Name: Przygotowanie ścięgien ogona szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Naucz się przygotowywać ścięgna ogona szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Poznaj metody ekstrakcji, pomiaru przekroju poprzecznego i ładowania do komory bioreaktora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy artykuł został sfinansowany z grantu NSERC nr 299280, przez IRSST w ramach stypendium dla G. Parent oraz przez FRSQ w ramach nagrody za badania prowadzone przez studenta studiów licencjackich M. Cyr. Dziękujemy Yoanowi Lemieux-Laneville za przeprowadzenie manipulacji zarejestrowanych na wideo.

Przed przystąpieniem do jakichkolwiek manipulacji należy zidentyfikować grupę ścięgien do wykorzystania, w zależności od prowadzonego eksperymentu oraz dostępnej aparatury. Na potrzeby naszych badań wybrano ścięgna brzuszne, ponieważ są one mniejsze, a tym samym łatwiejsze do manipulacji podczas pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego i umieszczania ich w komorze bioreaktora.
Należy pamiętać, że wszystkie instrumenty są autoklawowane lub sterylizowane 70% etanolem. Ponadto obok każdego stanowiska pracy znajduje się butelka z atomizerem zawierająca 70% etanol, służąca do sterylizacji rękawiczek eksperymentatora przed każdą operacją.
Część 1: Ekstrakcja
Po resekcji ogon jest ostrożnie manipulowany za jego końce, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. Ponadto, w celu zachowania żywotności komórek, wszystkie czynności wykonywane są w zimnym roztworze soli fizjologicznej.
1A) Materiały:
<ul>
 <li>Zimny roztwór soli fizjologicznej (D-PBS)</li>
 <li>Kruszony lód</li>
 <li>Protektor powierzchni</li>
 <li>Deska do krojenia</li>
 <li>Indywidualne płytki manipulacyjne</li>
 <li>2 szalki 50 ml</li>
 <li>2 szklane naczynia o pojemności 2 L</li>
 <li>Taśma klejąca</li>
 <li>1 Pinceta</li>
 <li>1 Pinceta</li>
 <li>1 Statyw na pęsety</li>
 <li>1 para nożyc chirurgicznych</li>
 <li>1 skalpel</li>
 <li>1 para nożyczek chirurgicznych 
 
 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Równowaga statyczna, urządzenie do pomiaru długości szczeliny, obróbka precyzyjna, układ doświadczalny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rysunek 1. Manipulacja indywidualna z identyfikacją orientacji („P” dla „proksymalny”)</li>
</ul>
1B) Stanowisko pracy:
<ol>
 <li>Rozłóż ochronę powierzchni i połóż na niej deskę do krojenia.</li>
 <li>Napełnij dwie większe szklane naczynia w połowie kruszonym lodem i ustaw je na papierze.</li>
 <li>Przyklej kawałek taśmy do rogu płytki manipulacyjnej i oznacz ją literą, aby wskazać koniec proksymalny.</li>
 <li>Napełnij w połowie dwie małe szklane naczynia oraz wszystkie rowki płytek manipulacyjnych zimnym roztworem soli fizjologicznej. Umieść je w dużych szklanych naczyniach z lodem.</li>
 <li>Uporządkuj wszystkie sterylne instrumenty na ochronie powierzchni.</li>
 <li>Przenieś ogon do jednego ze szklanych naczyń zawierających roztwór soli fizjologicznej.</li>
</ol>
1C) Manipulacje:
<ol>
 <li>Obserwuj anatomię w części proksymalnej ogona, aby odróżnić stronę brzuszna od grzbietowej. Strona brzuszna charakteryzuje się większą liczbą ścięgien oraz obecnością naczynia krwionośnego, co można potwierdzić poprzez delikatne uciśnięcie ogona w celu wywołania wydzielenia niewielkich kropel krwi.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych nacinamy skórę wzdłuż strony grzbietowej ogona, jeśli chcemy wyekstrahować ścięgna brzuszne (lub wzdłuż strony brzusznej, jeśli potrzebne są ścięgna grzbietowe). </li>
 <li>Otwórz nacięcie na końcu proksymalnym i usuń skórę za pomocą pęsety lub palców, ostrożnie manipulując końcami ogona.</li>
 <li>Opłucz krew i włosy w roztworze soli fizjologicznej, a następnie przenieś preparat do pozostałej szalki szklanej zawierającej świeży roztwór. Zmień rękawiczki. 
 
 Przekrój poprzeczny oglądany pod mikroskopem świetlnym ukazuje sześć grup ścięgien. Jedno ścięgno z każdej grupy jest przyczepione do końca guzowego każdego kręgu, dlatego cięcie wykonujemy na wysokości krążka międzykręgowego, aby odsłonić nowe ścięgna wzdłuż linii cięcia. 
 
 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Schemat anatomiczny przekroju poprzecznego, kręg z oznaczonymi obszarami, orientacja grzbietowo-brzuszna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rycina 2. Przekrój poprzeczny ogona szczura widziany w mikroskopii świetlnej.</li>
 <li>Odetnij dystalny koniec poprzez chrząstkę, dwa do trzech kręgów krócej, używając nożyczek chirurgicznych. Umieść ogon na desce do cięcia, aby przeciąć tkanki miękkie za pomocą skalpela, a następnie natychmiast przenieś go z powrotem do roztworu. </li>
 <li>Za pomocą pęsety wyciągnąć jedno ścięgno z dystalnego końca ogona.</li>
 <li>Delikatnie trzymając ścięgno za oba końce, umieść je w płytce do manipulacji pojedynczych próbek. Powtarzaj dwa ostatnie kroki do momentu, aż nie będzie można wyodrębnić więcej ścięgien, odcinając kolejny kręg, gdy zajdzie potrzeba odsłonięcia nowych tkanek.</li>
</ol>
Część 2: Pomiar pola przekroju poprzecznego7
Podczas charakteryzacji mechanicznej lub stymulacji tkanki jej właściwości mechaniczne opisuje się poprzez normalizację siły wewnątrz ścięgna do naprężenia. Z tego powodu oceniamy pole przekroju poprzecznego.
2A) Materiały:
<ul>
 <li>Mikrometr optyczny</li>
 <li>Stereomikroskop</li>
 <li>Aparat cyfrowy</li>
 <li>Algorytmy rozpoznawania krawędzi i rekonstrukcji profilu 5,6</li>
 <li>Zimny roztwór soli fizjologicznej (D-PBS)</li>
 <li>1 20-200μL Pipeta mikropojemnościowa</li>
 <li>1 klucz imbusowy do regulacji mikrometru optycznego</li>
 <li>2 pincety 
 
 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg" alt="Schemat układu spektroskopowego do analizy wzbudzenia optycznego z komponentami fotonicznymi i czujnikami." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Mikrometr optyczny</li>
</ul>
2B) Stanowisko pracy:
<ol>
 <li>Uruchom oprogramowanie (Aparat cyfrowy i algorytmy).</li>
 <li>Umieść mikrometr optyczny w taki sposób, aby pozostało wystarczająco dużo miejsca na zamocowanie ścięgna w aparacie.</li>
 <li>Przygotuj instrumenty oraz szalkę z wyizolowanymi ścięgnami w zasięgu ręki.</li>
</ol>
2C) Manipulacje:
<ol>
	<li>Napełnić komorę pomiarową zimnym roztworem soli fizjologicznej, aż oba systemy kotwiczące zostaną zanurzone.</li>
	<li>Przenieś ścięgno do przedziału, trzymając jego końce pęsetą.</li>
	<li>Za pomocą ssania pipetą mikroobjętościową wciągnij po jednym końcu do rurki silikonowej. Aspiruj do momentu, aż koniec wysunie się poza kołnierze trzpienia.</li>
	<li>Dokręć obejmy wałów, aby ścisnąć probówki, a następnie zamocuj aparat pod stereomikroskopem.</li>
	<li>Przy powiększeniu 105X rozciągaj ścięgna, obserwując tkankę, aż do momentu, gdy zmarszczki przestaną być widoczne. Rozciągnij dodatkowo o 0,40%. 
 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Doświadczenie z optyki falowej, schemat prążków interferencyjnych, demonstrujący analizę zachowania fal świetlnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rysunek 4. Projekcja ścięgna przy powiększeniu 105x przed i po rozciąganiu.</li>
	<li>Dostosuj położenie i ostrość, aby zachować wyraźny obraz ścięgna nad 180° rotacja</li>
	<li>Wykonaj zdjęcie przy każdym 10° obrót bez zmiany napięcia, ostrości lub pozycji. Do wykonania obrotu należy używać wyłącznie wału obrotowego.
Ze względu na stożkowaty kształt, etapy te można powtórzyć w różnych punktach wzdłuż ścięgna.</li>
 <li>Uruchom algorytmy rozpoznawania krawędzi i rekonstrukcji profilu, aby przeanalizować zarejestrowaną bazę danych.</li>
 <li>Uwolnić ścięgno poprzez poluzowanie obejm wału i wtłoczenie powietrza do rurek silikonowych za pomocą pipety mikroobjętościowej.</li>
 <li>Ponownie wprowadź ścięgno na płytkę manipulacyjną, trzymając je ponownie za końce.</li>
 <li>Zweryfikuj kształt uzyskanej rekonstrukcji profilu oraz wartość pola przekroju poprzecznego.</li>
</ol>
Część 3: Płukanie
Aby usunąć zanieczyszczenia, które mogły powstać podczas poprzednich manipulacji, tkanki płucze się w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
3A) Materiały:
<ul>
 <li>Zimny roztwór soli fizjologicznej (D-PBS)</li>
 <li>Wielorowkowa płytka manipulacyjna</li>
 <li>Indywidualne płytki manipulacyjne</li>
 <li>Taśma klejąca</li>
 <li>2 pęsety</li>
 <li>1 stojak na pęsety</li>
</ul>
3B) Stanowisko pracy:
<ol>
 <li>Włączyć wentylator w komorze bezpieczeństwa biologicznego z 15-minutowym wyprzedzeniem i oczyścić powierzchnie wewnętrzne 70% etanolem.</li>
 <li>Wprowadzić wszystkie instrumenty do wnętrza komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
 <li>Nakleić kawałki taśmy w rogu każdej płytki, aby oznaczyć koniec proksymalny.</li>
 <li>Wypełnić wszystkie rowki sterylnym roztworem soli fizjologicznej.</li>
</ol>
3C) Manipulacje:
<ol>
 <li>Wprowadzić do komory płytę manipulacyjną zawierającą wyekstrahowane ścięgno.</li>
 <li>Za pomocą pęsety wyjąć ścięgno z płyty, delikatnie chwytając je za oba końce.</li>
 <li>Zanurzyć i delikatnie wymieszać ścięgno w roztworze soli fizjologicznej w każdym przegrodzie wielorowej płyty manipulacyjnej, zaczynając od najbliższego i przechodząc do najdalejszego rowka.</li>
 <li>Na koniec zanurzyć ścięgno w pojedynczej płycie manipulacyjnej.</li>
</ol>
Część 4: Załadunek do komory bioreaktora
Aby uniknąć dalszej kontaminacji, następujące czynności są również przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
4A) Materiały:
<ul>
 <li>Komora bioreaktora 4</li>
 <li>Sterylne kotwice</li>
 <li>1 sterylna szalka Petriego</li>
 <li>Schłodzona pożywka do hodowli komórkowych (DMEM)</li>
 <li>Cyjanoakrylan</li>
 <li>2 pęsety</li>
 <li>Stojak na pęsety</li>
 <li>0.5-10μl Pipeta mikroobjętościowa</li>
 <li>1 Linijka 
 
 <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Mechanizm ruchu liniowego, schemat, z naciskiem na kontrolę przemieszczenia i wyrównanie mechaniczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Komora bioreaktora</li>
</ul>
4B) Stanowisko pracy:
<ol>
 <li>Ponieważ poprzedni krok również był wykonywany w komorze z laminarnym przepływem powietrza, usunięcie niepotrzebnych narzędzi zapewni więcej miejsca do pracy.</li>
 <li>Wprowadź wszystkie pozostałe instrumenty do wnętrza komory.</li>
</ol>
4C) Manipulacje:
<ol>
 <li>Umieść kotwicę na płycie manipulacyjnej tak, aby jej szpula znajdowała się centralnie nad końcem ścięgna, a następnie nawiń tkankę wokół szpuli.</li>
 <li>Przetoczyć kotwicę i przytrzymać wolny koniec, upewniając się, że tkanka pozostaje przymocowana do kotwicy. Przerwać po wykonaniu ¾ obrotu. </li>
 <li>Powtórz te same czynności z drugim końcem.</li>
 <li>Przesuń oba kotwice równomiernie, aż odległość między ich środkami wyniesie 6 cm.1. </li>
 <li>Poluźnić ścięgno, aby zanurzyć je w roztworze, i pozwolić zakotwiczonym fragmentom na krótkie wyschnięcie w celu poprawy jego właściwości mechanicznych2-3.</li>
 <li>Wlej cyjanoakrylan do szalki Petriego i narysuj 2.5μL do pipety mikropojemnościowej.</li>
 <li>Nanieś kroplę cyjanoakrylanu na zwiniętą tkankę, uważając, aby klej nie dostał się do roztworu soli fizjologicznej. Powtarzaj czynność, aż do każdego punktu zakotwiczenia zostanie naniesione 2 krople.</li>
 <li>Pozostawiając ścięgno całkowicie zanurzone, odczekać 5 minut do całkowitego wyschnięcia kleju.</li>
 <li>W tym czasie należy napełnić komorę roztworem soli fizjologicznej.</li>
 <li>Nawodnić wszystkie tkanki roztworem soli fizjologicznej, aby zapobiec ich uszkodzeniu.</li>
 <li>Manipulując wyłącznie kotwicami, przenieś ścięgno do komory bioreaktora i zamknij ją, aby zapobiec wyciekom i kontaminacji podczas przenoszenia.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Wynik protokołu wykazuje, że przy prawidłowym wykonaniu, nasza rygorystyczna procedura izolacji i przygotowania tkanki pozwala na zachowanie sterylności, żywotności i integralności tkanki.
W pierwszej kolejności, stosując prostą i powtarzalną metodę ekstrakcji, jesteśmy w stanie wyizolować ścięgna ogonowe bez uszkadzania sieci kolagenowej, co potwierdza analiza mikroskopowa przekrojów barwionych H&amp;E przeprowadzona po ekstrakcji.
<img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Struktura włókien mięśniowych, obraz histologiczny, przedstawiający prążkowanie i rozmieszczenie jąder." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
 Rysunek 6. sieć kolagenowa ścięgna po ekstrakcji (5μm przekrój podłużny barwiony H&E&amp;E).
Następnie hodowaliśmy ścięgna przez maksymalnie dziesięć dni i przeprowadzaliśmy testy sterylności. Każdego dnia wysiewaliśmy zużyty roztwór hodowlany na agar i inkubowaliśmy go przez 24 godziny. Ponieważ nie zaobserwowano wzrostu bakterii, wyciągnęliśmy wniosek, że nasze manipulacje nie prowadzą do kontaminacji.
Dzięki zastosowaniu algorytmu rekonstrukcji profilu i mikrometru optycznego jesteśmy w stanie oszacować powierzchnię przekroju poprzecznego z marginesem błędu wynoszącym 2%7.
<img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Wykres z naniesionymi punktami danych tworzącymi elipsę; eksperyment w wizualizacji danych, wynik analizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
 Rysunek 7. Rekonstrukcja profilu RTT.
Na koniec oceniliśmy żywotność komórek za pomocą zestawu LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit dla komórek ssaków po etapie płukania oraz po dwunastodniowym okresie hodowli. Ponieważ widoczna była znaczna większość żywych komórek wykazujących zieloną fluorescencję, możemy potwierdzić, że nasze procedury izolacji skutecznie zachowują żywą tkankę. Ten sam test przeprowadzono dwie godziny po przymocowaniu ścięgna w komorze bioreaktora. Zweryfikowaliśmy, że odwodnienie i klej w miejscu kotwiczenia nie rozprzestrzeniły się w tkance pomiędzy obiema kotwicami.
<img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, zielone i czerwone struktury białkowe, analiza komórkowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 8"> 
 Rycina 8. Żywotność tkanki w miejscu zakotwiczenia (zielony = żywe komórki, czerwony = martwe komórki)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Stosując powyższe procedury eksperymentalne, możemy przeprowadzić szeroki zakres badań in vitro na tego typu tkankach. Przykładowo, badanie nad degeneracją tkanki przeprowadzono poprzez poddawanie RTTs niedostymulacji przez okres dziesięciu dni. Każdego dnia ocenialiśmy właściwości mechaniczne tkanki w nieniszczących testach relaksacji naprężeń. Ostatecznie mogliśmy zaobserwować zmienność naprężeń RTT, a tym samym przeanalizować progresję właściwości mechanicznych.
<img src="/files/f...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Odczynnik</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Roztwór soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Glukoza </td><td>Odczynnik</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Roztwór soli fizjologicznej&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antybiotyki-antymykotyki </td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Roztwór soli fizjologicznej&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Pożywka hodowlana&lt;br/&gt;3.7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Odczynnik</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Pożywka hodowlana&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antybiotyki-antymykotyki</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Pożywka hodowlana&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Mikrometr optyczny</td><td>Narzędzie</td><td>Wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka manipulacyjna</td><td>Narzędzie</td><td>Wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora bioreaktora</td><td>Narzędzie</td><td>Wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie ścięgien ogonowych szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Ścięgna z ogona szczura (RTTs) są powszechnie stosowanym modelem biologicznym w eksperymentalnych badaniach in vitro w dziedzinach fizjologii ścięgien i tendinopatii. Praca z tymi tkankami jest trudna ze względu na ich dużą kruchość, a do tej pory brakowało rygorystycznie szczegółowego protokołu ich izolacji.
W obliczu tych wyzwań opracowaliśmy metody i instrumenty ułatwiające manipulację RTT oraz kontrolę żywotności, sterylności i integralności tkanek. Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne stosowane w przygotowaniu RTT do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Nasza praca została podzielona na cztery główne etapy: ekstrakcję, pomiar pola przekroju poprzecznego, płukanie oraz umieszczenie w komorze bioreaktora.
Na każdym etapie wszystkie procedury, materiały i manipulacje są przedstawione szczegółowo, aby umożliwić ich łatwą reprodukcję. Ponadto zaprezentowano opracowane specjalistyczne instrumenty: płytkę manipulacyjną służącą do segregacji RTT, mikrometr optyczny do pozycjonowania tkanki podczas pomiaru pola powierzchni przekroju poprzecznego oraz system kotwiczący do mocowania RTT w bioreaktorze.
Na koniec opisujemy wyniki uzyskane po wielokrotnych testach mających na celu walidację naszych metod. Oceny żywotności, sterylności i integralności wykazują, że nasze procedury są wystarczająco rygorystyczne dla manipulacji w kruchych tkankach, takich jak ścięgna ogona szczura.

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne stosowane w celu przygotowania ścięgien z ogonów szczurów do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Przedstawiono kluczowe etapy przygotowania, zaczynając od ekstrakcji, pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego, płukania, aż po umieszczenie próbek w komorze bioreaktora.

Przygotowanie ścięgien ogonowych szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych

Ścięgna z ogonów szczurzych (RTTs) stanowią powszechny model biologiczny wykorzystywany w eksperymentalnych badaniach in vitro w dziedzinach fizjologii ścięgien oraz tendinopatii. Praca ...

Film, który za chwilę zostanie wyświetlony, przedstawia procedury eksperymentalne wykorzystywane do izolacji i przygotowania ścięgna ogona szczura do badań biomechanicznych i biologiczno-mechanicznych. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metod i instrumentów, które zostały opracowane i zoptymalizowane w celu zachowania żywotności, sterylności i integralności tkanki podczas procedury przygotowania. Omówimy kilka aspektów dotyczących głównych etapów przygotowania, zaczynając od ekstrakcji, a następnie pomiaru powierzchni przekroju poprzecznego, płukania i wreszcie umieszczenia w komorze bioreaktora.Zacznijmy. Ekstrakcja jest pierwszym etapem przygotowania, mającym na celu zachowanie żywotności komórek. Wszystkie manipulacje są wykonywane w zimnym roztworze selinowym.Po uśpieniu szczura, odcina się ogon, płucze go 70% ethanol i przenosi do naczynia zawierającego roztwór z komórkami, utrzymując go w lodzie. Aby ułatwić ekstrakcję ścięgna, należy usunąć skórę. Należy pamiętać, że pracujemy ze ścięgnami brzusznymi.Ponieważ są one mniejsze i łatwiejsze do manipulowania przy użyciu naszego sprzętu, wykonuje się nacięcie wzdłuż całej strony grzbietowej ogona. Następnie weryfikuje się prawidłową orientację ogona, obserwując anatomię w części proksymalnej. Jak widać, strona brzuszna wykazuje większą liczbę ścięgien, a obecność naczynia krwionośnego można potwierdzić za pomocą uzyskanych kropel krwi.Przy delikatnym ściskaniu ogona wykonuje się nacięcie. Rozpoczyna się od końca proksymalnego, używając nożyczek chirurgicznych. Należy uważać, aby manipulować ogonem za jego końce.Po wykonaniu nacięcia skórę usuwa się, zaczynając również od końca proksymalnego, używając palców lub pęsety. Ponownie należy uważać, aby manipulować ogonem, trzymając go za jego końce. Następnie ogon płucze się w roztworze, aby usunąć włosy i krew.Następnie preparat przenosi się do naczynia zawierającego świeży roztwór i utrzymuje w lodzie. W tym momencie eksperymentator zmienia rękawiczki, aby odsłonić ścięgno. Dystalny koniec ogona zostaje wycięty na dwa do trzech kręgów krócej.Kręgi są widocznymi pęczkami pomiędzy pęczkami ścięgien; można je również wyczuć, przesuwając palcami wzdłuż ogona. Widok w mikroskopii świetlnej przekroju poprzecznego wykonanego wzdłuż kręgu. Końcówka pokazuje, że istnieją sześć różnych grup ścięgien, ponieważ ścięgno z każdej z nich jest przytwierdzone do kręgu i że wykorzystujemy wyłącznie tkanki brzuszne.Przy każdym cięciu wyciąga się cztery ścięgna: dwa z grup dolnych i dwa z grup bocznych. W celu przeprowadzenia resekcji można użyć nożyczek chirurgicznych do przerwania krążka międzykręgowego oraz skalpela na desce do krojenia w przypadku tkanek miękkich. Na tym etapie stronę brzuszną rozpoznaje się po obecności większych fragmentów ścięgien.Po zweryfikowaniu orientacji, ścięgna są delikatnie wyciągane z końca dystalnego za pomocą pęsety. Gdy nie można już oddzielić więcej tkanek, ogonek zostaje wycięty na poziomie kostki kręgu, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po wyciągnięciu tkanka jest natychmiast zanurzana w roztworze, a następnie, trzymając oba końce, ścięgno zostaje przeniesione na płytkę manipulacyjną zawierającą również roztwór komórkowy, na której za pomocą taśmy oznacza się koniec proksymalny. Analiza mikroskopowa podłużnego przekroju barwionego H&amp;E wykazuje, że dzięki zastosowaniu tej prostej i powtarzalnej metody, wyekstrahowany fragment tkanki posiada dobrze uporządkowaną i gęstą sieć kolagenową.Po manipulacji, gdy tkanki są poddawane stymulacji mechanicznej, opisujemy ich właściwości mechaniczne, normalizując siłę wewnętrzną do naprężenia. W związku z tym musimy ocenić ich pole przekroju poprzecznego. Aby to osiągnąć, profil tkanek jest rekonstruowany przy użyciu stereomikroskopu wyposażonego w kamerę cyfrową.Dzięki tej metodzie zachowana zostaje integralność tkanek, ponieważ obciążenie śniegiem lub naprężenia są przykładane bezpośrednio do nich. Aparat cyfrowy wykonuje zdjęcia projekcji próbki w polu widzenia 180°. W obrębie ramki odniesienia algorytm asystenta wizyjnego lokalizuje górną i dolną krawędź preparatu.Następnie, do przeprowadzenia rekonstrukcji profilu wykorzystano algorytm opracowany w oprogramowaniu MATLAB. Zaprojektowano mikrometr optyczny, aby utrzymać tkankę w strefie ogniskowania. Poza tym obszarem projekcja jest rozmyta, a ponowne ogniskowanie spowodowałoby przesunięcie lokalnego układu odniesienia.Mikrometr posiada komorę pomiarową zapobiegającą odwodnieniu tkanki. Wykorzystano dwa systemy pozycjonujące z obrotowym stolikiem, umożliwiające obrót preparatu, oraz dwa urządzenia mocujące wykonane z rurek silikonowych dociśniętych do kolorowych trzpieni. W pierwszej kolejności komorę pomiarową napełnia się zimnym roztworem do komórek, aż do momentu zanurzenia wlotów rurek silikonowych.Następnie „spaceman” jest przenoszony do komory pomiarowej za pomocą pęsety, chwytając go wyłącznie za kończyny. Przy użyciu pipety do mikroobjętości końce ścięgien są wciągane przez przekrój do rurek silikonowych. Następnie wykonuje się aspirację, aż koniec wysunie się poza obszary kolorowe trzpienia.Po zakończeniu obu stron, kolory wału zostają zaciśnięte za pomocą klucza szyjkowego w celu ściskania rurki. Po ustabilizowaniu ścięgna aparat zostaje zainstalowany pod stereomikroskopem. Ścięgno można obserwować bezpośrednio na ekranie komputera przy powiększeniu 105.W celu zapewnienia spójności ścięgno jest rozciągane do momentu, aż zagięcia przestaną być widoczne, a następnie poddawane dodatkowej deformacji o 0,4%. Ponieważ próbka jest fotografowana w zakresie od 0 do 170 stopni, konieczne jest ustalenie pozycji początkowej oraz regulacja ostrości, aby uzyskać wyraźny obraz w całym obwodzie. W rzeczywistości wykonuje się 18 zdjęć, przy czym obrót próbki jest zwiększany o 10 stopni pomiędzy kolejnymi ujęciami.Za pomocą tej metody możliwe jest oszacowanie pola przekroju ścięgna ogona szczura bez uszkadzania tkanki. W rezultacie uzyskuje się rekonstrukcję profilu z błędem w granicach od 0,5 do 2%. Po pomiarze tkanki zostają przemyte, aby zapobiec zanieczyszczeniom, które mogły wystąpić podczas wcześniejszych manipulacji.Sterylne płytki manipulacyjne zawierające świeży roztwór utrwalający są umieszczane w komorze, z czego jedna służy do procedury płukania, a druga do odebrania wypłukanego ścięgna. Eksperymentator przemywa rękawiczkę 70% etanolem przed wprowadzeniem wyekstrahowanego ścięgna do komory bezpieczeństwa biologicznego. Trzymając ścięgno wyłącznie za końce, ostrożnie przenosi się je z dołka do dołka.Na koniec przenosi się go na indywidualną płytkę manipulacyjną zawierającą również sterylną zawiesinę komórek. W celu walidacji protokołu przeprowadzono testy żywotności i sterylności. W pierwszej kolejności żywotność komórek oceniono przy użyciu zestawu do badania cytotoksyczności i żywotności komórek ssaczych (live dead viability cytotoxicity kit).Po 12 dniach hodowli zaobserwowano dużą większość żywych komórek wykazujących zieloną fluorescencję, co potwierdziło, że procedury izolacji skutecznie zachowują żywą tkankę. Następnie przeprowadzono badania w celu sprawdzenia, czy użyta pożywka nie została zanieczyszczona. Poziomki z pożywką wysiewano na agar i inkubowano przez 10 dni, nie stwierdzając wzrostu bakterii.Potwierdziliśmy, że nasze manipulacje są sterylne. Zastosowany system kotwiczenia wykorzystuje zalety dehydratacji tkanki oraz kleju w przypadku małych preparatów, takich jak ogon szczura czy ścięgna, gdzie klej penetruje tkankę. Zapewnia to stabilizację we wszystkich podjednostkach, podczas gdy dehydratacja poprawia właściwości mechaniczne, aby zapobiec dalszemu zanieczyszczeniu.Cała procedura ładowania jest przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza, w której wszystkie instrumenty i elementy komory są sterylne. Do operacji ładowania komora bioreaktora jest zamocowana na uchwycie pozycjonującym. Dwa ruchome ramiona są ustawione tak, aby przyjąć kotwice ścięgien.Pokrywa zamyka komorę, aby zapobiec kontaminacji. Najpierw kotwice zostają osadzone na końcach płyt manipulacyjnych. Ich szpulki zostają wycentrowane względem osi podłużnej rowka i nad ścięgnem.Następnie ścięgno owija się wokół jednego kotwiczenia. Kotwiczenie obraca się o około trzy czwarte obrotu, podczas gdy ciało tkanki pozostaje w roztworze. Przytrzymując wolny koniec, zapewniamy przymocowanie tkanki do kotwiczenia.Następnie powtarza się tę samą procedurę dla drugiej kończyny. Po ustabilizowaniu obu stron kotwice zwija się lub rozwija równomiernie, aż powstanie odcinek o długości 6 cm. Pomiędzy dwie kończyny nanosi się dwie krople po 2,5 µL ocreate na uszkodzoną część ścięgien.Należy zachować ostrożność podczas nakładania kleju. Aby uniknąć przedostania się kleju do roztworu komórkowego, wymagane jest minimum pięć minut do całkowitego wyschnięcia kleju. W celu walidacji naszego protokołu przeprowadziliśmy testy, aby zweryfikować wpływ kleju oraz odwodnienia punktu kotwiczenia na żywotność tkanki.Po dwóch godzinach zaobserwowano, że stan kończyny nie rozprzestrzenił się poza tkankę. W rzeczywistości widoczna jest wyraźna granica koloru, wyznaczająca barierę między czerwonymi fluorescencyjnymi martwymi komórkami znajdującymi się w punkcie zakotwiczenia a większością zielonych żywych komórek ciała tkanki. W międzyczasie komora bioreaktora zostaje napełniona świeżą pożywką hodowlaną.Gdy rana w części ścięgna wyschnie, należy ją nawodnić roztworem komórkowym. Następnie za pomocą pęsety przymocowaną tkankę przenosi się do komory. Pokrywę zamyka się, aby uniknąć dalszego zanieczyszczenia.Przyrząd pozycjonujący zostanie usunięty po zamontowaniu komory w bioreaktorze. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania ścięgna z ogona szczura do badań biomechanicznych i biologiczno-mechanicznych. Stosując te procedury, możemy przeprowadzać szeroki zakres badań in vitro na tych tkankach.Na przykład badanie nad degeneracją tkanek przeprowadzono poprzez zastosowanie stymulacji przez okres 10 dni. Każdego dnia oceniano tkankę, właściwości mechaniczne oraz przeprowadzano nieniszczący test relaksacji naprężeń. Na koniec zaobserwowano zmienność naprężeń.Przedstawiliśmy dowody na to, że nasze rygorystyczne procedury izolacji i przygotowania pozwalają na zachowanie żywotności tkanki, jej integralności oraz właściwości przeciwciał. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia we własnych eksperymentach.

preparation-rat-tail-tendons-for-biomechanical-mechanobiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film prezentuje chirurgiczne przygotowanie i procedury niezbędne do badania odpowiedzi skurczowej preparatu przyśrodkowej części mięśnia brzuchatego szczura in situ. Preparat ten umożliwia pomiar właściwości skurczowych mięśnia szkieletowego w warunkach fizjologicznych. Zwierzę zostaje poddane znieczuleniu, a mięsień zostaje oddzielony od otaczających go tkanek na jego końcu dystalnym. Ścięgno Achillesa zostaje przymocowane do przetwornika siły, co pozwala na pomiar odpowiedzi...

Procedury badania właściwości kurczliwych mięśni szkieletowych szczura in situ

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Ten protokół opisuje proces oceny gojenia ścięgien u szczurów, którym wstrzyknięto allogeniczne osocze bogatopłytkowe (PRP) lub roztwór soli fizjologicznej po usunięciu części ścięgna Achillesa. Postęp gojenia ścięgien jest oceniany w kilku punktach czasowych za pomocą różnych rodzajów analiz.

Wpływ allogenicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) na proces gojenia przeciętych ścięgien Achillesa szczurów: opis metodologiczny

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

W tym artykule prezentujemy protokół in vitro i in situ do naprawy szczeliny ścięgna do 1,5 cm poprzez wypełnienie jej zmodyfikowanym przeszczepem kolagenu. Osiągnięto to poprzez opracowanie zmodyfikowanej techniki szwów, która przejmie obciążenie mechaniczne do momentu, gdy przeszczep dojrzeje do tkanki gospodarza.

Nowatorska technika szwów tenorrhaphy z przeszczepem kolagenu modyfikowanym tkankowo w celu naprawy dużych ubytków ścięgien

Protokół opisuje skuteczne i powtarzalne metody testowania biomechanicznego rozciągania ścięgien mysich za pomocą specjalnie dopasowanych uchwytów drukowanych w 3D.

Badania biomechaniczne ścięgien myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie całej tkanki nerwowej rwy kulszowej szczura do elektrofizjologicznej stymulacji ex vivo i zapis w regulowanej środowiskowo, dwukomorowej, perfundowanej kąpieli solankowej.

Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

Prezentujemy niestandardową platformę eksperymentalną i protokół hodowli tkankowej, który odtwarza zmiany włóknisto-chrzęstne wywołane uderzeniem przyczepu ścięgna Achillesa w eksplantatach mysich kończyn tylnych o trwałej żywotności komórek, dostarczając model odpowiedni do badania mechanobiologii uderzeń ścięgien.

Mysi model eksplantatu kończyn tylnych do badania mechanobiologii uderzenia ścięgna Achillesa

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Naucz się przygotowywać ścięgna ogona szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych. Poznaj metody ekstrakcji, pomiaru przekroju poprzecznego i ładowania do komory bioreaktora.

Przygotowanie ścięgien ogonowych szczura do badań biomechanicznych i mechanobiologicznych

Przeglądaj więcej filmów