Myszy transjądrowe z predefiniowaną specyficznością receptora limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane za pośrednictwem SCNT

Myszy transgeniczne pod kątem receptorów limfocytów T specyficznych dla antygenu były niezbędne w badaniach nad rozwojem i funkcją komórek T w celu generowania modeli myszy z predefiniowaną specyficznością receptora komórek T przy użyciu transferu jądra komórki somatycznej lub SCNT. Mysz jest zarażona interesującym ją patogenem. Limfocyty T są izolowane od myszy, a następnie oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie.

Oczyszczone limfocyty T są następnie wykorzystywane do transferu jądra komórki somatycznej. Po tym, jak zarodki osiągną stadium blastów, embrionalne komórki macierzyste są izolowane. Komórki te są następnie wstrzykiwane do blast assist, które są następnie przenoszone do myszy w ciąży rzekomej.

Powstałe w ten sposób młode wykazują wyraźny wzrost populacji limfocytów T, który można potwierdzić za pomocą analizy PAX. Cześć, nazywam się Okta AK i jestem postoc w Białym Instytucie Badań Biomedycznych. Dzisiaj pokażę Ci, jak wykonać somatyczne wstrzyknięcia wspomagające transfer CLE, a także transfer embr.

Główną zaletą transferu somatycznego jest to, że można generować modele mysie, które wyrażają swój receptor limfocytów T z endogennego locus, a zatem pod kontrolą endogennego promotora i że modele myszy mogą być generowane bardzo szybko. Somatyczny transfer cieczy może być używany jako narzędzie do generowania modeli myszy z predefiniowaną specyficznością receptora limfocytów T lub receptora komórek B. Jest to szczególnie interesujące dla osób pracujących w tej dziedzinie, takiej jak autoimmunizacja, choroby zakaźne i nowotwory.

Aby wyizolować limfocyty T specyficzne dla patogenu, takiego jak Toxoplasma Gandhi, skąpiec zakażony przez wstrzyknięcie dootrzewnowe w szczytowym momencie odpowiedzi immunologicznej, śledziona jest izolowana od myszy poddanej eutanazji, a następnie izolowane są homogenizowane komórki dawcy i inkubowane z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami i odpowiednim tetramerem. Na koniec przeprowadza się sortowanie faktów w celu uzyskania limfocytów T specyficznych dla patogenu. Wieczór przed zabiegiem enukleacji oocytów.

Przygotuj cztery, pięć i siedem mikrometrowych igieł do wstrzykiwań pio za pomocą strzykawki, aby wstecznie załadować je rtęcią. Następnego dnia rozpocznij protokół transferu jądra komórki somatycznej od pobrania oocytów, a następnie za pomocą pipety doustnej przenieś je do kropli pożywki K-S-O-M-A-A na szalce Petriego. W pokrywie szalki Petriego.

Przygotuj się do przeprowadzenia transferu jądra komórki somatycznej lub SCNT, umieszczając około 10 kropli PVP. Około 10 kropli HCZB zawierających pięć mikrogramów na mililitr cyto B i około 10 kropli HCCB zawierających 2,5 mikrograma na mililitr cyto B. Ta płytka będzie określana jako płytka S-C-N-T-A. Umieść płytkę S-C-N-T-A na stoliku odwróconego mikroskopu złożonego.

Następnie umieść siedmiomikrometrową igłę wyłuszczenia w mikromanipulatorze i umyj ją, wycofując się do roztworu PVP pięć do 10 razy. Następnie przenieś od 10 do 30 metafaz dwóch zatrzymanych cytów z szalki Petriego do jednej z kropli HCCB z pięcioma mikrogramami na mililitr. Cyto B na płytce S-C-N-T-A inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej podczas inkubacji, ustawić oocyty poziomo

Po upływie pięciu minut. Użyj igły wyłuszczenia, aby umieścić oocyt przed igłą podtrzymującą. Za pomocą mikrowstrzykiwacza zastosuj podciśnienie, aby przymocować oocyt do igły przytrzymującej mikropipetę.

Następnie, za pomocą igły wyłuszczenia, obróć oocyt, aż kompleks wrzeciona chromosomowego, który wydaje się hiperprzezroczysty w porównaniu z plazmą op, znajdzie się w pozycji godziny trzeciej, zainicjuj impuls pizo, naciskając pedał, aby wniknąć w zno lucita. Impuls pizo to impuls mechaniczny, który przemieszcza się wzdłużnie i wibruje końcówkę igły zarodkowania. Wibracje końcówki pomagają w wierceniu przez zop lucita.

Po przejściu przez zona palita umieść otwór igły zarodkowania w pobliżu wrzeciona metafazy drugiej i zastosuj próżnię. Kompleks wrzeciona chromosomowego będzie powoli przemieszczał się do igły. Po wyjęciu igły membrana powinna się uszczelnić.

Na koniec za pomocą pipety doustnej przenieś wyłuszczone cyty z powrotem do kropli K-S-O-M-A-A. Następnie za pomocą tej samej pipety umyj je, przenosząc je z kropli na kroplę KSOM AA Aby wykonać wymianę transferu jądrowego, siedmiomikrometrową igłę enukleacyjną na mikromanipulatorze z igłą do przenoszenia jądra od czterech do pięciu mikrometrów. Umyj igłę PVP jak poprzednio.

Umieść CD osiem dodatnich limfocytów T wyizolowanych wcześniej w kropli PVP na płytce S-C-N-D-A. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś od 10 do 30 wyłuszczonych cytów do kropli HCZB o stężeniu 2,5 mikrograma na mililitr.

Cyto B na S ct. Na płytce inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji należy użyć igły do przenoszenia jądra komórkowego, aby ustawić cyty poziomo za pomocą igły do wstrzykiwań.

Podnieś ósmą dodatnią komórkę CD dawcy z pożywki PVP i zasysaj ją i odsysaj, aż błona zewnętrzna ulegnie uszkodzeniu. W razie potrzeby należy zastosować impuls pizo fragmenty błony i cytozolu powinny być widoczne. Wciągnąć jądro do igły.

Następnie kontynuuj zbieranie jąder, aż będzie ich od 10 do 30. Następnie przejdź do kropli zawierającej wyrównane wyłuszczone cyty. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować jedną komórkę jajową do igły do trzymania.

Następnie umieść igłę do przenoszenia jądra NU w pobliżu zop lucita z jądrami skierowanymi od otworu. Stosuj impuls pizo, aż igła przejdzie przez zop lucita. Naciśnij mikromanipulator, aby ostrożnie przesunąć jedno jądro do końcówki igły.

Wbić igłę do komórki jajowej, aż końcówka igły znajdzie się w dwóch trzecich wewnątrz. Zastosuj niewielki podciśnienie, aby niewielka część błony oocytów znalazła się w igle. Następny krok jest bardzo ważny.

Ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie otwarty. Zastosuj pojedynczy impuls ZO. Następnie zastosuj nadciśnienie, aby wypchnąć jądro z igły.

Ostrożnie odciągnij igłę, tak aby końcówka znajdowała się około jednej trzeciej długości w oocycie, a następnie zastosuj podciśnienie i kontynuuj odciąganie igły. Aby uszczelnić oocyt. Powtórz ten krok z każdym oocytem.

Po tym, jak wszystkie oocyty otrzymają jądro, przenieś je na szalkę Petriego i umyj, przenosząc je z kropli do kropli pożywki KS OM AA inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji przenieść zarodki SCN T do kropli pożywki aktywacyjnej wolnej od wapnia zawierającej chlorek strontu. Chlorek strontu aktywuje oocyt poprzez indukowanie oscylacji wapnia, które wystąpiłyby podobnie podczas zapłodnienia.

Inkubować przez sześć godzin. W razie potrzeby ADD TSA, który jest niespecyficznym inhibitorem azy diacetylu histonów do pożywki aktywacyjnej Aby poprawić wydajność po aktywacji, zbadaj zarodki pod mikroskopem odwróconym w celu określenia ilości pseudo przedjądrzy lub zarodków SCNT dodatnich PPN. PPN można zidentyfikować na podstawie ich wyglądu.

Wyglądają jak jajka. Mycie i kultura słoneczną stroną do góry. Zarodki i K-S-O-M-A-A upuszczają przez trzy i pół dnia w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną etap asysty wybuchowej.

Na początku powinieneś skupić się na prawidłowym wykonaniu procedur, które właśnie pokazaliśmy Ci dla zarodkowania i transferu jądra NU. Po opanowaniu tych technik łatwiejsze jest zarządzanie następującymi procedurami: Zastosowane embrionalne komórki macierzyste lub ES. Tutaj zostały uzyskane przy użyciu standardowych technik.

Powinny one być przygotowane w dniu wstrzyknięcia wspomaganego blastem, trzy i pół dnia po cotus. Przygotuj pokrywkę sterylnego naczynia bakteryjnego, posiewając krople zawierające PVP i HCZP. Następnie przygotuj igłę do wstrzykiwań o średnicy 15 mikrometrów do impulsu piso, tak jak poprzednio.

Następnie umieść igłę iniekcyjną w mikromanipulatorze i umyj ją transferem PVP. 10 do 30 wybuchów pomaga w kropli HCZB. Następnie umieść od pięciu do 50 mikrolitrów zawiesiny ESL w kolejnej kropli HCZB.

Powinno być wystarczająco dużo komórek ES, aby można je było łatwo podnieść, ale nie powinny być zatłoczone. Następnie należy pobrać od 30 do 100 komórek ES za pomocą igły do wstrzykiwań. Przenieś się do zrzutu z asystą wybuchu.

Ustaw środek wspomagający strumieniowanie w poziomie i zamocuj go za pomocą igły przytrzymującej, stosując podciśnienie. Użyj igły do wstrzykiwań, aby obrócić układ wspomagający nadmuchiwanie, aż wewnętrzna masa komórek znajdzie się na godzinie dziewiątej. Umieścić igłę do wstrzykiwań na godzinie trzeciej.

Upewnij się, że na końcu igły nie ma komórek ES i zastosuj impuls piso, aż igła do wstrzykiwania przebije się przez zop lucita i trifecta do uszczelki blastycznej. Uwolnij od pięciu do 15 komórek ES, aby przykleiły się do wewnętrznej masy komórkowej. Kontynuuj, aż wszystkie środki wspomagające nadmuchiwanie zostaną wstrzyknięte po zakończeniu wstrzyknięć.

Umyte dwukrotnie w K-S-O-M-A-A i przystąpić do chirurgicznego transferu zarodka do miejsca pseudo ciężarnych samic i znieczulonej pseudociężarnej myszy biorczyni w obszarze operacyjnym. Za pomocą golarki elektrycznej usuń włosy z prawego dolnego kwadrantu. Zdezynfekuj obszar za pomocą roztworu na bazie jodu i 70% etanolu pod mikroskopem preparacyjnym.

Użyj nożyczek, aby otworzyć skórę, a następnie umieść zamknięte nożyczki między skórą a otrzewną i otwórz je, aby oddzielić otrzewną od skóry. Zlokalizuj jajnik przez otrzewną, która powinna wyglądać jak czerwona plama. Następnie użyj nożyczek, aby otworzyć otrzewną w tym obszarze.

Użyj kleszczy, aby ostrożnie chwycić UCT lub otaczający tłuszcz i wyciągnąć macicę za pomocą kapilary połączonej z pipetą doustną. Podnieś grupę około 10 asyst wybuchowych trzymających jajowód i macicę za pomocą kleszczy. Użyj igły, aby przebić mały otwór w macicy.

Następnie włóż kapilary z asystą nadmuchową do światła macicy i uwolnij je. Wepchnij macicę z powrotem do jamy brzusznej. Zlokalizuj krawędzie otrzewnej i zamknij ją kilkoma szwami.

Zamknij skórę myszy kilkoma zszywkami. Leki przeciwbólowe podawać podskórnie. Następnie przenieś mysz z powrotem do klatki pod lampą grzewczą.

Monitoruj oddech myszy, dopóki się nie obudzi. Po enukleacji i transferze jądra komórki somatycznej. Około 70% zarodków było dodatnich na rzekome przedjądrza.

Jak pokazano na tym rysunku. Leczenie TSA przez 6 lub 10 godzin nie przyniosło żadnego efektu. Po trzech i pół dniach w hodowli od 5 do 10% zarodków przekształciło się w blast assist.

Ponownie, dodanie TSA nie miało wpływu na tempo rozwoju asysty wybuchowej. Asysta blastyczna SCNT została następnie wykorzystana do uzyskania embrionalnych komórek macierzystych. TSA znacznie poprawiło tempo, w jakim ESL były uzyskiwane z asysty przy wybuchu.

Komórki S-C-N-T-E-S są używane do generowania chimerycznych myszy. Krew jest pobierana od tych myszy i analizowana pod kątem obecności określonych limfocytów T za pomocą analizy faktów, jak pokazano tutaj. Gdy krew jest zabarwiona przeciwciałem anty CDA i specyficznym tetramerem, można zidentyfikować podwójnie dodatnią populację.

Wskazanie, że komórka dawcy użyta do SCNT miała prawidłową swoistość. Właśnie pokazałem Ci, jak przeprowadzić transfer LU do komórek somatycznych, zastrzyki wspomagające blasty i transfer zarodków. Najważniejszą kwestią do rozważenia jest czystość limfocytów T lub limfocytów B.

Kiedy już nauczysz się, jak przeprowadzać transfer somatyczny, a twoje zarodki znajdą się w fazie blastu, możesz wybrać między przeniesieniem ich bezpośrednio do pseudociężarnych samic lub wykorzystaniem ich do uzyskania embrionalnych komórek macierzystych i wyhodowania chimerycznych myszy.