Name: Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych ulegających ekspresji heterologicznej w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Naucz się mutagenezy ukierunkowanej i analizy patch clamp w komórkach ssaków w celu badania funkcji kanałów jonowych GRK. Ta metoda pozwala ocenić wpływ mutacji punktowych na aktywację kanałów przez alkohol i receptory GPCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasza praca była możliwa dzięki wsparciu finansowemu z McKnight Endowment Fund for Neuroscience (PAS), National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022; PAS) oraz stypendium przeddoktorskiemu NIH NRSA dla P.A. (F31AA017042) z National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Mutanta GIRK2- L257W udostępnił dr Prafulla Aryal. Mikroskop fluorescencyjny oraz sponsoring zostały uprzejmie zapewnione przez Leica Instruments.

1. Mutageneza ukierunkowana
Używamy ssaczego plazmidu ekspresyjnego pcDNA3.1 kodującego cDNA dla GIRK2 i wprowadzamy mutację punktową za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II, zgodnie z instrukcjami producenta.
Sekwencje starterów można łatwo wygenerować, korzystając z internetowego programu do projektowania starterów dostępnego pod adresem: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Uwaga: Zamiast opisanych w protokole probówek BD 14 mL stosujemy standardowe probówki Eppendorf 1,5 mL. Jednakże użycie ultrakompetentnych szczepów E. coli XL10-Gold poddanych wstępnemu traktowaniu β-merkaptoetanolem, 30 s czas szoku termicznego oraz pożywka NZY+ (lub NZYM+) są kluczowe dla pomyślnej mutagenezy. Jeśli to możliwe, wprowadzenie dodatkowej mutacji cichej tworzącej nową sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny może być pomocne podczas screeningu kolonii mutantów opisanego poniżej.
2. Miniprep, sekwencjonowanie DNA i maxiprep
2.1 Miniprep Qiagen i sekwencjonowanie.
Poszczególne kolonie bakteryjne są wyizolowane i hodowane w pożywce LB z ampicyliną (AMP). Oczyszczanie cDNA przeprowadzamy zgodnie z instrukcjami producenta. Do potwierdzenia pomyślnego wprowadzenia mutacji można zastosować prosty trawienie restrykcyjne, jeżeli w kroku 1 powyżej wbudowano miejsce restrykcyjne. Automatyczne sekwencjonowanie DNA jest wykonywane na zewnątrz i jest niezbędne do potwierdzenia obecności mutacji w cDNA, a także do oceny, czy nie wystąpiły żadne niepożądane mutacje. Ten etap jest bardzo ważny. Sekwencjonujemy całą sekwencję kodującą GIRK, używając forwardowego primera dla promotora T7 oraz reverse'owego primera BGH, które flankują miejsce wielokrotnego klonowania plazmidu pcDNA3.1. Uwaga: Ważne jest dokładne przeanalizowanie elektroferogramu sekwencjonowania, aby upewnić się co do wystarczającej jakości danych. Wysokiej jakości elektroferogram charakteryzuje się ostrymi, niezachodzącymi na siebie pikami przy niskim poziomie szumu tła.
2.2 Maxiprep Qiagen.
Postępujemy zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga: Krok ten został uwzględniony w naszych doświadczeniach w celu zwiększenia czystości cDNA, co w naszej ocenie jest istotne dla efektywnej transfekcji.
3. Hodowla i transfekcja komórek HEK293T
Wszystkie te kroki powinny być wykonane w sterylnym dygestorium do hodowli tkanek.
3.1 Hodowla komórkowa
Komórki HEK293T są wygodne w użyciu, ponieważ łatwo je hodować (inkubator z nawilżaniem, 37°C, 5%CO2), charakteryzują się krótkim czasem replikacji, wysoką wydajnością transfekcji i nadają się do elektrofizjologicznych badań metodą patch-clamp całych komórek. Komórki HEK293T wykazują ekspresję dużego antygenu T SV40, który zapewnia replikację episomalną plazmidu pcDNA3.1.
Komórki HEK293T hoduje się w pożywce DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełnionej o L-glutaminę i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W celu pasażowania komórek, do konfluentnych (90-95%) komórek HEK293T dodaje się 0,25% trypsyny/EDTA, oczekuje się, aż komórki odkleją się od naczynia hodowlanego, a następnie hamuje aktywność enzymu poprzez dodanie świeżej pożywki zawierającej FBS. Do 12-dołkowej płytki do hodowli komórek wysiewa się ~ 1 X 105 komórek/dołek wraz z 1 mL pożywki hodowlanej bez antybiotyków na dołek. (1 X 105 komórek to ~ 350 μL zawiesiny komórkowej uzyskanej z konfluentnej kolby T25 resuspensowanej w 10 mL pożywki).
3.2 Transfekcja
Po 8-24 h komórki HEK przylgną do plastiku i będą gotowe do transfekcji. Przenieś do komórek 0,2 μg cDNA kanału, 0,4 μg cDNA receptora M2R oraz 0,04 μg cDNA YFP, korzystając z Invitrogen Lipofectamine 2000. Uwaga: używamy niewielkiej ilości cDNA YFP, aby określić, które komórki zostały pomyślnie transfektowane (komórki zielone prawdopodobnie zawierają zarówno kanały GIRK, jak i receptory M2). Stężenie cDNA będzie wymagało dostosowania dla każdego klonu.
3.3 Wizualizacja fluorescencyjna transfektowanych komórek.
Umieść płytkę 12-dołkową na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i zbadaj komórki pod kątem ekspresji YFP. Porównaj wynik z obrazem DIC i zanotuj przybliżoną liczbę zielonych komórek. Pozwala to na oszacowanie wydajności transfekcji.
3.4 Przygotowanie płytek 24-dołkowych oraz szkiełek nakrywkowych powlekanych poli-D-lizyną
Wyczyść szklane szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm (Warner, CS-12R), potrząsając nimi przez noc w roztworze Radiacwash, a następnie przemyj je wodą dejonizowaną i potrząsaj przez noc w 95% etanolu. Przechowuj czyste szkiełka w 70% etanolu do momentu użycia.
Umieść szkiełka nakrywki w płytce Petriego z etanolem, wypal etanol za pomocą pęsety i palnika, a następnie przenieś szkiełko do jednego dołka sterylnej płytki 24-dołkowej.
Każdą studzienkę wypełnij 250 μL roztworu poli-D-lizyny (PDL) [0.2 mg/mL] i pozostaw szkiełka nakrywkowe przez noc w roztworze PDL pod sterylnym dygestorium. Owiń płytkę 24-dołkową Parafilmem, aby zapobiec parowaniu.
Następnego dnia rano odessać PDL i przemyć 2x sterylną wodą. Pozostawić płytki otwarte do wyschnięcia pod dygestorium, a następnie przykryć. Płytki 24-dołkowe z powleczonymi szkiełkami nakrywkowymi można owinąć sterylną folią aluminiową i przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
3.5 Wysiewanie transfekowanych komórek HEK293T na szkiełka podstawowe
24 h po transfekcji podzielone komórki należy przenieść do płytki 24-dołkowej (~4 X 103 komórek/dołek), zawierającej szklane szkiełka nakrywki pokryte poli-D-lizyną. Uwaga: przetransfekowane komórki można wykorzystać do 24-72 h po transfekcji. Komórki są dzielone w celu przygotowania pojedynczych szkiełek nakrywek do eksperymentów elektrofizjologicznych metodą patch clamp.	
4. Elektrofizjologia
4.1 Przygotowanie roztworów
Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpiel): 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 oraz 10 mM HEPES (pH 7.4 ustawione za pomocą NaOH).
Odmierz 20 K roztworu do kąpieli i dodaj odpowiednie modulatory
<ul>
	<li>20K + Ba2+: roztwór zawierający 1 mM BaCl2: specyficzny inhibitor prądów prostujących do wnętrza komórki</li>
	<li>20K + Karbachol: roztwór z 5 μM karbacholu: specyficzny agonista M2R; M2R sprzęga się z białkami G, które otwierają kanały GIRK</li>
	<li>20K + Etanol: roztwór kąpielowy zawierający 100 mM EtOH w celu bezpośredniej aktywacji kanałów GIRK</li>
</ul>
Nalej roztwory do kąpieli do strzykawek (pojemników na roztwory) systemu szybkiej wymiany perfuzyjnej. Uwaga: Do sterowania roztworami do kąpieli stosujemy system zaworów zaciskowych Warner. Zaleca się stosowanie przewodów PE.
Roztwór wewnętrzny/elektrodowy: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.4) z 2.5 mM K2ATP i 0.3 μM Li2GTP.
Przygotowujemy roztwór do elektrody bez ATP i GTP. Oddzielnie przygotowujemy alikwoty ATP i GTP, które są przechowywane w temperaturze -80°C, i dodajemy je do roztworu do elektrody w dniu eksperymentu. Strzykawkę z końcowym roztworem do elektrody przechowujemy na lodzie, aby zachować stabilność ATP/GTP. Roztwory wewnętrzne i zewnętrzne filtrujemy sterylnie (0,2 μm), aby zapobiec wzrostowi mikroorganizmów i zmniejszyć ryzyko zapchania rurek oraz elektrody.
4.2 Wytciąganie elektrod
Używamy dwustopniowej pionowej wyciągarki Narishige oraz elektrod z borokrzemianowego szkła firmy Warner Instrument (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm i długość 7,5 cm), aby uzyskać elektrody o oporności od 3 do 7 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.
Uwaga: Konieczne jest eksperymentalne ustalenie parametrów dla wyciągacza elektrod oraz rodzaju szkła elektrodowego w Twoim laboratorium. W przypadku naszego wyciągacza pionowego stosujemy ustawienie temperatury 60,2 dla pierwszego wyciągnięcia i ~43 dla drugiego wyciągnięcia.
4.3 Patch clamp w konfiguracji whole-cell
<ol>
	<li>Zamocuj szkiełko nakrywkę w 35 mm szalce za pomocą niewielkiej ilości wazeliny, zalej roztworem zewnętrznym i umieść szalkę na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj DIC do ustawienia ostrości i znalezienia komórek, a następnie przełącz na fluorescencję YFP, aby zlokalizować komórki wykazujące ekspresję YFP.</li>
	<li>Ustaw końcówkę manifoldu perfuzyjnego w pobliżu zielonej komórki (20-30 μm od komórki docelowej, co odpowiada 2-3 długościom komórki).</li>
	<li>Wypełnij elektrody roztworem i podłącz je do głowicy wzmacniacza Axopatch 200B (Axon Instruments) z następującymi ustawieniami początkowymi: Gain 1, Configuration: whole-cell β=1, mode V-clamp.</li>
	<li>Przyłoź dodatnie ciśnienie do elektrody, aby zapobiec zapchaniu pipety, a następnie za pomocą manipulatora umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką.</li>
	<li>Aby wyzerować potencjał pipety, wybierz przycisk Seal Test w celu podania testowego skoku napięcia. Prostokątny skok napięcia o wartości 5 mV pojawi się w oknie Seal Test programu Clampex. Dostosuj potencjometr Pipette Offset we wzmacniaczu, aby sprowadzić prąd bazowy do 0 nA. Alternatywnie, wyzeruj potencjał pipety, przełączając selektor trybu wzmacniacza na tryb V-track, a pokrętło miernika na Vtrack, i użyj potencjometru Pipette Offset we wzmacniaczu, aby ustawić wartość na wyświetlaczu miernika wzmacniacza na „0.00”.</li>
	<li>Sprawdź rezystancję elektrody, korzystając z funkcji seal test w oprogramowaniu Clampex 8.2 (powinna wynosić 3-7 MΩ).</li>
	<li>Otwórz zapisany plik protokołu lub utwórz nowy. Aby otworzyć plik protokołu, wybierz z menu głównego Acquire, następnie Open Protocol i wybierz zapisany plik protokołu napięciowego. W tym eksperymencie protokół został stworzony tak, aby utrzymywać potencjał błonowy na poziomie -40mV, podać pojedynczy 50 ms skok napięcia do -100 mV, a następnie rampę do +40 mV w czasie 200 ms. Protokół ten jest wykonywany co 2 sekundy. Protokół rampowy pozwala na obserwację potencjału odwrócenia i prostowania dośrodkowego kanałów GIRK. W przypadku kanałów jonowych sterowanych napięciem bardziej odpowiedni może być prostokątny skok napięcia.</li>
	<li>Zbliż się do komórki, korzystając z precyzyjnej regulacji manipulatora, zwolnij dodatnie ciśnienie, a po dotknięciu powierzchni komórki przyłoź ciśnienie ujemne i monitoruj wzrost rezystancji w oknie oscyloskopu Seal Test. Gdy rezystancja osiągnie zakres GΩ, elektroda zostanie uszczelniona na błonie (powstał tzw. Gigaseal).</li>
	<li>Przyłoź impuls ujemnego ciśnienia, aby przerwać błonę komórkową i uzyskać dostęp do wnętrza komórki. Po przejściu do konfiguracji whole-cell zarejestrujesz wzrost prądów pojemnościowych.</li>
	<li>Przełącz się na Membrane Test w programie Clampex i zapisz rezystancję dostępu Ra, rezystancję błony Rm, pojemność błony Cm oraz zweryfikuj wzrokowo dopasowanie wykładnicze teoretycznej krzywej do rzeczywistego prądu pojemnościowego. Pojemność błony jest proporcjonalna do wielkości komórki i zostanie później wykorzystana do obliczenia gęstości prądu.</li>
	<li>Przełącz się z powrotem na Seal Test, ustaw V-Out (potencjał błonowy) na -40 mV i filtr na 10 kHz.</li>
	<li>Kompensuj pojemność błony i rezystancję szeregową we wzmacniaczu w następujących krokach:
	<ol class="lalpha">
 	<li>Włącz przełącznik WHOLE CELL CAP. Reguluj pokrętłami WHOLE CELL CAP i SERIES RESISTANCE w przód i w tył, aż uzyskasz płaski impuls testowy. Może być konieczna również regulacja pokrętła pojemności pipety FAST CAP.</li>
		<li>Ustaw pokrętło % PREDICTION na około 60-80%, ponownie regulując WHOLE CELL CAP oraz pokrętło SERIES RESISTANCE (może być konieczna również regulacja pokrętła kompensacji pojemności pipety FAST CAP).</li>
		<li>Ustaw % COMP- na 100% bez wywoływania oscylacji komórki, starając się utrzymać płaski impuls poprzez ponowną regulację WHOLE CELL CAP i SERIES RESISTANCE (może być konieczna również regulacja pokrętła kompensacji pojemności pipety FAST CAP). Dostosuj lag, zmniejszając stałą czasową.</li>
		<li>Zapisz w notatniku wartości Cm (pojemność błony), Rs (rezystancja szeregowa), %COMP, %PRED oraz czas opóźnienia (Lag time) ustawione we wzmacniaczu. Wartości Cm i Rs powinny być w przybliżeniu takie same jak Cm i Rm zmierzone wcześniej w Membrane Test.</li>
 </ol>
 </li>
	<li>Otwórz zawór roztworu zewnętrznego, aby kontrolować roztwór w kąpieli. Ustaw 8-biegunowy filtr Bessela we wzmacniaczu na 2kHz, otwórz protokół clampy napięciowej i rozpocznij rejestrację prądów.</li>
	<li>Rejestrujemy prądy GIRK przy użyciu protokołu rampowego, który obejmuje skok do -100 mV przez 50 ms, a następnie rampę od -100 mV do +40 mV w czasie 200 ms, podawaną co 2 sekundy. Protokół rampowy pozwala na obserwację potencjału odwrócenia i właściwości prostowania dośrodkowego kanałów GIRK. W temperaturze pokojowej (22-25° C) prąd GIRK powinien odwrócić się w pobliżu -50 mV (przy 20 mM KCl w kąpieli), co jest bliskie obliczonemu potencjałowi równowagi dla K (EK = -50 mV), a następnie pozostać w miarę płaski przy potencjałach dodatnich względem EK.</li>
	<li>Protokół eksperymentalny: Po zarejestrowaniu stabilnej linii bazowej przełącz na roztwór 20K + Karbachol i poczekaj na szczyt odpowiedzi, wróć do roztworu kąpieli 20K, następnie przyłoź 20K + Etanol i poczekaj na szczyt odpowiedzi, wróć do roztworu kąpieli 20K, a na koniec przełącz na roztwór 20K + Ba2+. Podczas aplikacji tych leków zauważysz zmiany w amplitudzie prądów GIRK (najbardziej wyraźne przy -100 mV). Zanotuj w notatniku numer śladu odpowiadający aplikacji różnych roztworów zewnątrzkomórkowych. Pojedynczy plik Clampfit będzie zawierał wszystkie przebiegi dla całego eksperymentu.</li>
</ol>
5. Analiza danych
Do analizy danych dotyczących prądów GIRK przy -100 mV wykorzystujemy oprogramowanie Clampfit 9.2.
<ol>
	<li>Otwórz plik z zapisem, ustaw kursor na -100 mV. Domyślnie wszystkie ślady będą widoczne na ekranie w formie nałożonej. Po kliknięciu ikony „Write cursors” zostanie utworzony arkusz kalkulacyjny z danymi numerycznymi w formacie Excel.</li>
	<li>Przypisując oś X do kolumny z numerami śladów, a oś Y do kolumny z kursorami i klikając ikonę „Create Graph”, można szybko narysować wykres przebiegu czasowego eksperymentu.</li>
	<li>Oblicz prąd podstawowy, odejmując prąd w obecności Ba2+ od prądu zarejestrowanego w samym roztworze perfuzyjnym („prąd 20K” minus „prąd 20K + Ba2+”). Oblicz prądy indukowane, odejmując prąd podstawowy w 20K od prądów aktywowanych („prąd 20K + karbachol” minus „prąd 20K”; „prąd 20K + etanol” minus „prąd 20K”). Oblicz gęstość prądu (pA/pF), dzieląc prąd przez pojemność błony (odczytaną bezpośrednio z wzmacniacza). Oblicz procent aktywacji, dzieląc prądy indukowane przez prądy podstawowe i mnożąc wynik przez 100.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Powinieneś być w stanie zarejestrować prądy z komórek transfekowanych kanałami typu dzikiego. W przypadku kanałów GIRK mierzonych w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym 20 mM K+ (oraz 145 mM K+ wewnątrzkomórkowo), powinny one wykazywać silną prostowanie do wewnątrz oraz potencjał odwrócenia wynoszący ~ -50 mV, co jest kluczową właściwością kanałów potasowych. Prąd typu dzikiego będzie silnie wzrastał po zastosowaniu karbacholu (3-5 krotny wzrost w stosunku do prądu bazowego) i podobnie reagował na 100 mM etanolu. Uwaga: w elektrofizjologii przyjęto konwencję znaków, zgodnie z którą prąd wewnątrzkomórkowy jest ujemny, a prąd zewnątrzkomórkowy jest dodatni. W przypadku mutacji L257W w kieszeni wiążącej alkohol kanału GIRK2, zaobserwujesz osłabione odpowiedzi zarówno na karbachol, jak i etanol. Sugeruje to, że L257 bierze udział w aktywacji kanałów GIRK2 przez alkohol i białka G. Dalsze przykłady wyników mutogenezy GIRK2 można znaleźć w niedawnej publikacji Aryal et al.1.
<img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Analiza danych elektrofizjologicznych, wykresy przedstawiające aktywność kanałów GIRK2, wykorzystane w badaniu patch-clamp." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Okno programu Clampfit 8.0 przedstawia plik danych z rejestracji GIRK2 typu dzikiego. Górny lewy panel pokazuje nałożone na siebie przebiegi zarejestrowane w odpowiedzi na protokół rampowy napięcia w obecności różnych zewnętrznych roztworów Ba. Kursor 1 jest ustawiony na -100 mV. Wartości kursora są zapisane w arkuszu kalkulacyjnym (prawy panel). Dolny lewy panel przedstawia wykres numeru przebiegu w funkcji prądu. Zwróć uwagę na wzrost prądu (odchylenie w dół) przy zastosowaniu etanolu (EtOH) i karbacholu (Carb) oraz inhibicję prądu przez Ba2+.
<img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Analiza elektrofizjologiczna z danymi patch-clamp, GIRK2 L257W; wykresy prądów jonowych, oprogramowanie Clampfit." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Okno programu Clampfit 8.0 przedstawia plik danych z pomiaru mutantu GIRK2-L257W. Opisy są takie same jak na Rycini 1. Zwróć uwagę na brak aktywacji karbacholem (Carb) oraz redukcję prądów indukowanych przez EtOH w kanałach mutantowych.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Mutageneza celowana jest klasycznym podejściem do badania relacji struktura-funkcja kanałów jonowych. Opiera się ona na założeniu, że poprzez zmianę krytycznego reszty aminokwasowej kanału jonowego powinno być możliwe zaobserwowanie wyraźnych zmian w funkcji kanału. W przeciwieństwie do tego, wiele mutacji w pozycjach niekrytycznych można wprowadzić bez istotnych zaburzeń funkcji kanału. Typowo, rozważaną resztę mutuje się najpierw na alaninę, mały aminokwas niepolarny, a następnie na tryptofan, największy z aminokwasów2. Jeśli reszta jest istotna dla funkcji kanału, obie mutacje zmienią aktywność kanału. W przypadku zmutowania reszty mniej istotnej, efekty mutacji, zwłaszcza na alaninę, są często niezauważalne. Mutacje na tryptofan częściej powodują zmiany ze względu na zawadę steryczną związaną z rozmiarem tryptofanu. Często, w przypadku braku informacji strukturalnych, do zlokalizowania krytycznych reszt można wykorzystać systematyczną mutację na alaninę lub tryptofan w obrębie fragmentu kanału (tzw. skanowanie alaninowe lub tryptofanowe). Ważne jest, aby zauważyć, że równolegle można przygotować wiele klonów z różnymi mutacjami punktowymi, co pozwala na przetestowanie wielu reszt w stosunkowo krótkim czasie. Niedawno udostępnionych zostało wiele struktur krystalicznych kanałów3,4,5. Mogą one służyć do zaproponowania potencjalnych kluczowych reszt do przetestowania przy użyciu podejścia opisanego w niniejszym protokole.
Pomiary kanału typu dzikiego powinny zawsze towarzyszyć pomiarom kanału zmutowanego, aby służyć jako kontrola pozytywna potwierdzająca prawidłowe przeprowadzenie transfekcji oraz eksperymentów elektrofizjologicznych. Mutacje punktowe mogą prowadzić do braku funkcjonalnego prądu, prądu zbliżonego do typu dzikiego lub zmienionej regulacji aktywności kanału. Brak mierzalnego prądu może wynikać z nieprawidłowego fałdowania białka lub zaburzonego transportu wewnątrzkomórkowego. W takim przypadku pomocne może być ustalenie, czy kanał jest prawidłowo transportowany na powierzchnię komórki, z wykorzystaniem testu z biotinylacją lub barwienia immunofluorescencyjnego przeciwko znacznikowi zewnątrzkomórkowemu (bez permeabilizacji komórek), aby odróżnić niefunkcjonalne kanały znajdujące się w błonie plazmatycznej od kanałów zatrzymanych wewnątrz komórki. Na koniec zaleca się zbadanie nie tylko aktywności podstawowej kanału, ale także wpływu mutacji na jego regulację. W zależności od badanego kanału jonowego można badać różne mechanizmy modulacji funkcji kanału, w tym regulację przez białka G, PIP2, jony, stężenie ATP, fosforylację (przy użyciu mutacji tyrozyny, seryny lub treoniny), ubikwitynację lub sumoilację (przy użyciu mutacji lizyny) oraz bezpośrednie otwieracze lub blokery kanałów.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki chemiczne</td><td>Sigma</td><td>Zmienne</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mini-preparacji</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Można również zastosować poli-L-lizynę</td></tr><tr><td>Zestaw do Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy kierowanej QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywki &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane borokrzemianowe o standardowej ściance</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;Odwrócony mikroskop fluorescencyjny&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Elektrofizjologia</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Dowolny odwrócony mikroskop DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;mikroskop fluorescencyjny</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Molecular Devices</td><td>Wzmacniacz Axon Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusja MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizator</td><td>Molecular Devices</td><td>digitalizator Digidata 1320</td><td></td></tr><tr><td>Manipulatory</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipulator: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Wyciągacz elektrod</td><td>Narishige</td><td>pionowy wyciągacz elektrod PC10</td><td></td></tr><tr><td>Tabela izolacji</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Stół pneumatyczny</td><td></td></tr></tbody></table>

mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Zademonstrujemy, jak badać funkcjonalne efekty wprowadzenia mutacji punktowej w kanale jonowym. Badamy kanały potasowe wewnątrzstymulowane sterowane białkami G (zwane GIRK), które są istotne dla regulacji pobudliwości neuronów. Istnieją cztery różne podjednostki kanałów GIRK u ssaków (GIRK1-GIRK4) – skupiamy się na GIRK2, ponieważ tworzy on homotetramer. Stymulacja różnych typów receptorów sprzężonych z białkami G (GPCR), takich jak receptor muskarynowy (M2R), prowadzi do aktywacji kanałów GIRK. Alkohol również bezpośrednio aktywuje kanały GIRK. Pokażemy, jak zmutować jeden aminokwas poprzez specyficzną zmianę jednego lub większej liczby nukleotydów w cDNA kanału GIRK. Ta zmutowana sekwencja cDNA zostanie namnożona w bakteriach, oczyszczona, a obecność mutacji punktowej zostanie potwierdzona za pomocą sekwencjonowania DNA. cDNA dla zmutowanych i dzikich kanałów GIRK zostaną przetransfekowane do ludzkich komórek embrionalnej nerki HEK293T hodowanych in vitro. Na koniec zastosowana zostanie elektrofizjologia metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell, aby zbadać makroskopowe prądy potasowe przepływające przez ektopowo eksponowane kanały GIRK typu dzikiego lub zmutowane. W tym doświadczeniu zbadamy wpływ mutacji L257W w kanałach GIRK2 na aktywację zależną od M2R oraz zależną od alkoholu.

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Zaprezentujemy sposób badania efektów funkcjonalnych wprowadzenia mutacji punktowej w kanale jonowym. Badamy białka GIRK (G protein-gated inwardly rectifying ...

Białkowe kanały potasowe wewnątrzstymulowane, bramkowane przez białka G (GIRK), są istotne dla regulacji pobudliwości neuronów. Kanały GIRK mogą być aktywowane zarówno przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), takie jak receptor muskarynowy M2R, jak i przez alkohol. Aby zbadać wpływ mutacji w miejscu wiązania alkoholu w kanale GIRK, wprowadzany jest pojedynczy punktowy zastąpienie w cDNA GIRK za pomocą mutogenezy celowanej. Oczyszczone konstrukty GIRK wraz z konstruktami YFP są transfektowane do komórek ssaków, a wydajność transfekcji jest oceniana za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.Następnie przeprowadzana jest analiza patch-clamp w konfiguracji whole-cell, aby porównać aktywację zależną od alkoholu i białek G. Ta wizualna demonstracja eksperymentalna dostarczy kluczowych informacji na temat badania funkcji kanałów LY. Dzisiaj przyjrzymy się kwestii tego, w jaki sposób alkohol aktywuje kanały grupowe.Przedstawiona tutaj technika ukierunkowanej neogenezy może dostarczyć informacji na temat funkcji kanałów jonowych. Technikę tę można zastosować również w innych układach, w których znane jest, że mutacja w genie powoduje chorobę u ludzi. Są to demonstracje techniki patch-clamp w komórkach, która jest krytyczna, ponieważ istnieje wiele etapów wymagających precyzji, odpowiedniej kompensacji elektronicznej oraz praktyki w celu uzyskania użytecznych danych.DNA wykorzystywany do transfekcji w tym protokole jest przygotowywany w następujący sposób. Najpierw podjednostkę GRK, DNA otrzymane z PCR, klonuje się bezpośrednio do wektora ekspresyjnego ssaków. Do plazmidu pCDNA 3.1 wprowadza się mutacje punktowe, wykorzystując odpowiednio zaprojektowane primery oraz zestaw do mutagenezy kierowanej QuickChange XL II.Przy użyciu tego systemu przeprowadza się reakcję PCR, w której replikowany jest cały plazmid, a wprowadzone są mutacje punktowe zakodowane w starterach. Po reakcji PCR zreplikowane plazmidy są trawione enzymem restrykcyjnym DpnI, a następnie transformowane metodą szoku termicznego do ultrakompetentnych bakterii e. coli XL 10-gold. Transformowane bakterie są hodowane na płytkach z agarem LB z ampicyliną; bakterie zawierające plazmid wykazują oporność na ampicylinę i tworzą kolonie.Wyizolowane kolonie są pobierane i hodowane w kulturach miniaturowych. Następnie przeprowadza się miniprzeparowania w celu wyizolowania plazmidowego DNA. DNA jest następnie sekwencjonowane, aby zidentyfikować skutecznie przekształcone mutanty.Bakterie E coli są hodowane w większej partii, a następnie wykonuje się maxi preps w celu przygotowania większych ilości plazmidowego DNA. Do każdego z dwóch dołków płytki 12-dołkowej wysiewa się około 1×10⁵ komórek HEK 293T: jeden dołek dla mutanta i jeden dla kontroli (kanał typu dzikiego). Inkubować w temperaturze 37 °C.Po upływie od 8 do 24 godzin komórki przylgną do podłoża i będą gotowe do transfekcji. Przeprowadź transfekcję komórek za pomocą lipo 2000 zgodnie z instrukcjami producenta, stosując 0,2 µg cDNA kanału, 0,4 µg cDNA receptora M2R oraz 0,04 µg Y-F-P-C-D-N-A. W celu zidentyfikowania skutecznie transfektowanych komórek inkubuj je przez 24 godziny.Po upływie wymaganego czasu inkubacji umieść komórki na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby określić wydajność transfekcji. Porównaj obrazy fluorescencyjne i DIC, aby wyznaczyć procent przetransfekowanych komórek. Przenieś naczynie hodowlane z powrotem do inkubatora.Oczyścić szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i przechowywać w etanolu do momentu użycia. Usunąć resztki etanolu poprzez opalenie w komorze sterylnej. Umieścić szkiełka nakrywkowe na płytce 24-dołkowej i pokryć je warstwą 0,2 mg/ml.24 godziny po transfekcji komórki na polilizynie poddać trypsynizacji i wysiać w zagęszczeniu 4 × 10³ komórek na dołek. W czterech do ośmiu dołkach płytki 24-dołkowej zawierającej szkiełka podstawowe pokryte polilizyną inkubować przez kolejne 24 do 48 godzin przed przeprowadzeniem metody whole-cell patch clamp. Przygotować elektrody patch za pomocą dwustopniowej pionowej wyciągarki i szkła borokrzemowego do elektrod.W idealnym przypadku gotowa elektroda będzie miała rezystancję od trzech do siedmiu megaomów i nie będzie wymagała dodatkowej obróbki, takiej jak polerowanie termiczne. Do przeprowadzenia metody patch-clamp należy umieścić szkiełko podstawowe z transfekowanymi komórkami w szalce o średnicy 35 milimetrów zawierającej zewnętrzny roztwór 20 milimolowego potasu lub 20 K. Szalkę należy umieścić na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.Układ do techniki patch clamp zastosowany w tym badaniu wykorzystuje system perfuzji. System ten zawiera roztwory zewnątrzkomórkowe, które są podawane do komórek poprzez rurki podłączone do rozdzielacza, wykorzystując siłę grawitacji. Podawanie każdego roztworu jest sterowane zdalnie za pomocą elektromagnetycznego zaworu zaciskowego.Użyj kontrastu DIC, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki. Przełącz na filtr YFP, aby odnaleźć komórki pozytywne pod kątem YFP. Po zidentyfikowaniu komórek pozytywnych pod kątem YFP, ustaw końcówkę systemu perfuzji, neuro fluorescent cell, w odległości od 20 do 30 µm lub dwóch do trzech długości komórek.Napełnij elektrodę wewnętrznym roztworem elektrodowym. Używając strzykawki i giętkiej igły, delikatnie ostukaj napełnioną elektrodę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki. Podłącz elektrody do głowicy wzmacniacza AXO patch 200 B.Ponownie sprawdź, czy ustawienia wzmacniacza odpowiadają jednej konfiguracji. Przełącznik whole cell ustawiony jest na beta równy 1, a filtr dolnoprzepustowy naczynia ustawiony jest na 10 kilohertz. Przy zastosowaniu strzykawki i zacisku wywieraj dodatnie ciśnienie, aby utrzymać końcówkę elektrody w czystości.Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę elektrody w kąpieli i przesuń ją nad komórkę. Przełącz wzmacniacz w tryb V track, a pokrętło miernika na V track. Następnie użyj miernika potencjału offsetowego pipety we wzmacniaczu, aby wyzerować potencjał pipety, sprowadzając napięcie na wyświetlaczu miernika wzmacniacza do wartości 0.00.Alternatywnie można przełączyć wzmacniacz w tryb zaciskania napięcia (V clamp) i wybrać przycisk impulsu testowego, aby podać testowy skok napięcia. Prostokątny skok napięcia pojawi się w oknie testu szczelności (seal test) programu clamp. Należy dostosować offset pipety na wzmacniaczu, aby sprowadzić prąd linii bazowej do zera nA.Test szczelności wykaże oporność elektrody, która powinna wynosić od trzech do siedmiu megaomów. Następnie zamknij okno testu szczelności. Z menu rozwijanego wybierz opcję „acquire open protocol”.Następnie należy wybrać zapisany protokół napięcia. W tym przypadku wybrany protokół został zaprogramowany tak, aby dostarczyć pojedynczy skok napięcia do minus 100 millivolts, a następnie zwiększać je do plus 40 millivolts co dwie sekundy. Ten protokół rampowy umożliwia obserwację potencjału odwrócenia oraz właściwości prostowania do wewnątrz kanałów GK.W przypadku napięciowo zależnych kanałów jonowych bardziej odpowiedni może być prostokątny skok napięcia. Przy użyciu precyzyjnej regulacji mikromanipulatora należy zbliżyć się do komórki i zwolnić nadciśnienie, a po dotknięciu powierzchni komórki przyłożyć niewielkie podciśnienie. Należy monitorować wynikający z tego wzrost rezystancji w teście szczelności. Gdy rezystancja osiągnie zakres gigaomów, oznacza to, że elektroda utworzyła uszczelnienie z błoną.Zjawisko to nazywa się giga-uszczelnieniem (giga seal). Za pomocą strzykawki należy przyłożyć impuls podciśnienia, aby przerwać membranę i uzyskać dostęp do wnętrza komórki. Po przejściu w konfigurację whole-cell, test szczelności wykaże duże prądy pojemnościowe, które są widoczne jako piki lub zjawiska przejściowe na początku i na końcu testu.Impuls w teście szczelności. Następnie kliknij przycisk testu błony. W zacisku X zarejestruj oporność dostępową oraz oporność błony.Pojemność błony w notatniku pozwala na wizualną weryfikację dopasowania wykładniczego. Pojemność błony jest proporcjonalna do wielkości komórki i zostanie wykorzystana do obliczenia gęstości prądu. Opór dostępu oraz opór błony są używane do oceny, czy rejestracja będzie wystarczająca do kontynuowania pomiarów.Dobre nagranie powinno charakteryzować się niską rezystancją dostępu. Teraz zamknij okno testu membrany i ponownie kliknij przycisk testu uszczelnienia; w oknie testu uszczelnienia ustaw V out na minus 40 millivolts, aby zrekompensować pojemność membrany i rezystancję szeregową na wzmacniaczu, włącz funkcję whole cell cap, a następnie reguluj whole cell cap oraz rezystancję szeregową, aż do zminimalizowania stanu przejściowego i uzyskania płaskiej linii prądu. W razie potrzeby wyreguluj pojemność pipety za pomocą pokrętła fast cap na wzmacniaczu.Zbyt duża lub zbyt mała kompensacja spowoduje wystąpienie przejściowego stanu pojemności resztkowej. Następnie należy obrócić pokrętło przewidywanego procentu (percentage prediction) do wartości 60–80% i w razie potrzeby ponownie dostroić pojemność całokomórkową (whole cell cap), rezystancję szeregową (series resistance) oraz szybką pojemność (fast cap), aby uzyskać linię płaską w teście szczelności (seal test). Na koniec należy ustawić kompensację procentową (percentage comp) na około 100% bez wywoływania oscylacji komórki, starając się zachować jak największą liniowość impulsu poprzez ponowną regulację potencjometrów pojemności całokomórkowej, rezystancji szeregowej oraz szybkiej pojemności.Po przeprowadzeniu kompensacji rezystancji i pojemności, zapisz w notatniku wartości ustawione dla procentowej rezystancji szeregowej pojemności wzmacniacza, procentowej kompensacji, przewidywanego czasu opóźnienia oraz lag time, a następnie otwórz zawór zewnętrznego roztworu dla łaźni kontrolnej 20 K. Ustaw filtr dolnoprzepustowy naczynia we wzmacniaczu na 2 kHz. Następnie rozpocznij rejestrację prądów, klikając przycisk record w oprogramowaniu.Należy sprawdzić właściwość prostowania do wewnątrz prądu GER. Przejawia się ona jako duży prąd wewnątrzkomórkowy przy wartościach ujemnych względem potencjału odwrócenia dla potasu, wyznaczonego równaniem Nernsta EK, oraz mały prąd zewnątrzkomórkowy przy wartościach dodatnich względem EK. Po zarejestrowaniu stabilnej linii bazowej należy określić aktywację prądów za pośrednictwem receptorów poprzez zastosowanie roztworu zewnątrzkomórkowego 20 K plus karbacholu.Po zaobserwowaniu szczytowej aktywacji i osiągnięciu stanu stacjonarnego prądu, należy powrócić do roztworu kąpieli K i odczekać do momentu osiągnięcia poziomu prądu bazowego. Następnie, w celu zbadania aktywacji prądów gert przez alkohol, należy przełączyć na zewnętrzny roztwór 20 k plus 100 millimolar ethanol i odczekać na odpowiedź szczytową.Następnie powróć do roztworu kąpieli 20 K i poczekaj, aż zostanie osiągnięty poziom prądu bazowego. Na koniec, aby wyznaczyć bazowe prądy gert, przełącz na roztwór 20 K plus 20 K baru i odczekaj na reakcję. Inhibicja prądu gerk powinna być widoczna i najbardziej wyraźna przy minus 100 millivolts w trakcie całej procedury.Należy odnotować numer przebiegu (sweep), który odpowiada zastosowaniu różnych roztworów zewnątrzkomórkowych. Pojedynczy plik programu clamp fit będzie zawierał wszystkie przebiegi dla całych eksperymentów. Do analizy danych GK należy użyć oprogramowania clamp FIT 8.2.Zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym, uzyskano dwa różne zapisy całokomórkowe z komórek HEC 2 9 3 T wykazujących ekspresję kanałów GK typu dzikiego lub zmutowanych, a następnie przeanalizowano je zgodnie z instrukcjami w tym filmie, jak pokazano tutaj dla GK dwa typu dzikiego. Panel po lewej stronie zawiera okno z kilkoma nałożonymi na siebie prądami, które zostały wygenerowane przez protokół rampy napięciowej w obecności różnych roztworów. Należy zwrócić uwagę na prostowanie do wewnątrz.Jest to większy prąd wewnątrzkomórkowy przy -100 mV około 50 ms na zapisie prądu. Mały prąd zewnątrzkomórkowy między 0 a +40 mV około 200 do 260 ms na zapisie prądu pochodzi z endogennego napięciowo zależnego kanału potasowego. Nie jest to prąd Gert.Kursor zostaje umieszczony nad maksymalnym prądem wewnątrzkomórkowym, a wartości kursora są wpisywane do arkusza kalkulacyjnego. W arkuszu widoczne są numer śladu oraz wartość prądu przy -100 mV.Dane obejmują prąd spoczynkowy, prądy indukowane karbacholem i wywołane alkoholem, a także prąd hamowany barem. Przedstawiono również prądy w funkcji rampy napięciowej w obecności różnych roztworów. Dla zmutowanego kanału L 2 57 w pokazano wyniki dla 20 k plus 100 mM etanolu lub 20 k plus 5 mM karbacholu lub 20 k plus bar.Zwróć uwagę na znacznie mniejsze prądy indukowane alkoholem i carboalcoholem. Wyniki te sugerują, że pozostałość ta odgrywa istotną rolę w bramkowaniu kanałów GK przez alkohol i podjednostki g beta gamma. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wprowadzić mutację w an oraz rozpocząć badanie jej wpływu na funkcję kanału przy użyciu zaawansowanych technik elektrofizjologicznych.Po opanowaniu metody, ta technika neogenezy skierowanej na konkretne miejsce może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch do trzech dni i rozszerzona do pięciu lub więcej mutacji. Opracowanie tych technik utorowało drogę biofizykom kanałów jonowych do badania podstawowych właściwości funkcji i bramkowania kanałów jonowych. Ponadto pozwalają one badaczom na studiowanie ludzkich chorób wywołanych pojedynczą mutacją w genie kanału jonowego.

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych ekspresowanych heterologicznie w komórkach ssaków

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Badanie kanałów jonowych za pomocą heterologicznie wyrażającego systemu stało się podstawową techniką w badaniach biomedycznych. W tym manuskrypcie przedstawiamy efektywną czasowo metodę osiągania ściśle kontrolowanej ekspresji kanału jonowego poprzez przeprowadzanie transfekcji przejściowej pod kontrolą indukowalnego promotora.

Kontrolowana ekspresja kanału jonowego poprzez indukowalną transfekcję przejściową

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Naucz się mutagenezy ukierunkowanej i analizy patch clamp w komórkach ssaków w celu badania funkcji kanałów jonowych GRK. Ta metoda pozwala ocenić wpływ mutacji punktowych na aktywację kanałów przez alkohol i receptory GPCR.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów