Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Myszy transgeniczne z antygenowo specyficznymi receptorami limfocytów T stały się niezastąpione w badaniu rozwoju i funkcji limfocytów T w celu generowania modeli mysich o zdefiniowanej specyficzności receptorów T przy użyciu transferu jąder komórek somatycznych (SCNT).

Oczyszczone limfocyty T są następnie wykorzystywane do transferu jąder komórek somatycznych. Po osiągnięciu przez embriony stadium blastocysty izolowane są embrionalne komórki macierzyste. Komórki te są następnie wstrzykiwane do blastocyst, które następnie przenosi się do myszy pseudociążnych.

Otrzymane potomstwo wykazuje wyraźny wzrost zainteresowanej populacji limfocytów T, co można potwierdzić analizą PAX. Witam, nazywam się Okta AK i jestem pracownikiem postdoktoralnym w White Institute for Biomedical Research. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzać iniekcje wspomagające blastocyty przy transferze somatycznego CLE, a także transfer embrionów.

Główną zaletą transferu somatycznego jest możliwość szybkiego tworzenia modeli mysich wykazujących ekspresję receptora limfocytów T z locus endogennego, a tym samym pod kontrolą promotora endogennego. Transfer somatyczny może służyć jako narzędzie do generowania modeli mysich o zdefiniowanej swoistości receptora limfocytów T lub B. Jest to szczególnie istotne dla badaczy zajmujących się takimi dziedzinami jak autoimmunologia, choroby zakaźne oraz onkologia.

Aby wyizolować limfocyty T swoiste dla patogenu, takiego jak Toxoplasma gondii, mysz zakażoną poprzez wstrzyknięcie doszpikowe w szczycie odpowiedzi immunologicznej uśpiono i pobrano z niej śledzionę, a następnie wyizolowano homogenizowane komórki donora i inkubowano je z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie oraz odpowiednim tetramerem. Na koniec przeprowadzono sortowanie FACS, aby uzyskać limfocyty T swoiste dla patogenu. Wieczorem przed procedurą enukleacji oocytów.

Przygotować igły do iniekcji piso o średnicach czterech, pięciu i siedmiu mikrometrów, wykorzystując strzykawkę do ich wstecznego napełnienia rtęcią. Następnego dnia rozpocząć protokół transferu jąder komórek somatycznych od pobrania oocytów, a następnie przy użyciu pipety ustnej przenieść je do kropli pożywki K-S-O-M-A-A w szalce Petriego. W pokrywie szalki Petriego.

Przygotuj płytkę do przeprowadzenia transferu jądra komórki somatycznej (SCNT), nakładając około 10 kropli PVP, około 10 kropli HCZB zawierającego 5 µg/mL cyto B oraz około 10 kropli HCCB zawierającego 2,5 µg/mL cyto B. Płytka ta będzie określana jako płytka S-C-N-T-A. Umieść płytkę S-C-N-T-A na stole mikroskopu odwróconego.

Następnie umieść igłę do enukleacji o średnicy 7 µm w mikromanipulatorze i przemyj ją, aspirując i wydmuchując roztwór PVP do naczynia z odpadami od 5 do 10 razy. Następnie przenieś od 10 do 30 oocytów zatrzymanych w metafazie II z szalki Petriego do jednej z kropli HCCB z dodatkiem 5 µg/ml Cyto B na płytce S-C-N-T-A i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej; podczas inkubacji ustaw oocyty poziomo.

Po upływie pięciu minut użyj igły do enukleacji, aby umieścić oocyt przed igłą trzymającą. Za pomocą mikroinjektora zastosuj podciśnienie, aby przymocować oocyt do mikropipety z igłą trzymającą.

Następnie, używając igły do enukleacji, obróć oocyt tak, aby kompleks wrzeciona chromosomowego, który w porównaniu do op plazmy wydaje się hiperprzezroczysty, znajdował się na pozycji godziny trzeciej, a następnie wywołaj impuls piezoelektryczny, naciskając pedał, aby przebić zno lucita. Impuls piezoelektryczny to impuls mechaniczny, który rozprzestrzenia się wzdłużnie i powoduje wibracje końcówki igły do enukleacji. Wibracje końcówki ułatwiają przebicie się przez zop lucita.

Po przebiciu błony przejrzystej należy umieścić otwór igły do nukleacji obok wrzeciona metafazy II i zastosować podciśnienie. Kompleks wrzeciona chromosomowego powoli przesunie się do wnętrza igły. Po wyjęciu igły membrana powinna samoistnie się zamknąć.

Na koniec, za pomocą pipety ustnej przenieś enukleowane cyty z powrotem do kropel K-S-O-M-A-A. Następnie, używając tej samej pipety, przemyj je, przenosząc je z kropli do kropli KSOM AA. Aby przeprowadzić transfer jądra, wymień igłę do enukleacji o średnicy 7 µm na mikromanipulatorze na igłę do transferu jądra o średnicy 4–5 µm. Przemyj igłę roztworem PVP w taki sam sposób jak poprzednio.

Umieść osiem wyizolowanych wcześniej pozytywnych limfocytów T CD w kropli PVP na płytce S-C-N-D-A. Wymieszaj dokładnie i inkubuj przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś od 10 do 30 ENUKLEOWANYCH cytocytów do kropli HCZB o stężeniu 2,5 µg/mL.

Cyto B na płytce S ct. A inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji za pomocą igły do transferu jąder ułożyć cyty poziomo, wykorzystując igłę do iniekcji.

Pobierz komórkę dawcy CD8+ z podłoża PVP i zasysaj ją oraz wypuszczaj, aż błona zewnętrzna ulegnie rozpadowi. Jeśli jest to konieczne, zastosuj impuls piezoelektryczny; widoczne powinny być fragmenty błony oraz cytozol. Wciągnij jądro komórkowe do igły.

Następnie kontynuuj pobieranie jąder, aż ich liczba wyniesie od 10 do 30. Dalej przejdź do kropli zawierającej ustawione enukleowane cyty. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować jeden oocyt do igły trzymającej.

Następnie umieść igłę do transferu jąder NU obok zop lucita, tak aby jądra były skierowane w stronę przeciwną do otworu. Stosuj impulsy pizo, aż igła przebije zop lucita. Przesuń mikromanipulator, aby ostrożnie przesunąć jedno jądro do końcówki igły.

Wsuń igłę do oocytu, aż jej czubek znajdzie się w dwóch trzecich jego wnętrza. Zastosuj niewielkie podciśnienie, aby fragment błony oocytu znalazł się wewnątrz igły. Kolejny krok jest krytyczny.

Ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie otwarty, należy przyłożyć pojedynczy impuls ZO. Następnie należy zastosować nadciśnienie, aby wypchnąć jądro z igły.

Ostrożnie cofnij igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się w około jednej trzeciej głębokości oocyta, a następnie przyłóż podciśnienie i kontynuuj wycofywanie igły w celu zamknięcia oocyta. Powtórz ten krok dla każdego oocyta.

Po wprowadzeniu jąder do wszystkich oocytów, przenieś je do szalki Petriego i przemyj, przenosząc je z kropli do kropli pożywki KS OM AA inkubowanej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut. Po inkubacji przenieś embriony SCN T do kropli pożywki aktywacyjnej pozbawionej wapnia, zawierającej chlorek strontu. Chlorek strontu aktywuje oocyt poprzez indukowanie oscylacji wapnia, które zachodzą analogicznie podczas zapłodnienia.

Inkubować przez sześć godzin. W razie potrzeby do pożywki aktywacyjnej można dodać TSA, który jest nieswoistym inhibitorem deacetylaz histonowych. Aby zwiększyć efektywność po aktywacji, należy zbadać embriony pod mikroskopem odwróconym, aby określić liczbę pseudojąder lub embrionów SCNT dodatnich pod kątem PPN. PPN można zidentyfikować na podstawie ich wyglądu.

Wyglądają jak jaja. Pranie i hodowla metodą „sunny side up”. Zarodki i krople K-S-O-M-A-A przez trzy i pół dnia w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż osiągną stadium blastocysty.

Na początku należy skupić się na prawidłowym wykonaniu zaprezentowanych procedur nukleacji oraz transferu jąder NU. Po opanowaniu tych technik, poniższe procedury stają się łatwiejsze do przeprowadzenia. Wykorzystane tutaj embrionalne komórki macierzyste (ES) uzyskano przy użyciu standardowych metod.

Należy je przygotować w dniu wstrzykiwania wspomaganego blastem, trzy i pół dnia po kopulacji. Przygotuj pokrywkę sterylnej szalki bakteriologicznej, nakładając krople zawierające PVP oraz HCZP. Następnie przygotuj igłę wtryskową o średnicy 15 mikrometrów do impulsu piso, tak jak wcześniej.

Następnie umieść igłę do iniekcji w mikromanipulatorze i przemyj ją za pomocą transferu PVP. Wykonaj od 10 do 30 impulsów wspomagających w kropli HCZB. Następnie nanieś od 5 do 50 µL zawiesiny ESL do drugiej kropli HCZB.

Liczba komórek ES powinna być wystarczająca, aby można było je łatwo pobrać, ale nie powinny być one zbyt gęsto rozmieszczone. Następnie za pomocą igły do iniekcji pobierz od 30 do 100 komórek ES. Przenieś je do kropli z blast assist.

Ustaw blastocystę w płaszczyźnie poziomej i unieruchom ją za pomocą igły trzymającej, stosując podciśnienie. Używając igły do iniekcji, obracaj blastocystę do momentu, aż masa komórkowa wewnętrzna znajdzie się na godzinie dziewiątej. Umieść igłę do iniekcji na godzinie trzeciej.

Upewnij się, że na końcówce igły nie znajdują się komórki ES, a następnie przykładaj impuls piezo, aż igła wstrzykująca przebije strefę pellucida i trofektodermę, wnikając do jamy blastocysty. Uwolnij od pięciu do 15 komórek ES w taki sposób, aby przylgnęły one do wewnętrznej masy komórkowej. Kontynuuj procedurę, aż wszystkie blastocysty zostaną wstrzyknięte. Po zakończeniu wstrzykiwań.

Przemyć dwukrotnie w pożywce K-S-O-M-A-A, a następnie przejść do chirurgicznego transferu embrionów do pseudaciążowych samic. Umieścić znieczuloną mysz biorczynią w stanie pseudociąży w polu operacyjnym. Za pomocą golarki elektrycznej usunąć włosy z prawego dolnego kwadrantu. Zdezynfekować ten obszar roztworem na bazie jodu oraz 70% etanolem pod mikroskopem stereoskopowym.

Używając nożyczek, rozetnij skórę, następnie umieść zamknięte nożyczki pomiędzy skórą a otrzewną i otwórz je, aby oddzielić otrzewną od skóry. Zlokalizuj jajnik przez otrzewną; powinien on być widoczny jako czerwona plamka. Następnie za pomocą nożyczek rozetnij otrzewną w tym obszarze.

Za pomocą pęsety ostrożnie chwyć UCT lub otaczającą tkankę tłuszczową i wyciągnij macicę, używając kapilary połączonej z pipetą ustną. Pobierz grupę około 10 blastocyst, trzymając jajowód i macicę pęsetą. Użyj igły, aby zrobić mały otwór w macicy.

Następnie wprowadź kapilarę z blastocystą do światła macicy i zwolnij ją. Wsuń macicę z powrotem do jamy brzusznej. Zlokalizuj brzegi otrzewnej i zamknij ją za pomocą kilku szwów.

Zamknij skórę myszy za pomocą kilku zszywek. Podaj podskórnie leki przeciwbólowe. Następnie przenieś mysz z powrotem do klatki pod lampę grzewczą.

Monitoruj oddychanie myszy aż do momentu jej wybudzenia. Po enukleacji i transferze jąder komórek somatycznych około 70% embrionów wykazało obecność pseudo-jąderków.

Jak pokazano na tej rycinie. Traktowanie TSA przez sześć lub 10 godzin nie przyniosło efektu. Po trzech i pół dniach hodowli od 5 do 10% embrionów rozwinęło się do stadium blastocysty.

Ponownie, dodanie TSA nie wpłynęło na tempo rozwoju blastocyst. Blastocysty uzyskane metodą SCNT wykorzystano następnie do wyprowadzenia embrionalnych komórek macierzystych. TSA znacząco zwiększyło wydajność wyprowadzania ESL z blastocyst.

Komórki S-C-N-T-E-S są wykorzystywane do tworzenia myszy chimerycznych. Z tych myszy pobiera się krew i analizuje pod kątem obecności specyficznych limfocytów T za pomocą analizy FACS, jak pokazano tutaj. Po zabarwieniu krwi przeciwciałem anty-CDA oraz specyficznym tetramerem można zidentyfikować populację podwójnie dodatnią.

Wskazuje to, że komórka dawcy użyta do SCNT miała odpowiednią specyficzność. Właśnie pokazałem Państwu, jak przeprowadzić transfer jąder komórek somatycznych, wstrzykiwanie wspomagające blastocysty oraz transfer zarodków. Najważniejszym punktem do rozważenia jest czystość limfocytów T lub B.

Po opanowaniu techniki transferu somatycznego i uzyskaniu zarodków w stadium blastocysty, można zdecydować o ich bezpośrednim transferze do samic pseudaciężarnych lub wykorzystaniu ich do wyizolowania embrionalnych komórek macierzystych i wygenerowania myszy chimerycznych.