym aspektem jest wybór szczepu i płci myszy, która zostaje zainfekowana lub zimmunizowana w celu izolacji interesujących nas limfocytów T lub B. Ze względu na to, że limfocyty T i B wykazują ogólnie bardzo niską wydajność reprogramowania, zalecamy stosowanie hybryd F1 o pożądanym haplotypie. Ponieważ komórka dawcy determinuje również płeć, zalecamy stosowanie limfocytów T lub B pochodzących od samców myszy. Oznacza to, że tylko samce myszy chimerowych przekazywałyby TCR lub BCR w linii zarodkowej, a hodowla samców myszy jest łatwiejsza i szybsza. Biorąc to wszystko pod uwagę, uważamy, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą SCNT stanowi potężne narzędzie do tworzenia nowego rodzaju modeli mysich, co będzie ogromną zaletą dla dziedziny immunologii.

<table><tbody><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Sito do separacji komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>surowica z klaczy w ciąży (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmórkowa (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Typ IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Podłoże dostosowane</td></tr><tr><td>Pożywka bez jonów Ca do aktywacji</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Pożywka dostosowana*</td></tr><tr><td>SrCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100 mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>Przygotować 10% roztwór z wykorzystaniem HCZB i dodać 0,1% AlbuMAX I</td></tr><tr><td>Cytochalasyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Trichostatyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5 mM = 1000x</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Trzymanie igły</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Igły do wstrzykiwania i transferu</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta ustna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>lub coś podobnego</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>lub coś podobnego</td></tr><tr><td>Aplikator do klipsów do ran</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Klamry do ran</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Szycie</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>płytkim serum wołowe (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200 mM = 100x</td></tr><tr><td>Aminokwasy nieesencjalne</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l w 500 ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>inhibitor MEK</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9900L</td><td>Wyłącznie w przypadku wyprowadzania komórek ES, dodać do pożywki ES (stężenie końcowe 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów t przeciwko toxoplasma gondii uzyskane poprzez scnt

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Limfocyty, takie jak limfocyty T, przechodzą genetyczną rekombinację V(D)J w celu wygenerowania receptora o określonej specyficzności1. Myszy transgeniczne pod względem zreorganizowanego, swoistego antygenowo receptora limfocytów T (TCR) stanowią niezastąpione narzędzie w badaniu rozwoju i funkcji limfocytów T. Jednakże takie TCR są zazwyczaj izolowane z odpowiednich limfocytów T po długotrwałej hodowli, często następującej po wielokrotnej stymulacji antygenem, co nieuchronnie prowadzi do selekcji limfocytów T o wysokim powinowactwie. Losowa integracja genomiczna łańcuchów α i β TCR oraz ekspresja z promotorów nieendogennych mogą prowadzić do różnic w poziomie i kinetyce ekspresji.
Przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) stanowi narzędzie pozwalające na generowanie embrionalnych komórek macierzystych oraz myszy z dowolnej wybranej komórki. W konsekwencji, gdy SCNT jest stosowane do limfocytów T o znanej swoistości, genetyczne rearanżacje V(D)J są przenoszone do embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) powstałych w wyniku SCNT oraz do pochodzących z nich myszy, podczas gdy markery epigenetyczne zostają zresetowane. Wykazaliśmy, że limfocyty T o zdefiniowanej swoistości przeciwko Toxoplasma gondii mogą być wykorzystane do generowania modeli mysich wykazujących ekspresję swoistego TCR z ich locus endogennych, bez wprowadzania eksperymentalnych modyfikacji genetycznych. Stosunkowa łatwość i szybkość, z jaką można uzyskać takie modele transjądrowe, dają nadzieję na konstruowanie innych modeli chorób.

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Limfocyty, takie jak komórki T, przechodzą genetyczną rekombinację V(D)J w celu wygenerowania receptora o określonej specyficzności1. Myszy transgeniczne pod kątem przerearanżowanego ...

Myszy transgeniczne z antygenowo swoistymi receptorami limfocytów T są niezbędne w badaniach nad rozwojem i funkcją limfocytów T w celu generowania modeli mysich o zdefiniowanej swoistości receptorów limfocytów T z wykorzystaniem transferu jąder komórek somatycznych lub SCNT. Myszą zaraża się wybrany patogen. Następnie izoluje się limfocyty T z organizmu myszy, a następnie oczyszcza je za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją.Oczyszczone limfocyty T są następnie wykorzystywane do transferu jąder komórek somatycznych. Po osiągnięciu przez embriony stadium blastocysty izolowane są embrionalne komórki macierzyste. Komórki te są następnie wstrzykiwane do blastocyst, które są transferowane do myszy w stanie pseudociąży.W wyniku otrzymane szczenięta wykazują wyraźny wzrost zainteresowanej populacji limfocytów T, co można potwierdzić za pomocą analizy PAX. Witajcie, nazywam się Okta AK i jestem pracownikiem postdoktorem w Instytucie Badań Biomedycznych White. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić somatyczne zastrzyki wspomagające blastocyty z transferem CLE, a także transfer embrionów.Główną zaletą transferu somatycznego jest możliwość szybkiego generowania modeli mysich, które wykazują ekspresję receptora limfocytów T z locus endogennego, a tym samym pod kontrolą promotora endogennego. Somatyczny transfer w formie płynnej może służyć jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanej specyficzności receptora limfocytów T lub receptora limfocytów B. Jest to szczególnie interesujące dla badaczy zajmujących się takimi dziedzinami jak autoimmunologia, choroby zakaźne oraz nowotwory.W celu izolacji limfocytów T specyficznych dla patogenu, takiego jak Toxoplasma gondii, myszy zainfekowano drogą doglebową w szczycie odpowiedzi immunologicznej. Śledzionę wyizolowano z uśpionej myszy, a następnie wyizolowano homogenizat komórek dawcy i inkubowano go z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie oraz odpowiednim tetramerem. Na koniec przeprowadzono sortowanie komórek w celu uzyskania limfocytów T specyficznych dla patogenu. Wieczorem przed procedurą enukleacji oocytów.Przygotować igły do iniekcji piso o średnicach czterech, pięciu i siedmiu mikrometrów, wykorzystując strzykawkę do ich wstecznego napełnienia rtęcią. Następnego dnia rozpocząć protokół transferu jąder komórek somatycznych od pobrania oocytów, a następnie za pomocą pipety ustnej przenieść je do kropel pożywki K-S-O-M-A-A w szalce Petriego. W pokrywce szalki Petriego.Przygotuj płytkę do wykonania transferu jąder komórek somatycznych lub SCNT, nakładając około 10 kropli PVP, około 10 kropli HCZB zawierającego 5 µg/mL cyto B oraz około 10 kropli HCCB zawierającego 2,5 µg/mL cyto B. Płytka ta będzie określana jako płytka S-C-N-T-A. Umieść płytkę S-C-N-T-A na stoliku odwróconego mikroskopu złożonego.Następnie umieść igłę do enukleacji o średnicy 7 µm w mikromanipulatorze i przemyj ją, pobierając i odrzucając roztwór PVP od 5 do 10 razy. Następnie przenieś od 10 do 30 oocytów zatrzymanych w metafazie II z płytki Petri do jednej z kropel HCCB z 5 µg/mL Cyto B na płytce S-C-N-T-A; inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a w trakcie inkubacji ustaw oocyty poziomo.Po upływie pięciu minut należy użyć igły do enukleacji, aby umieścić oocyt przed igłą trzymającą. Za pomocą mikroinkubatora należy zastosować podciśnienie, aby przymocować oocyt do mikropipety igły trzymającej.Następnie, używając igły do enukleacji, obracaj oocyt, aż kompleks wrzeciona chromosomowego, który w porównaniu do oplazmy wydaje się hiperprzezroczysty, znajdzie się na pozycji godziny trzeciej, a następnie zainicjuj impuls piezoelektryczny, naciskając pedał, aby przebić zno lucita. Impuls piezoelektryczny to impuls mechaniczny, który rozchodzi się wzdłużnie i powoduje wibracje końcówki igły do enukleacji. Wibracje końcówki ułatwiają przebicie się przez zop lucita.Po przebiciu błony przejrzystej należy umieścić otwór igły do nukleacji obok wrzeciona metafazy II i zastosować podciśnienie. Kompleks wrzeciona chromosomowego powoli przesunie się do wnętrza igły. Po wyjęciu igły błona powinna ulec samouszczelnieniu.Na koniec, za pomocą pipety ustnej, przenieś enukleowane cyty z powrotem do kropel K-S-O-M-A-A. Następnie, używając tej samej pipety, przemyj je, przenosząc je z kropli do kropli KSOM AA. Aby przeprowadzić transfer jądra, wymień igłę do enukleacji o średnicy 7 µm w mikromanipulatorze na igłę do transferu jądra o średnicy od 4 do 5 µm. Przemyj igłę PVP w taki sam sposób jak poprzednio.Nanieś osiem wyizolowanych wcześniej pozytywnych limfocytów T CD w kropli PVP na płytkę S-C-N-D-A. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś od 10 do 30 ENUCLEATED cytes w kropli HCZB z stężeniem 2,5 micrograms per milliliter.Inkubować Cyto B na płytce S ct. przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W czasie inkubacji ułożyć cyty poziomo, używając do tego igły do transferu jąder oraz igły do iniekcji.Pobierz komórkę dawcy CD8+ z pożywki PVP i aspiruj ją wielokrotnie, aż błona zewnętrzna ulegnie rozpadowi. W razie potrzeby zastosuj impuls piezoelektryczny; widoczne powinny być fragmenty błony i cytozolu. Wciągnij jądro komórkowe do igły.Następnie kontynuuj pobieranie jąder, aż zostanie od 10 do 30 sztuk. Dalej przejdź do kropli zawierającej wyrównane enukleowane oocyty. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować jeden oocyt do igły trzymającej.Następnie należy umieścić igłę do transferu jąder NU obok zop lucita, tak aby jądra były skierowane w stronę przeciwną do otworu. Stosuj impulsy piezoelektryczne, aż igła przejdzie przez zop lucita. Używając mikromanipulatora, ostrożnie przesuń jedno jądro na czubek igły.Wsuń igłę do oocyta, aż jej końcówka znajdzie się w dwóch trzecich jego szerokości. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby fragment błony oocyta znalazł się wewnątrz igły. Następny krok jest krytyczny.Ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie otwarty, należy podać pojedynczy impuls ZO. Następnie należy zastosować nadciśnienie, aby wypchnąć jądro komórkowe z igły.Ostrożnie wycofaj igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się w około jednej trzeciej głębokości oocyta, następnie przyłóż podciśnienie i kontynuuj wycofywanie igły, aby uszczelnić oocyt. Powtórz ten krok dla każdego oocyta.Po tym, jak wszystkie oocyty otrzymają jądro, przenieś je do szalki Petriego i wypłucz, przenosząc je z kropli do kropli medium KS OM AA inkubowanego w temperaturze 37°C przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji przenieś embriony SCN T do kropli medium aktywującego wolnego od wapnia, zawierającego chlorek strontu. Chlorek strontu aktywuje oocyt poprzez indukcję oscylacji wapnia, które występują w podobny sposób podczas zapłodnienia.Inkubować przez sześć godzin. W razie potrzeby do pożywki aktywacyjnej dodać TSA, który jest nieswoistym inhibitorem deacetylazy histonowej. Aby ocenić wydajność po aktywacji, zbadać embriony pod mikroskopem odwróconym w celu określenia liczby pseudojąderek lub embrionów SCNT dodatnich pod kątem PPN. PPN można zidentyfikować na podstawie ich wyglądu.Wyglądają jak jaja. Mycie i hodowla „na słoneczną stronę”. Zarodki i krople K-S-O-M-A-A przez trzy i pół dnia w temperaturze 37 °C, aż osiągną stadium blastocysty.Na początku należy skupić się na prawidłowym wykonaniu zaprezentowanych wcześniej procedur nukleacji oraz transferu jąder NU. Po opanowaniu tych technik łatwiej będzie przeprowadzić kolejne etapy. Wykorzystane embrionalne komórki macierzyste (ES) zostały wyhodowane przy użyciu standardowych metod.Należy przygotować je w dniu wstrzyknięcia wspomaganego blastem, trzy i pół dnia po kopulacji. Przygotuj pokrywkę sterylnej szalki bakteriologicznej, nakładając krople zawierające PVP oraz HCZP. Następnie przygotuj igłę wstrzykiwającą o średnicy 15 mikrometrów do impulsu piso, analogicznie jak poprzednio.Następnie umieść igłę do iniekcji w mikromanipulatorze i przemyj ją, wykonując od 10 do 30 impulsów w kropli HCZB. Następnie nanieś od 5 do 50 µL zawiesiny ESL do drugiej kropli HCZB.Liczba komórek ES powinna być taka, aby można było je łatwo pobrać, lecz nie powinny być one zbyt gęsto rozmieszczone. Następnie, za pomocą igły do mikroiniekcji, pobierz od 30 do 100 komórek ES. Przenieś je do kropli z blast assist.Ustaw uchwyt do blastocysty poziomo i unieruchom go za pomocą igły mocującej, stosując podciśnienie. Użyj igły do iniekcji, aby obracać uchwyt, aż masa komórkowa wewnętrzna znajdzie się na godzinie dziewiątej. Umieść igłę do iniekcji na godzinie trzeciej.Upewnij się, że na końcówce igły nie znajdują się żadne komórki ES, a następnie przykładaj impulsy piezoelektryczne, aż igła wstrzykująca przebije zonę pellucida i trofektodermę, docierając do jamniowej blastocysty. Wprowadź od pięciu do 15 komórek ES w taki sposób, aby przywarły do wewnętrznej masy komórkowej. Kontynuuj proces, aż wszystkie blastocysty zostaną zainfekowane. Po zakończeniu iniekcji.Przemyć dwukrotnie w K-S-O-M-A-A, a następnie przystąpić do chirurgicznego transferu embrionów do pseudyciążnych samic. Umieścić zanurkowaną w znieczuleniu mysz biorczynę w stanie pseudo-ciąży w obszarze operacyjnym. Za pomocą golarki elektrycznej usunąć sierść z prawego dolnego kwadrantu. Zdezynfekować ten obszar, używając roztworu na bazie jodu oraz 70% etanolu pod mikroskopem stereoskopowym.Za pomocą nożyczek rozciąć skórę, następnie wprowadzić zamknięte nożyczki pomiędzy skórę a otrzewną i rozchylić je, aby oddzielić otrzewną od skóry. Zlokalizować jajnik przez otrzewną; powinien on być widoczny jako czerwona plamka. Następnie za pomocą nożyczek rozciąć otrzewną w tym obszarze.Używając pęsety, ostrożnie chwyć UCT lub otaczającą tkankę tłuszczową i wyciągnij macicę za pomocą kapilary połączonej z pipetą ustną. Pobierz grupę około 10 blastocyst, trzymając jajowód i macicę pęsetą. Użyj igły, aby nakłuć mały otwór w macicy.Następnie wprowadź kapilarę z blastocystą do światła macicy i zwolnij ją. Wsuń macicę z powrotem do jamy brzusznej. Zlokalizuj brzegi otrzewnej i zamknij je za pomocą kilku szwów.Zamknąć skórę myszy za pomocą kilku zszywek. Podać podskórnie lek przeciwbólowy. Następnie przenieść mysz z powrotem do klatki pod lampę grzewczą.Monitoruj oddychanie myszy aż do momentu jej wybudzenia. Po enukleacji i transferze jąder komórek somatycznych około 70% embrionów wykazało obecność pseudojąderek.Jak pokazano na tej rycinie. Leczenie TSA przez 6 lub 10 godzin nie wywołało żadnego efektu. Po trzech i pół dniach hodowli od 5 do 10% embrionów przekształciło się w blastocysty.Ponownie, dodatek TSA nie wpłynął na tempo rozwoju blastocyst. Blastocysty uzyskane metodą SCNT wykorzystano następnie do wyprowadzenia embrionalnych komórek macierzystych. TSA znacząco poprawiło odsetek uzyskania ESL z blastocyst.Komórki S-C-N-T-E-S są wykorzystywane do generowania myszy chimerycznych. Z myszy tych pobiera się krew i analizuje pod kątem obecności specyficznych limfocytów T przy użyciu analizy FACS, zgodnie z przedstawioną procedurą. Po zabarwieniu krwi przeciwciałem anty-CDA oraz specyficznym tetramerem można zidentyfikować populację podwójnie dodatnią.Wskazuje to, że komórka dawcy wykorzystana do SCNT miała odpowiednią specyficzność. Przedstawiłem właśnie sposób przeprowadzania transferu LU z komórek somatycznych, iniekcji wspomagających blastocysty oraz transferu zarodków. Najważniejszym punktem do rozważenia jest czystość populacji limfocytów T lub B.Po opanowaniu techniki transferu somatycznego i uzyskaniu embrionów w stadium blastocysty, można zdecydować o ich bezpośrednim transferze do samic w stanie pseudociąży lub wykorzystaniu ich do wyodrębnienia embrionalnych komórek macierzystych oraz generowania myszy chimerycznych.

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Myszy transnuklearne z wstępnie zdefiniowanymi specyficznościami receptorów komórek T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane za pomocą SCNT

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zobrazować odcinki mózgu myszy zainfekowane pasożytem Toxoplasma gondii o grubości 160 μm, co umożliwia wizualizację i analizę przestrzennego związku między pasożytem otorbiającym a zainfekowanym neuronem.

Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Przedstawiamy szybki i elastyczny protokół dla systemu ekspresji in vivo opartego na pojedynczym receptorze limfocytów T (TCR).  Wektory retrowirusowe są wykorzystywane do transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu zbadania rozwoju i funkcji pojedynczych komórek T in vivo jako alternatywy dla myszy transgenicznych TCR.

Transdukcja retrowirusowa komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia myszy retrogenicznych receptora komórek T

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Poznaj metodę SCNT do generowania myszy transgenicznych z predefiniowanymi specyficznościami receptora TCR przeciwko Toxoplasma gondii. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie modeli do badań nad odpowiedzią immunologiczną.

Myszy transjądrowe z predefiniowaną specyficznością receptora limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane za pośrednictwem SCNT (Wideo) | JoVE Journal

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Przeglądaj więcej filmów