Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Białkowe kanały potasowe wewnątrzstymulowane, bramkowane przez białka G (GIRK), są istotne dla regulacji pobudliwości neuronów. Kanały GIRK mogą być aktywowane zarówno przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), takie jak receptor muskarynowy M2R, jak i przez alkohol. Aby zbadać wpływ mutacji w miejscu wiązania alkoholu w kanale GIRK, wprowadzany jest pojedynczy punktowy zastąpienie w cDNA GIRK za pomocą mutogenezy celowanej. Oczyszczone konstrukty GIRK wraz z konstruktami YFP są transfektowane do komórek ssaków, a wydajność transfekcji jest oceniana za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Następnie przeprowadzana jest analiza patch-clamp w konfiguracji whole-cell, aby porównać aktywację zależną od alkoholu i białek G. Ta wizualna demonstracja eksperymentalna dostarczy kluczowych informacji na temat badania funkcji kanałów LY. Dzisiaj przyjrzymy się kwestii tego, w jaki sposób alkohol aktywuje kanały grupowe.

Przedstawiona tutaj technika ukierunkowanej neogenezy może dostarczyć informacji na temat funkcji kanałów jonowych. Technikę tę można zastosować również w innych układach, w których znane jest, że mutacja w genie powoduje chorobę u ludzi. Są to demonstracje techniki patch-clamp w komórkach, która jest krytyczna, ponieważ istnieje wiele etapów wymagających precyzji, odpowiedniej kompensacji elektronicznej oraz praktyki w celu uzyskania użytecznych danych.

DNA wykorzystywany do transfekcji w tym protokole jest przygotowywany w następujący sposób. Najpierw podjednostkę GRK, DNA otrzymane z PCR, klonuje się bezpośrednio do wektora ekspresyjnego ssaków. Do plazmidu pCDNA 3.1 wprowadza się mutacje punktowe, wykorzystując odpowiednio zaprojektowane primery oraz zestaw do mutagenezy kierowanej QuickChange XL II.

Przy użyciu tego systemu przeprowadza się reakcję PCR, w której replikowany jest cały plazmid, a wprowadzone są mutacje punktowe zakodowane w starterach. Po reakcji PCR zreplikowane plazmidy są trawione enzymem restrykcyjnym DpnI, a następnie transformowane metodą szoku termicznego do ultrakompetentnych bakterii e. coli XL 10-gold. Transformowane bakterie są hodowane na płytkach z agarem LB z ampicyliną; bakterie zawierające plazmid wykazują oporność na ampicylinę i tworzą kolonie.

Wyizolowane kolonie są pobierane i hodowane w kulturach miniaturowych. Następnie przeprowadza się miniprzeparowania w celu wyizolowania plazmidowego DNA. DNA jest następnie sekwencjonowane, aby zidentyfikować skutecznie przekształcone mutanty.

Bakterie E coli są hodowane w większej partii, a następnie wykonuje się maxi preps w celu przygotowania większych ilości plazmidowego DNA. Do każdego z dwóch dołków płytki 12-dołkowej wysiewa się około 1×10⁵ komórek HEK 293T: jeden dołek dla mutanta i jeden dla kontroli (kanał typu dzikiego). Inkubować w temperaturze 37 °C.

Po upływie od 8 do 24 godzin komórki przylgną do podłoża i będą gotowe do transfekcji. Przeprowadź transfekcję komórek za pomocą lipo 2000 zgodnie z instrukcjami producenta, stosując 0,2 µg cDNA kanału, 0,4 µg cDNA receptora M2R oraz 0,04 µg Y-F-P-C-D-N-A. W celu zidentyfikowania skutecznie transfektowanych komórek inkubuj je przez 24 godziny.

Po upływie wymaganego czasu inkubacji umieść komórki na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby określić wydajność transfekcji. Porównaj obrazy fluorescencyjne i DIC, aby wyznaczyć procent przetransfekowanych komórek. Przenieś naczynie hodowlane z powrotem do inkubatora.

Oczyścić szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm i przechowywać w etanolu do momentu użycia. Usunąć resztki etanolu poprzez opalenie w komorze sterylnej. Umieścić szkiełka nakrywkowe na płytce 24-dołkowej i pokryć je warstwą 0,2 mg/ml.

24 godziny po transfekcji komórki na polilizynie poddać trypsynizacji i wysiać w zagęszczeniu 4 × 10³ komórek na dołek. W czterech do ośmiu dołkach płytki 24-dołkowej zawierającej szkiełka podstawowe pokryte polilizyną inkubować przez kolejne 24 do 48 godzin przed przeprowadzeniem metody whole-cell patch clamp. Przygotować elektrody patch za pomocą dwustopniowej pionowej wyciągarki i szkła borokrzemowego do elektrod.

W idealnym przypadku gotowa elektroda będzie miała rezystancję od trzech do siedmiu megaomów i nie będzie wymagała dodatkowej obróbki, takiej jak polerowanie termiczne. Do przeprowadzenia metody patch-clamp należy umieścić szkiełko podstawowe z transfekowanymi komórkami w szalce o średnicy 35 milimetrów zawierającej zewnętrzny roztwór 20 milimolowego potasu lub 20 K. Szalkę należy umieścić na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Układ do techniki patch clamp zastosowany w tym badaniu wykorzystuje system perfuzji. System ten zawiera roztwory zewnątrzkomórkowe, które są podawane do komórek poprzez rurki podłączone do rozdzielacza, wykorzystując siłę grawitacji. Podawanie każdego roztworu jest sterowane zdalnie za pomocą elektromagnetycznego zaworu zaciskowego.

Użyj kontrastu DIC, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki. Przełącz na filtr YFP, aby odnaleźć komórki pozytywne pod kątem YFP. Po zidentyfikowaniu komórek pozytywnych pod kątem YFP, ustaw końcówkę systemu perfuzji, neuro fluorescent cell, w odległości od 20 do 30 µm lub dwóch do trzech długości komórek.

Napełnij elektrodę wewnętrznym roztworem elektrodowym. Używając strzykawki i giętkiej igły, delikatnie ostukaj napełnioną elektrodę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki. Podłącz elektrody do głowicy wzmacniacza AXO patch 200 B.

Ponownie sprawdź, czy ustawienia wzmacniacza odpowiadają jednej konfiguracji. Przełącznik whole cell ustawiony jest na beta równy 1, a filtr dolnoprzepustowy naczynia ustawiony jest na 10 kilohertz. Przy zastosowaniu strzykawki i zacisku wywieraj dodatnie ciśnienie, aby utrzymać końcówkę elektrody w czystości.

Następnie za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę elektrody w kąpieli i przesuń ją nad komórkę. Przełącz wzmacniacz w tryb V track, a pokrętło miernika na V track. Następnie użyj miernika potencjału offsetowego pipety we wzmacniaczu, aby wyzerować potencjał pipety, sprowadzając napięcie na wyświetlaczu miernika wzmacniacza do wartości 0.00.

Alternatywnie można przełączyć wzmacniacz w tryb zaciskania napięcia (V clamp) i wybrać przycisk impulsu testowego, aby podać testowy skok napięcia. Prostokątny skok napięcia pojawi się w oknie testu szczelności (seal test) programu clamp. Należy dostosować offset pipety na wzmacniaczu, aby sprowadzić prąd linii bazowej do zera nA.

Test szczelności wykaże oporność elektrody, która powinna wynosić od trzech do siedmiu megaomów. Następnie zamknij okno testu szczelności. Z menu rozwijanego wybierz opcję „acquire open protocol”.

Następnie należy wybrać zapisany protokół napięcia. W tym przypadku wybrany protokół został zaprogramowany tak, aby dostarczyć pojedynczy skok napięcia do minus 100 millivolts, a następnie zwiększać je do plus 40 millivolts co dwie sekundy. Ten protokół rampowy umożliwia obserwację potencjału odwrócenia oraz właściwości prostowania do wewnątrz kanałów GK.

W przypadku napięciowo zależnych kanałów jonowych bardziej odpowiedni może być prostokątny skok napięcia. Przy użyciu precyzyjnej regulacji mikromanipulatora należy zbliżyć się do komórki i zwolnić nadciśnienie, a po dotknięciu powierzchni komórki przyłożyć niewielkie podciśnienie. Należy monitorować wynikający z tego wzrost rezystancji w teście szczelności. Gdy rezystancja osiągnie zakres gigaomów, oznacza to, że elektroda utworzyła uszczelnienie z błoną.

Zjawisko to nazywa się giga-uszczelnieniem (giga seal). Za pomocą strzykawki należy przyłożyć impuls podciśnienia, aby przerwać membranę i uzyskać dostęp do wnętrza komórki. Po przejściu w konfigurację whole-cell, test szczelności wykaże duże prądy pojemnościowe, które są widoczne jako piki lub zjawiska przejściowe na początku i na końcu testu.

Impuls w teście szczelności. Następnie kliknij przycisk testu błony. W zacisku X zarejestruj oporność dostępową oraz oporność błony.

Pojemność błony w notatniku pozwala na wizualną weryfikację dopasowania wykładniczego. Pojemność błony jest proporcjonalna do wielkości komórki i zostanie wykorzystana do obliczenia gęstości prądu. Opór dostępu oraz opór błony są używane do oceny, czy rejestracja będzie wystarczająca do kontynuowania pomiarów.

Dobre nagranie powinno charakteryzować się niską rezystancją dostępu. Teraz zamknij okno testu membrany i ponownie kliknij przycisk testu uszczelnienia; w oknie testu uszczelnienia ustaw V out na minus 40 millivolts, aby zrekompensować pojemność membrany i rezystancję szeregową na wzmacniaczu, włącz funkcję whole cell cap, a następnie reguluj whole cell cap oraz rezystancję szeregową, aż do zminimalizowania stanu przejściowego i uzyskania płaskiej linii prądu. W razie potrzeby wyreguluj pojemność pipety za pomocą pokrętła fast cap na wzmacniaczu.

Zbyt duża lub zbyt mała kompensacja spowoduje wystąpienie przejściowego stanu pojemności resztkowej. Następnie należy obrócić pokrętło przewidywanego procentu (percentage prediction) do wartości 60–80% i w razie potrzeby ponownie dostroić pojemność całokomórkową (whole cell cap), rezystancję szeregową (series resistance) oraz szybką pojemność (fast cap), aby uzyskać linię płaską w teście szczelności (seal test). Na koniec należy ustawić kompensację procentową (percentage comp) na około 100% bez wywoływania oscylacji komórki, starając się zachować jak największą liniowość impulsu poprzez ponowną regulację potencjometrów pojemności całokomórkowej, rezystancji szeregowej oraz szybkiej pojemności.

Po przeprowadzeniu kompensacji rezystancji i pojemności, zapisz w notatniku wartości ustawione dla procentowej rezystancji szeregowej pojemności wzmacniacza, procentowej kompensacji, przewidywanego czasu opóźnienia oraz lag time, a następnie otwórz zawór zewnętrznego roztworu dla łaźni kontrolnej 20 K. Ustaw filtr dolnoprzepustowy naczynia we wzmacniaczu na 2 kHz. Następnie rozpocznij rejestrację prądów, klikając przycisk record w oprogramowaniu.

Należy sprawdzić właściwość prostowania do wewnątrz prądu GER. Przejawia się ona jako duży prąd wewnątrzkomórkowy przy wartościach ujemnych względem potencjału odwrócenia dla potasu, wyznaczonego równaniem Nernsta EK, oraz mały prąd zewnątrzkomórkowy przy wartościach dodatnich względem EK. Po zarejestrowaniu stabilnej linii bazowej należy określić aktywację prądów za pośrednictwem receptorów poprzez zastosowanie roztworu zewnątrzkomórkowego 20 K plus karbacholu.

Po zaobserwowaniu szczytowej aktywacji i osiągnięciu stanu stacjonarnego prądu, należy powrócić do roztworu kąpieli K i odczekać do momentu osiągnięcia poziomu prądu bazowego. Następnie, w celu zbadania aktywacji prądów gert przez alkohol, należy przełączyć na zewnętrzny roztwór 20 k plus 100 millimolar ethanol i odczekać na odpowiedź szczytową.

Następnie powróć do roztworu kąpieli 20 K i poczekaj, aż zostanie osiągnięty poziom prądu bazowego. Na koniec, aby wyznaczyć bazowe prądy gert, przełącz na roztwór 20 K plus 20 K baru i odczekaj na reakcję. Inhibicja prądu gerk powinna być widoczna i najbardziej wyraźna przy minus 100 millivolts w trakcie całej procedury.

Należy odnotować numer przebiegu (sweep), który odpowiada zastosowaniu różnych roztworów zewnątrzkomórkowych. Pojedynczy plik programu clamp fit będzie zawierał wszystkie przebiegi dla całych eksperymentów. Do analizy danych GK należy użyć oprogramowania clamp FIT 8.2.

Zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym, uzyskano dwa różne zapisy całokomórkowe z komórek HEC 2 9 3 T wykazujących ekspresję kanałów GK typu dzikiego lub zmutowanych, a następnie przeanalizowano je zgodnie z instrukcjami w tym filmie, jak pokazano tutaj dla GK dwa typu dzikiego. Panel po lewej stronie zawiera okno z kilkoma nałożonymi na siebie prądami, które zostały wygenerowane przez protokół rampy napięciowej w obecności różnych roztworów. Należy zwrócić uwagę na prostowanie do wewnątrz.

Jest to większy prąd wewnątrzkomórkowy przy -100 mV około 50 ms na zapisie prądu. Mały prąd zewnątrzkomórkowy między 0 a +40 mV około 200 do 260 ms na zapisie prądu pochodzi z endogennego napięciowo zależnego kanału potasowego. Nie jest to prąd Gert.

Kursor zostaje umieszczony nad maksymalnym prądem wewnątrzkomórkowym, a wartości kursora są wpisywane do arkusza kalkulacyjnego. W arkuszu widoczne są numer śladu oraz wartość prądu przy -100 mV.

Dane obejmują prąd spoczynkowy, prądy indukowane karbacholem i wywołane alkoholem, a także prąd hamowany barem. Przedstawiono również prądy w funkcji rampy napięciowej w obecności różnych roztworów. Dla zmutowanego kanału L 2 57 w pokazano wyniki dla 20 k plus 100 mM etanolu lub 20 k plus 5 mM karbacholu lub 20 k plus bar.

Zwróć uwagę na znacznie mniejsze prądy indukowane alkoholem i carboalcoholem. Wyniki te sugerują, że pozostałość ta odgrywa istotną rolę w bramkowaniu kanałów GK przez alkohol i podjednostki g beta gamma. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wprowadzić mutację w an oraz rozpocząć badanie jej wpływu na funkcję kanału przy użyciu zaawansowanych technik elektrofizjologicznych.

Po opanowaniu metody, ta technika neogenezy skierowanej na konkretne miejsce może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch do trzech dni i rozszerzona do pięciu lub więcej mutacji. Opracowanie tych technik utorowało drogę biofizykom kanałów jonowych do badania podstawowych właściwości funkcji i bramkowania kanałów jonowych. Ponadto pozwalają one badaczom na studiowanie ludzkich chorób wywołanych pojedynczą mutacją w genie kanału jonowego.