Profilowanie pre-mikro RNA i mikroRNA przy użyciu ilościowych macierzy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie szybkiej i niezawodnej automatycznej konfiguracji macierzy opartych na QPCR. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie zestawów starterów dla macierzy i ustawienie próbek głównych miksów do przesiewania. Następnie stosuje się zautomatyzowany zrobotyzowany system PCR lub matrycowy system pipet elektronicznych do dokładnego wprowadzania mieszanki wzorcowej próbki Eloqua i zestawów starterów do każdego dołka na płytce 384-dołkowej.

Po przygotowaniu, 384-dołkowe reakcje PCR są uruchamiane za pomocą programu Light Cycler four 80 cyber based PCR. Ostatnim krokiem procedury jest analiza danych QPCR i określenie względnych poziomów ekspresji dla każdej testowanej pary starterów, z których każda jest ukierunkowana na określone mRNA. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w ekspresji dużych zestawów mRNA.

Specjalnie opracowane macierze mogą zatem celować w całe profile pre mikro RNA, specyficzne szlaki lub cząsteczki kluczowe dla infekcji wirusowej poprzez profilowanie oparte na QPCR. Cześć, nazywam się Dirk DMA i pracuję na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill. Dzisiaj pokażemy Ci, jak skonfigurować QQPC rra w czasie rzeczywistym i pokażemy Ci dwie metody.

Jeden, przy użyciu nieregularnej pipety, a drugi przy użyciu robota. Używamy tej technologii do pomiaru pre mikroRNA i dojrzałych mikroRNA w ludzkich nowotworach. Dzisiejszy pokaz poprowadzą Pauline Chu i Kristen bu.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, pobierz płytki podkładowe zawierające 186 par starterów w 96. Dobrze formatować w temperaturze 0,5 picaPieprzyki przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu płytek w temperaturze pokojowej należy je krótko odwirować i odwirować. Rozmrozić również dwukrotnie mieszankę PCR w temperaturze pokojowej w celu ustawienia każdej 96-dołkowej płytki startera, potrzebne będą cztery główne probówki do mieszania. Przygotuj mieszankę główną, łącząc cztery mikrolitry mieszanki cyber green, trzy mikrolitry wody klasy PCR i od 10 do 20 nanogramów próbki DNA lub CDNA na reakcję w każdej z czterech dwumililitrowych probówek einor.

Każda probówka powinna zawierać wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej na około 100 reakcji, pozwalając na nadmiar odpadów do pipetowania. Zmieszaj rurki einor, aby wymieszać. Rozpocznij konfigurację testu prekursorowego mikro RNA przy użyciu robota Tecan EVO z inicjalizacją robota i załadowaniem programu zużycia EVO.

Następnie przepłucz robota trzykrotnie 30 mililitrami płynu systemowego, aby oczyścić system z pęcherzyków powietrza, które będą zakłócać dokładność pipetowania. Następnie skonfiguruj platformę robota tak, aby zawierała 384-dołkową płytkę i 96-dołkową płytkę starterową. Mistrz miesza koryto zawierające 2% wybielacza, napełniony system, pojemnik na płyn i pusty pojemnik na odpady.

Rozpocznij automatyczne uruchamianie robota, wybierając opcję uruchom dwukrotnie na końcu programu. Usuń płytkę 384-dołkową i uszczelnij folią sufitową Light Cycler four 80. Następnie odwirować płytkę.

Na krótko umieść zapieczętowaną płytkę 384 dołków w pierwszym miejscu hotelu. Następnie powtórz ten proces dla drugiej płytki startera z nowymi mieszankami wzorcowymi i nową płytką 384-dołkową. Umieść powstałą w ten sposób zapieczętowaną płytę świata 384 w pozycji drugiej hotelu.

Otwórz nowy program noszenia EVO, aby załadować lekki cykler z hotelu i ustaw parametry jazdy na rowerze. Następnie wybierz pozycję uruchom dwa razy. Freedom Evo automatycznie załaduje każdą płytkę do lekkiego cyklera i uruchomi program rowerowy cyber green one HRM.

Po zakończeniu. Przejrzyj i przeanalizuj wyniki zgodnie z opisem w pisemnym protokole jako alternatywę dla korzystania z robota. Elektroniczna pipeta wielokanałowa z matrycą może być użyta do rozpoczęcia umieszczania zawartości głównej probówki mieszającej w zbiorniku.

Ustaw pipetę elektroniczną tak, aby zasysała 16 mikrolitrów mieszanki wzorcowej z dwoma ośmiomikrolitrowymi etapami dozowania, po których następuje etap przedmuchiwania. Po ustawieniu pipety odessać 16 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i rozpocząć dozowanie do płytki z kołem 384. Dozuj pierwsze osiem mikrolitrów do co drugiego rzędu w kolumnie pierwszej, używając rzędów od A do O, pozostawiając następną kolumnę pustą.

Dozuj drugie osiem mikrolitrów do tych samych rzędów kolumny trzeciej. Następnie przepłucz pojemnik na odpady i wyrzuć końcówki zgodnie z tym wzorcem, pozostawiając naprzemienne rzędy i naprzemienne kolumny. Dozować na płytce przez pięć kolejnych cykli, aby odpipetować dwie mieszanki wzorcowe.

Użyj tych samych wierszy, co miks główny, ale zacznij od kolumny drugiej. Powtórz tę procedurę dla głównych mieszanek trzech i czterech, zaczynając odpowiednio od kolumny pierwszej i drugiej, ale tym razem używając róży B do P.Jej cytując płytkę startera. Ustaw pipetę elektroniczną tak, aby zassała dwa mikrolitry i dozowała dwa mikrolitry z kolejnym krokiem przedmuchiwania.

Przenieś dwa mikrolitry starterów z kolumny w pierwszym rzędzie A do H 96-dołkowej płytki starterowej do każdej innej kolumny wiosłowej, jedną z 384-dołkowych płytek, przepłucz pojemnik na odpady i wyrzuć końcówki. Powtórz ten wzór dla startera quatt dla trzech pozostałych miksów głównych kolumn pierwszej i drugiej. Następnie kontynuuj ten proces dla kolumn od dwóch do 12 96-dołkowej płytki startera, przesuwając się po każdych dwóch kolumnach w 384-dołkowej płytce dla każdej kolumny startera.

Następnie uszczelnij płytki sufitem Light Cycler, folią i wirówką. Krótko po odwirowaniu. Umieść płytki w lekkim cyklerze four 80 i przełączaj płytki za pomocą cyber green one HRM detection format

Stosując te same warunki cykliczne, co poprzednio, powtórzyć tę procedurę, używając płytki startera dwóch Eloqua na świeżą płytkę 384-dołkową, używając świeżo przygotowanych mieszanek wzorcowych. Prekursorowe sygnatury mikro RNA powstają w wyniku profilowania przy użyciu nowatorskiej macierzy opartej na QPCR. Obliczono średnią CT delta znormalizowaną do U sześć i załadowano znormalizowane wartości do tablicy.

Drobne oprogramowanie dające trzy odrębne klastry wyświetlane jako mapy cieplne. Względna ekspresja każdego prekursorowego mikro RNA jest pokazana na czerwono i niebiesko, reprezentując odpowiednio wzrost i spadek względnej ekspresji. Intensywność koloru wskazuje stopień zmiany wyrazu.

Większość prekursorowych mikroRNA uległa niewielkim, nieistotnym zmianom zgodnie z oczekiwaniami. Jednak niewielka część mikroRNA prekursorów znacznie wzrosła w trakcie eksperymentu w czasie. Dodatkowo względny poziom niektórych mikroRNA prekursorowych drastycznie spadł.

W niektórych przypadkach. Grupują się one również w analizie mapy cieplnej. W zależności od eksperymentu mogą pojawić się klastry, które są zależne od infekcji wirusowej, specyficznej dla typu komórki ekspresji prekursorowych mikroRNA lub prekursorowych mikroRNA, które są regulowane przez wspólną cząsteczkę lub szlak sygnałowy.

Pokazano średnie progi cyklu lub cts z ujemnej próbki próbki poczwórnej związanej z wirusem opryszczki związanej z mięsakiem Poseya. Co ważne, antygen jądrowy związany z opóźnieniem wirusa opryszczki Kaposiego lub KSHV Lana nie został wykryty w tej próbce przez wysoce czułą matrycę QPCR. Jednak zarówno kontrola wewnętrzna U 6, jak i let 7 a wysoce eksprymowany ludzki prekursor mikro RNA, ulegały ekspresji na wykrywalnych poziomach.

Wreszcie, zgodnie z oczekiwaniami, negatywna kontrola wody klasy PCR nie dała produktu A-Q-P-C-R. Analiza krzywej topnienia dla dwóch różnych starterów. Pokazano użycie tego samego duplikatu próbkowania.

Oczywiste jest, że temperatura topnienia jest różna dla dwóch par starterów, ale próbka topi się w dokładnie tej samej temperaturze dla każdej kontrpróby. Oznaki złej lub potencjalnie zanieczyszczonej próbki mogą obejmować kilka szczytów topnienia sugerujących obecność dwóch różnych źródeł materiału wsadowego. Właśnie pokazaliśmy, jak skonfigurować eksperymenty QPCR w czasie rzeczywistym za pomocą robota.

Ważne jest, aby uwzględnić wszystkie kontrole i jak najwięcej genów związanych z porządkowaniem. Dziękuję więc za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.