Name: Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej u myszy SJL (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj metodę indukcji autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej u myszy SJL przy użyciu immunogenu przysadkowego. Protokół obejmuje iniekcje, pobieranie krwi i analizę histopatologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH DK080351 przyznanego PC oraz z hojnej darowizny rodziny Terry’ego i Kristine Gore.

Protokół eksperymentalny
Po przygotowaniu immunogenu przysadkowego (patrz artykuł towarzyszący), wstrzykuje się go podskórnie myszom SJL (The Jackson Laboratories, stock 000686). Drugie, identyczne wstrzyknięcie powtarza się po 7 dniach. Następnie myszy są wykorzystywane do zbierania wyników in vivo oraz pośmiertnych.
Krok 1. Podskórne wstrzykiwanie immunogenu przysadkowego myszom linii SJL
Myszy są najpierw znieczulane poprzez dostrytonalne wstrzyknięcie 0,5 ml 2,2,2-tribromoetanolu (Avertin, TCI America, T-1420) w stężeniu 20 mg/ml. Następnie myszom wstrzykuje się podskórnie 100 μl emulsji przysadkowej, która – zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule JoVE 2181 – zawiera 1 mg ekstraktu z przysadki oraz 0,25 mg pełnego adiuwanta Freunda. Emulsję wstrzykuje się w okolicy grzbietowej lewej tylnej kończyny (50 μL) oraz w prawym pachwinie (50 μL). Emulsję przysadkową wstrzykuje się ponownie w 7. dniu w przeciwległe miejsca (50 μl w okolicy grzbietowej prawej tylnej kończyny i 50 μl w lewym pachwinie). Stan myszy jest monitorowany codziennie przez pierwsze 3 dni, a następnie co tydzień aż do dnia uboju, który przypada zazwyczaj 28 dni po pierwszej immunizacji.
Krok 2. Zbieranie wyników in vivo: analizy krwi
Tkanką najczęściej wykorzystywaną do oceny wyników eksperymentalnych podczas gdy myszy są jeszcze żywe jest krew. Krew pobiera się rutynowo 14 dni po pierwszej immunizacji, aby zmierzyć poziomy przeciwciał przeciwko przysadce w surowicy lub inne markery, takie jak cytokiny i chemokiny.
Krew z żywych myszy pobiera się w następujący sposób. Myszy unieruchamia się, chwytając za kark, a następnie lokalizuje tylną część żuchwy. Po zlokalizowaniu tylnej części żuchwy, za pomocą lancetów 4 mm nakłuwa się podżuchwowy pęczek naczyniowy. Po pobraniu krwi należy ucisnąć to miejsce gazikiem nasączonym alkoholem, aby zapobiec powstaniu krwiaka. Pobraną krew wiruje się przy 2,000g przez 20 minut i przechowuje w temperaturze -80°C do czasu użycia.
Krok 3. Zbieranie wyników pośmiertnych: Histopatologia przysadki
Myszy są zazwyczaj uśmiercane 28 dni po pierwszej immunizacji. Kluczową cechą niezbędną do postawienia diagnozy EAH jest naciek komórek jednojądrzastych układu krwiotwórczego do przysadki mózgowej.
Myszy są uśmiercane poprzez umieszczenie ich w szczelnej plastikowej komorze, do której doprowadzany jest CO2. Myszy pozostają w komorze przez łącznie 8 minut. Po uśmierceniu przysadka mózgowa jest pobierana zgodnie z opisem w towarzyszącym artykule. Chorobowo zmieniona przysadka wydaje się obrzęknięta i silniej przylega do otaczającej ją opony twardej. Do poluzowania opon otaczających przysadkę używa się ostrych pęsety. Gdy przysadka przesuwa się swobodnie po kości klinowej, jeden jej koniec chwyta się pęsetą i ostrożnie unosi. Następnie gruczoł umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi zawierającej utrwalacz Becksteada5. Przysadka jest utrwalana przez noc, owijana w papier soczewkowy i umieszczana w kasecie. Następnie gruczoły są przetwarzane zgodnie z następującym protokołem:
 <table border="1">
		<tbody>
 <tr>
 <td>Numer stanowiska</td>
 <td>Odczynnik</td>
 <td>Czas w minutach</td>
 <td>Temperatura (stopnie Celsjusza)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>70% alkohol</td>
 <td>5</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>70% alkohol</td>
 <td>15</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>95% alkohol</td>
 <td>15</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>alkohol 95%</td>
 <td>15</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>100% alkohol</td>
 <td>15</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>alkohol 100%</td>
 <td>7.5</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>alkohol 100%</td>
 <td>7.5</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>8</td>
 <td>ksylen</td>
 <td>20</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>9</td>
 <td>ksylen</td>
 <td>20</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10</td>
 <td>ksylen</td>
 <td>20</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>11</td>
 <td>parafina</td>
 <td>30</td>
 <td>58</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12</td>
 <td>parafina</td>
 <td>5</td>
 <td>58</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>13</td>
 <td>parafina</td>
 <td>5</td>
 <td>58</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Po obróbce przysadki są zatapiane w parafinie, a z każdej z nich wykonuje się co najmniej 5 nieprzylegających do siebie skrawków (o grubości 5-μm). Po pocięciu skrawki barwi się hematoksyliną i eozyną, a następnie analizuje w celu ilościowego określenia nacieku jedynojądrowego. Do oceny wybierany jest skrawek z najsilniejszym naciekiem. Stopień nasilenia ocenia się na podstawie subiektywnego szacunku zakresu zastąpienia lub zniszczenia przedniego płata przysadki przez komórki odpornościowe: stopień 0 – brak zmian chorobowych; stopień 1 – zajęcie 2%-20%; stopień 2 – 20%-30%; stopień 3 – 30%-50%; stopień 4 – 50%-90%; stopień 5 – powyżej 90%. Wszystkie skrawki są oceniane przez dwie osoby, które nie znają pochodzenia analizowanych materiałów.

<ol><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. , (2008).</li>
<li>Twarog, F. J., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+thyroid+autoantibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The production of thyroid autoantibodies in mice.</a> J Immunol. 101, 242-2450 (1968).</li>
<li>Patrick, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+response+to+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune response to acetylcholine receptor.</a> Science. 180, 871-872 (1973).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
<li>Beckstead, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+preservation+of+fixation-sensitive+antigens+in+paraffin-embedded+tissues%3A+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum.</a> J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+adenophypophysitis%3A+new+experimental+disease+of+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland.</a> Science. 158, 1190-1191 (1967).</li>
<li>Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+organ-specific+autoimmune+disease%2C+lymphocytic+hypophysitis%2C+in+hamsters+by+recombinant+rubella+virus+glycoprotein+and+prevention+of+disease+by+neonatal+thymectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy.</a> Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).</li>
<li>Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+the+ovine+pituitary+gland+is+associated+with+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis.</a> J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).</li>
<li>Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenohypophysitis+in+rat+pituitary+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adenohypophysitis in rat pituitary allografts.</a> Int J Exp Pathol. , (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisano cztery techniki indukcji zapalenia przysadki u zwierząt doświadczalnych. Technika przedstawiona w niniejszym artykule, polegająca na wstrzykiwaniu białek przysadki zmieszanych z adjuwantem Freunda, jest najstarszą z nich, datowaną na 1967 rok6, i została ulepszona w ostatnim czasie1. Inne techniki to wstrzykiwanie rozpuszczalnych glikoprotein wirusa różyczki w 1992 roku7, stereotaktyczne wstrzyknięcie adenowirusa bezpośrednio do przysadki w 2002 roku8 oraz transplantacj...

<table><tbody><tr><td>myszy SJL (The Jackson Laboratories)</td><td></td><td>zapas 000686</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromo&amp;#8211;trietanol (Avertin)</td><td>TCI America</td><td>T-1420</td><td></td></tr><tr><td>Beckstead&amp;rsquo;utrwalacz s</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu sjl

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można odtworzyć eksperymentalnie poprzez wstrzyknięcie białek przysadki wymieszanych z adiuwantem podatnym myszom1. Modele mysie pozwalają nam badać przebieg chorób, często stanowiąc dobrą replikę procesów zachodzących u ludzi. W przypadku niektórych chorób autoimmunologicznych, takich jak cukrzyca typu 1A, istnieją modele (myszy NOD), u których samoistnie rozwija się choroba podobna do ludzkiego odpowiednika. Jednak w przypadku wielu innych chorób autoimmunologicznych model musi zostać wywołany eksperymentalnie. Powszechnym podejściem w tym zakresie jest wstrzyknięcie myszy dominującego antygenu pochodzącego z badanego organu. Na przykład badacze zainteresowani autoimmunologicznym zapaleniem tarczycy wstrzykują myszom tyreoglobulinę2, a osoby zainteresowane miastenią gravis wstrzykują receptor acetylocholiny3. Jeśli autoantygen dla konkretnej choroby autoimmunologicznej nie jest znany, badacze wstrzykują surowy ekstrakt białkowy z organu będącego celem reakcji autoimmunologicznej. W przypadku autoimmunologicznego zapalenia przysadki patogenne autoantygeny nie zostały jeszcze zidentyfikowane4, dlatego stosuje się surowy preparat białek przysadki. W tym artykule wideo demonstrujemy, jak wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie przysadki u myszy SJL.

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać eksperymentalnie poprzez wstrzyknięcie białek przysadki zmieszanych z adiuwantem podatnym myszom1. Mysz...

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki charakteryzuje się powiększeniem przysadki mózgowej oraz niedoborem jednego lub więcej hormonów przysadki. Przyczyny powstawania autoantygenów pozostają nieznane. Towarzyszące wideo przedstawia protokół przygotowania immunogenu z przysadki mysiej, który zostanie tutaj wykorzystany do stworzenia modelu mysiego przypominającego ludzkie autoimmunologiczne limfocytarne zapalenie przysadki.Immunogen przysadkowy jest wstrzykiwany szczepowi myszy podatnych. Następnie wstrzyknięcie jest powtarzane po siedmiu dniach, a po 14 dniach pobierana jest krew do badań biomarkerów. W 28. dniu uśpionych myszy pobiera się przysadki, które następnie poddaje się sekcjonowaniu i barwieniu w celu określenia stopnia infiltracji leukocytów.Autoimmunologiczne zapalenie przysadki jest coraz częściej rozpoznawaną chorobą, którą trudno odróżnić od innych niehormonotropowych mas powstających w siodle tureckim. Choć choroba ta została po raz pierwszy opisana około 50 lat temu, autoantygeny rozpoznawane przez układ odpornościowy pacjenta w autoimmunologicznym zapaleniu przysadki pozostawały nieuchwytne. W 2008 roku opublikowaliśmy opracowanie modelu mysiego, który ściśle odwz

induction-of-experimental-autoimmune-hypophysitis-in-sjl-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy SJL

Opóźniona nadwrażliwość (DTH) jest reakcją zapalną pośredniczoną przez limfocyty T pamięci efektorowej (TEM) wykazujące ekspresję CCR7. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak aktywować swoiste dla antygenu komórki TEM, indukować adopcyjną reakcję DTH u szczurów linii Lewis oraz monitorować odpowiedź zapalną.

Indukcja i monitorowanie adoptywnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów

Autoimmunologiczne zapalenie przysadki można wywołać u myszy poprzez wstrzyknięcie ekstraktu z białek przysadki mysiej.

Przygotowanie immunogenu z przysadki mysiej do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki

Film demonstruje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy poprzez wstrzyknięcie kombinacji glikoprotein oligodendrocytów mielinowych i inaktywowanych Mycobacterium tuberculosis. Model umożliwia naukowcom badanie mechanizmów chorobowych i testowanie interwencji terapeutycznych.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli zapalenia tarczycy Hashimoto, podobnie jak spontaniczne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u myszy NOD. Myszy H-2h4 to prosty i niezawodny model do indukcji HT. W tym artykule opisano to podejście i oceniono proces patologiczny w celu lepszego zrozumienia mysiego modelu SAT.

Generacja modelu spontanicznego autoimmunologicznego zapalenia tarczycy u myszy

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Tutaj przedstawiamy protokół ustanawiający mysi model reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) poprzez adoptywny transfer limfocytów T CD4+ od myszy SKG, dostarczając szybkiego i niezawodnego narzędzia eksperymentalnego do badania mechanizmów immunologicznych, patologicznego postępu i rozwoju nowych metod leczenia RZS.

Adoptywny model transferowy reumatoidalnego zapalenia stawów u myszy

Poznaj metodę indukcji autoimmunologicznego zapalenia przysadki mózgowej u myszy SJL przy użyciu immunogenu przysadkowego. Protokół obejmuje iniekcje, pobieranie krwi i analizę histopatologiczną.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Przeglądaj więcej filmów