Name: Pierwotne hodowle komórkowe z zarodków Drosophila Gastrula (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-28T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę przygotowania pierwotnych komórek z zarodków Drosophila do analizy RNAi i obrazowania komórkowego. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów w komórkach mięśniowych i neuronowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.B. otrzymał wsparcie w ramach stypendium DRG-1716-02 fundacji Damon Runyon Cancer Research Foundation. J.Z. otrzymał wsparcie w ramach stypendium NIH/NIGMS F32 GM082174-02. N.P. jest badaczem w Howard Hughes Medical Institute.

1. Przygotowanie klatek dla much
<ol>
<li>Hodować Drosophila (szczepy typu dzikiego, takie jak Oregon-R lub dowolny genotyp) w odpowiednich pojemnikach, na przykład w kubkach dla owadów o pojemności 32 oz.</li>
<li>Przenieść nowo wyklute muchy do dużych klatek do zbierania embrionów lub klatek dla populacji much.</li>
<li>Przenieść klatki do pomieszczenia o temperaturze ~25 °C i wilgotności ~65% w cyklu 12 h światła i 12 h ciemności, aby ułatwić zbieranie synchronicznych embrionów.</li>
<li>Utrzymywać muchy w klatkach, podając im pastę z zabitych drożdży naniesioną na płytki z melasą. Wymieniać płytki z melasą (z pastą z zabitych drożdży) raz dziennie przez 2-3 d.</li>
</ol>
2. Pobieranie synchronicznych zarodków
<ol>
<li>W dniu przygotowania komórek pierwotnych, podać muchom świeże płytki pokryte pastą z zabitych drożdży w okresie przedskładania jaj trwającym 1-2 h.</li>
<li>Tuż przed 12-godzinnym cyklem ciemności, zastąpić płytki do przedskładania świeżymi płytkami z melasą, posianymi minimalną ilością pasty drożdżowej. Usunąć zebrane wcześniej jaja, które zawierają asynchroniczne, starsze embriony.</li>
<li>Zbierać embriony przez okres 1-2 h.</li>
<li>Zdjąć płytki zawierające względnie synchronizowaną populację embrionów i przechowywać je w temperaturze 25°C przez 5-6 h. W tym czasie embriony będą znajdować się w zaawansowanym stadium gastrulacji.</li>
</ol>
3. Zbieranie i przemywanie zarodków
<ol>
<li>Poluźnić zarodki z płytek za pomocą mokrego pędzla, a następnie dokładnie opłukać je letnią wodą z kranu przez zestaw sit ułożonych jedno na drugim, tak aby zarodki zebrały się w sicie o najgęstszym oczku na dole. Płukać przez kilka minut, aby usunąć jak najwięcej drożdży i resztek muchy.</li>
<li>Przechylić sita tak, aby zarodki zgromadziły się z jednej strony, a następnie delikatnie spłukać je z sita do koszyka do dechorionacji.</li>
<li>Przenieść próbki do strefy z dygestorium do hodowli tkankowych, nie dopuszczając do wyschnięcia zarodków.</li>
</ol>
4. Homogenizacja zarodków i wysiew komórek
<ol>
<li>Zsterylizuj i usuń chorion z embrionów, zanurzając je w 50% (vol/vol) roztworze wybielacza na 5-10 min. Spłucz embriony ze ścianek koszyka 70% (vol/vol) etanolem. Alternatywnie, przed obróbką etanolem wypłucz wybielacz z embrionów wodą destylowaną. Od tego momentu embriony należy manipulować w warunkach sterylnych, w komorze do hodowli tkankowej.</li>
<li>Dokładnie wypłucz embriony autoklawowaną wodą destylowaną, aby usunąć wybielacz i/lub etanol.</li>
<li>Podczas etapu usuwania chorionu napełnij homogenizator Dounce odpowiednią objętością pożywki M3 w temperaturze pokojowej, w zależności od liczby embrionów. Stosunek objętości embrionów do objętości pożywki nie powinien przekraczać 0,5 ml embrionów na 40 ml pożywki (lub ~100-200 embrionów/ml).</li>
<li>Umieść wypłukane embriony w wysterylizowanym zlewce z ilością pożywki M3 wystarczającą do ich całkowitego zanurzenia. Pozostaw embriony do namoczenia na 2-5 min.</li>
<li>Zdemontuj koszyki do usuwania chorionu i osusz siatkę Nitex sterylnymi ręcznikami papierowymi.</li>
<li>Przenieś embriony do homogenizatora za pomocą wysterylizowanego pędzla.</li>
<li>Homogenizuj delikatnie, wykonując krótkie ruchy luźnym tłokiem, nie docierając do dna probówki, aż wszystkie embriony zostaną zawieszone. Następnie delikatnie, ale zdecydowanie, homogenizuj, wykonując osiem pełnych ruchów. Nie obracaj tłoka podczas ruchu w górę i w dół.</li>
<li>Przenieś homogenizat do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, przelewając go lub pipetując, a następnie zakręć probówkę.</li>
<li>Wiruj przez 10 min przy 40g w temperaturze pokojowej, aby osadzić resztki tkanek, duże skupiska komórek i błony żółtkowe. Przenieś nadosad zawierający komórki i żółtko do czystej probówki i powtórz etap wirowania przez 5 min.</li>
<li>Ostrożnie przenieś nadosad, przelewając go lub pipetując do czystej probówki, i wiruj przez 10 min przy 360g w temperaturze pokojowej, aby osadzić komórki. Odlej nadosad. Resuspenduj osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej (pożywka bezsurowicza w przypadku eksperymentów RNAi).</li>
<li>Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru, aby oszacować gęstość komórek. W międzyczasie powtórz krok 4.10, aby ponownie osadzić komórki.</li>
<li>Resuspenduj komórki do pożądanej koncentracji. Na początek wypróbuj zakres 1~5 x106 komórek /ml i wysiej w gęstości od 1,7 do 2,5 x105 komórek /cm2.</li>
</ol>
5. RNAi w komórkach pierwotnych hodowanych na płytce 384-dołkowej
<ol>
<li>Do każdej studzienki płytki 384-dołkowej nanieś 5 μl dsRNA, tak aby końcowe stężenie wynosiło ~250 ng na studzienkę.</li>
<li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 10 ml (1~4x106 komórek/ml) komórek pierwotnych na studzienkę w bezserwatkowym medium M3 do płytki 384-dołkowej, w której każda studzienka zawiera inny dsRNA. Alternatywnie komórki można hodować na szklanych szkiełkach do komór 8-dołkowych w celu obrazowania konfokalnego.</li>
<li>Wiruj płytki przez 1 min przy 300g w temperaturze pokojowej. Hoduj komórki w bezserwatkowym medium w temperaturze 25°C przez 22 h lub w temperaturze 18°C przez 1-2 d.</li>
<li>Do każdej studzienki dodaj 30 ml medium hodowlanego z dodatkiem surowicy.</li>
<li>Wiruj płytki przez 1 min przy 300g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Umieść płytki w wilgotnej komorze i hoduj komórki pierwotne przez kolejne 5~7 d w temperaturze 25°C.</li>
<li>Wykonaj obrazowanie komórek na żywo lub po barwieniu immunofluorescencyjnym.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
W optymalnych warunkach komórki w hodowli będą wyglądać zdrowo i posiadać okrągłą morfologię. Hodowla będzie zawierać niewielką ilość szczątków komórkowych i osiągnie 50~80% konfluencji po początkowym wysiewie. Komórki te ulegną zmianom morfologicznym po dłuższym okresie hodowli. Zazwyczaj pełne zróżnicowanie komórek w hodowli w temperaturze 25°C zajmuje około 5-8 dni. O dobrej jakości hodowli pierwotnych zazwyczaj sądzi się po stopniu zróżnicowania interesujących nas komórek w kulturze. Na przykład pierwotne komórki mięśniowe często mają morfologię rozgałęzioną i przekształcają się w wielojądrowe miotuby z prążkowanymi miofibrylami składającymi się z serii sarkomerów. W pełni zróżnicowane miotuby zazwyczaj poruszają się w hodowli spontanicznie. Z kolei zróżnicowane pierwotne neurony tworzą skupiska swoimi ciałami komórkowymi i łączą się z innymi skupiskami za pomocą aksonów.
 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig1.jpg" alt="Proces wysiewania komórek: obrazy mikroskopowe pokazujące postęp wzrostu komórek w 0 h, 20 h i po 3 dniach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Komórki pierwotne przechodzą zmiany morfologiczne po wysianiu w hodowli 
 (A) Obraz w jasnym polu komórek pierwotnych bezpośrednio po wysianiu w studzience płytki 384-dołkowej. Większość komórek jest okrągła, nienaruszona i dobrze oddzielona od siebie. (B) Obraz w jasnym polu hodowli komórek pierwotnych 20 godzin po wysianiu. Komórki pierwotne tworzą już skupiska (duża strzałka z grotem), a na tym etapie można rozpoznać mięśnie o morfologii rozgałęzionej (długa strzałka). (C) Obraz w kontraście fazowym hodowli pierwotnej 5 dni po wysianiu. Hodowla wygląda na znacznie bardziej rozwiniętą, z widocznymi wypustkami neuronalnymi (małe strzałki), skupiskami neuronalnymi (duże strzałki z grotem) oraz mięśniami (strzałka średniej wielkości).
 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej z barwieniem GFP i faloidyną w analizie struktury komórkowej, przedstawiające nałożenie obrazów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przykłady komórek pierwotnych traktowanych dsRNA hodowanych na płytce 384-dołkowej 
 Komórki pierwotne wyizolowano z embrionów niosących transgeny Dmef2-Gal4, D42-Gal4 oraz UAS-mito-GFP, w których Dmef2-Gal4 i D42-Gal4 sterują ekspresją mito-GFP odpowiednio w mięśniach i neuronach ruchowych. Komórki traktowano dsRNA celującymi w lacZ (A-C) lub inflated(if) (D-F). Zarówno pierwotne komórki mięśniowe, jak i neurony są widoczne dzięki GFP (A, C, D, F). Białe strzałki wskazują wypustki neuronalne. Barwienie aktyny faloidyną (groty strzałek) ujawnia rozgałęzioną strukturę mięśni w hodowli traktowanej dsRNA lacZ (B i C), natomiast zaokrągloną morfologię mięśni w hodowli traktowanej dsRNA if (E i F). Na obrazach z nałożeniem (C, F) mięśnie są zabarwione na żółto, natomiast kolor czerwony wskazuje neurony i ich wypustki (białe strzałki).
 <img src="/files/ftp_upload/2215/2215fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, ekspresja białek; schemat; barwienie aktyny, porównanie w modelach wt i sals." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikrografie konfokalne pierwotnych mięśni hodowanych na szkiełkach podstawowych pokrytych ludzką witronektyną 
Pierwotne mięśnie poddano barwieniu immunofluorescencyjnemu przeciwko titynie Drosophila (KZ) (kolor czerwony na obrazie złożonym) oraz faloidyną na aktynę (kolor zielony na obrazie złożonym). Górne panele przedstawiają kontrolny mięsień typu dzikiego, a dolne mięsień sals(CG31374) RNAi z upośledzonymi, skróconymi sarkomerami.

<ol><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Laboratory+culture+of+Drosophila%22">Laboratory culture of Drosophila</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).</li>
<li>Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+WH2-domain-containing+protein%2C+promotes+sarcomeric+actin+filament+elongation+from+pointed+ends+during+Drosophila+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth.</a> Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).</li>
<li>Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screening+in+Drosophila+primary+cells+for+genes+involved+in+muscle+assembly+and+maintenance+%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance .</a> Development. 135, 1439-1449 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
<li>Donady, J. J., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+culturing+of+Drosophila+embryonic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TCA+Manual%22%5BJournal%5D)">Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro.</a> TCA Manual. 3, 685-687 (1977).</li>
<li>Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neurons+and+myocytes+in+cell+cultures+made+from+Drosophila+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae.</a> Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).</li>
<li>Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+primary+cells+dissociated+from+gastrula+embryos+and+their+use+in+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening.</a> Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wzorzec rozwojowy kultur pierwotnych komórek Drosophila może znacznie się różnić, co prawdopodobnie wynika z wielu zmiennych występujących podczas procesu przygotowania komórek pierwotnych. Po pierwsze, muchy wykorzystywane do składania jaj powinny być młode (do tygodnia życia) i zdrowe (wolne od infekcji wirusowych lub bakteryjnych). Należy unikać zarodków niezapłodnionych lub zainfekowanych, ponieważ są one bezużyteczne, a komórki z nich pochodzące nie mogą ulegać różnicowaniu i przeżywają jedynie 1-2 dni. Po ...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Shields and Sang M3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>JRH Biosciences</td><td>12103-500M</td><td></td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>Duże klatki do zbierania embrionów</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-101</td><td></td></tr><tr><td>Sito testowe standardu US #25</td><td>VWR international</td><td>57334-454</td><td></td></tr><tr><td>Sito testowe standardu US #45</td><td>VWR international</td><td>57334-462</td><td></td></tr><tr><td>Sito testowe standardu US #120</td><td>VWR international</td><td>57334-474</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy Dounce, Wheaton 7 mL</td><td>VWR international</td><td>62400-620</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0040</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy Dounce, Kontes 40 mL</td><td>VWR international</td><td>KT885300-0100</td><td></td></tr><tr><td>Costar, płytka 384-dołkowa</td><td>VWR international</td><td>29444-078</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywek szkiełkowy z komorami Lab-Tek II</td><td>Fisher Scientific</td><td>171080</td><td></td></tr></tbody></table>

podstawowe hodowle komórkowe z embrionów drosophila w stadium gastruli

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Opisujemy tutaj metodę przygotowania i hodowli pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila w stadium gastruli. W skrócie, dużą ilość embrionów o określonym stadium rozwoju, pochodzących od młodych i zdrowych muszek, poddaje się sterylizacji, a następnie dysocjacji fizycznej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu homogenizatora szklanego. Po wysianiu na płytki hodowlane lub szkiełka z komorą przy odpowiedniej gęstości w medium hodowlanym, komórki te mogą ulegać dalszej różnicowaniu w kilka morfologicznie odrębnych typów komórek, które można zidentyfikować za pomocą specyficznych markerów komórkowych. Ponadto przedstawiamy warunki traktowania tych komórek dwuniciowym (ds) RNA w celu wywołania wyciszenia genów. Efektywny RNAi w pierwotnych komórkach Drosophila osiąga się poprzez proste inkubowanie komórek w medium hodowlanym zawierającym dsRNA. Możliwość przeprowadzania skutecznych perturbacji za pomocą RNAi, wraz z innymi analizami molekularnymi, biochemicznymi oraz obrazowaniem komórkowym, pozwoli na udzielenie odpowiedzi na szereg pytań badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila, szczególnie tych związanych z zróżnicowanymi komórkami mięśniowymi i neuronalnymi.

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania i hodowli pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila w stadium gastrulacji. W skrócie, duża ilość odpowiednio stadiowanych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu przygotowania pierwotnych komórek wyizolowanych z embrionów drosofil do analizy RNAi oraz obrazowania komórkowego. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się klatki dla much. Następnie pobiera się synchroniczne embriony, które są płukane i homogenizowane w celu dysocjacji komórek.Następnie komórki pierwotne są wysiewane i transfekowane konstruktami RNAi. Ostatecznie wyniki można uzyskać za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, która wykazuje wpływ RNAi na zróżnicowane komórki pierwotne. Nazywam się Namo.Jestem profesorem w Katedrze Genetyki na Harvard Medical School oraz badaczem w Overuse Medical Institute. Dzisiaj ja oraz Jonathan, pracownik laboratorium, a także były stażysta w naszym zespole, przedstawimy Państwu technikę generowania pierwotnych komórek z embrionów myszy. Technika ta jest istotna dla wielu zastosowań w biologii komórki i biologii rozwoju a w szczególności, jak wykazał Janu kilka lat temu, metodologia ta może być wykorzystana do genomowych przesiewów CRISPR w pierwotnych komórkach mięśniowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza uznanych unieśmiertelnionych linii komórkowych, jest fakt, że pierwotna hodowla komórek dokładniej odzwierciedla biologię organizmu. Zazwyczaj osoby stosujące tę metodę mogą napotkać trudności, ponieważ kilku etapów nie da się po prostu opanować poprzez czytanie procedury. Aby przygotować pastę z zabitych drożdży, należy najpierw zmielić granulowany, żywy drożdże na drobny proszek w młynku do kawy, a następnie umieścić go w zlewce i autoklawować, stosując 20-minutowy cykl suchy. Bezpośrednio po autoklawowaniu.Dodaj do drożdży odpowiednią ilość sterylnej gorącej wody, aby uzyskać pastę o konsystencji pasty do zębów. Aby przygotować pierwotne komórki wyizolowane z embrionów muchy, wyhoduj szczep typu dzikiego Drosophila, taki jak orgon R, w świeżych butelkach do much, a następnie przenieś nowo wylęgłe muchy do dużych klatek do zbierania embrionów lub klatek dla populacji much. Następnie, aby ułatwić zbieranie embrionów synchronicznych, przenieś klatki do pomieszczenia o temperaturze około 25°C i wilgotności 65% z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności, karmiąc muchy po uśmierceniu.Pasta drożdżowa naniesiona kreskowaniem na pożywki z melasą. Wymieniaj pożywki raz dziennie przez dwa do trzech dni. W dniu pierwszego przygotowania komórek podaj muszkom świeże pożywki na jeden do dwóch godzinny okres przed składaniem jaj.Tuż przed rozpoczęciem 12-godzinnego cyklu ciemności, zastąp płytki do wstępnego wysiewania świeżymi płytkami z melasą, szczepionymi minimalną ilością pasty drożdżowej. Wyrzuć pobrane wcześniej embriony, ponieważ zawierają one starsze zarodki w różnych stadiach rozwoju.Zbierać zarodki przez okres od jednej do dwóch godzin. Wyjąć płytki zawierające względnie synchroniczną populację zarodków i przechowywać w temperaturze 25 °C przez pięć do sześciu godzin. W tym czasie zarodki osiągną zaawansowane stadium gastrulacji, co pozwoli na ich pobranie.Po inkubacji trwającej od pięciu do sześciu godzin, użyj mokrego pędzla, aby oddzielić je od płytek. Następnie umieść je w zestawie ułożonych jeden na drugim sit i dokładnie wypłucz, aby usunąć jak najwięcej drożdży oraz resztek much, pozwalając zarodkom zgromadzić się w dolnym sicie.Przechyl sito tak, aby zarodki zgromadziły się po jednej stronie, a następnie delikatnie zmyj je z sita do koszyka dekoracyjnego. Następnie wysterylizuj i pokryj zarodki, zanurzając je w 50% roztworze objętościowym (v/v). Wybielaj przez 5 do 10 minut podczas inkubacji zarodków.Dopełnić pożywkę do poziomu homogenizatora w temperaturze pokojowej. Dodać pożywkę w ilości takiej, aby uzyskać objętość nieprzekraczającą 0,5 ml embrionów na 40 ml pożywki. Następnie wypłukać embriony ze ścianek koszyka, stosując 70% (obj./obj.) etanol.Używając wody destylowanej z autoklawu, dokładnie wypłucz embriony, aby usunąć wybielacz i/lub etanol. Następnie zanurz wypłukane embriony w medium M3. W sterylnym zlewce pozostaw embriony do namoczenia na od dwie do pięciu minut; w czasie inkubacji embrionów rozmontuj koszyk do dekoracji i osusz siatkę NYX sterylnymi ręcznikami papierowymi.Po namoczeniu embrionów w medium M three, przenieść je do homogenizatora za pomocą wysterylizowanego pędzla. Homogenizować delikatnie, wykonując krótkie ruchy luźnym tłuczkiem, unikając dociskania go do dna probówki; gdy wszystkie embriony zostaną zawieszone, przeprowadzić dokładniejszą homogenizację, wykonując osiem pełnych pociągnięć. Nie obracać tłuczkiem podczas ruchów w górę i w dół. Przenieść homogenat do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, wlewając go lub pipetując, a następnie zamknąć probówkę i wirować przez 10 minut przy 40 g w temperaturze pokojowej, aby sfaulować resztki tkankowe, duże skupiska komórek i błony pęcherzykowe.Przenieść zawiesinę zawierającą komórki i żółtko do czystej probówki i powtórzyć etap centryfugacji przez pięć minut. Następnie ostrożnie przenieść supernatant, przelewając go lub pipetując do czystej probówki, a następnie wirować przez 10 minut przy 360 Gs w temperaturze pokojowej w celut opadnięcia komórek na dno; supernatant należy usunąć. Osad komórkowy resuspender w 10 mililitrach bezsurowiczej pożywki hodowlanej do eksperymentów RNAi.Aby oszacować gęstość komórek, należy policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru. Następnie ponownie odwirować komórki przy 360 ×g. Resuspendować komórki w medium M3 bez surowicy do stężenia od 1 do 5 × 10⁶ komórek/ml i wysiać je w gęstości od 1,7 do 2,5 × 10⁵ komórek/cm² do każdej studni płytki 384-dołkowej.Do płytek wielodołkowych nanieś 5 µL dwuniciowego RNA w końcowym stężeniu około 250 ng na dołek. Używając pipety wielokanałowej, nanieś 10 µL zawiesiny komórek pierwotnych w bezserwatkowym medium M3 w stężeniu od 1 do 4 × 10⁶ komórek/ml do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Alternatywnie komórki można hodować na szkiełkach przedmiotowych z ośmioma komorami do obrazowania konfokalnego.Wiruj płytki przez jedną minutę przy 300 Gs w temperaturze pokojowej. Inkubuj płytki w temperaturze 25°C przez 22 godziny lub w temperaturze 18°C przez jeden do dwóch dni. Do każdej z nich dodaj dodatkowe 30 µL serum zawierającego pożywkę kultur M3.Następnie wiruj płytki przez jedną minutę przy 300 Gs w temperaturze pokojowej. Inkubuj pierwotne komórki przez kolejne pięć do siedmiu dni w temperaturze 25 °C w komorze wilgotnej. Na koniec wykonaj obrazowanie komórek, albo na żywo, albo po barwieniu immunofluorescencyjnym.W optymalnych warunkach komórki i kultura będą wyglądać na zdrowe. Dzięki okrągłej morfologii w kulturze znajdzie się niewielka ilość szczątków komórkowych, a stopień konfluencji wyniesie od 50 do 80%. Po początkowym wysiewie komórki przejdą zmiany morfologiczne i będą w pełni zróżnicowane po około pięciu do ośmiu dniach hodowli w temperaturze 25 °C; ten obraz w jasnym polu przedstawia przykład komórek pierwotnych bezpośrednio po wysiewie.Większość komórek jest okrągła, nienaruszona i dobrze odseparowana 20 godzin po wysianiu. Komórki pierwotne tworzą już skupiska, a na tym etapie można rozpoznać mięśnie o morfologii rozgałęzionej. W tej fazie obraz kontrastowy komórek pierwotnych hodowanych przez pięć dni wykazuje znacznie bardziej zaawansowany stopień rozwoju z widocznymi wypustkami neuronalnymi, skupiskami neuronalnymi oraz mięśniami.W tych przykładach wyizolowano pierwotne komórki z embrionów niosących transgeny DMF two GAL four D 42 G four oraz UAS mito GFP, w których DMF two G four i D 42 G four sterują ekspresją MIT GFP odpowiednio w mięśniach i neuronach ruchowych; komórki poddano działaniu dwuniciowych RNA celujących w LA C lub inflated. Ten obraz fluorescencyjny przedstawia zarówno zróżnicowane pierwotne mięśnie, jak i neurony wykazujące ekspresję GFP w hodowli transfekowanej kontrolnymi dwuniciowymi RNA celującymi w LA C; biała strzałka wskazuje wypustki neuronalne, natomiast grot strzałki wskazuje rozgałęzioną strukturę mięśniową. Po zabarwieniu zróżnicowanego mięśnia Phin, ponad połowa mięśni wykazuje strukturę rozgałęzioną, podczas gdy pozostałe prezentują morfologię zaokrągloną.Na nałożonym obrazie mięśnie są zabarwione na żółto, a struktury neuronalne na zielono. Ten obraz fluorescencyjny przedstawia zarówno zróżnicowane pierwotne mięśnie, jak i neurony wykazujące ekspresję GFP w hodowli zawierającej dwuniciowe RNA celujące w gen inflated; biała strzałka wskazuje rozgałęzienia neuronalne, natomiast grot strzałki wskazuje mięsień uwidoczniony przy użyciu barwienia phin. W przeciwieństwie do kontroli typu dzikiego, które posiadają niektóre mięśnie o strukturze rozgałęzionej, wszystkie mięśnie na tym nałożonym obrazie są zaokrąglone; mięśnie są zabarwione na żółto, natomiast struktury neuronalne na zielono.Należy zauważyć, że w tej kulturze traktowanej dwuniciowym RNA widoczna jest jedynie zaokrąglona morfologia mięśni. Chociaż wypustki neuronalne wyglądają podobnie jak w kontrolach typu dzikiego, obrazy te przedstawiają pierwotne komórki mięśniowe, które zostały zabarwione fluorescencyjnie przeciwciałem anty-drosophila titan na czerwono oraz Phin, który znakuje aktynę na zielono. Te panele przedstawiają mięśnie kontrolne typu dzikiego, a te reprezentują mięśnie traktowane RNAi, które rozwinęły się w mięśnie z krótszymi sarkomerami.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby konsekwentnie przestrzegać protokołu w celu uzyskania porównywalnych wyników w poszczególnych eksperymentach. Po opanowaniu tej techniki, jej prawidłowe przeprowadzenie zajmuje od dwóch do czterech godzin.

primary-cell-cultures-from-drosophila-gastrula-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kultury komórek pierwotnych z zarodków gastruli Drosophila

Niniejszy film prezentuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Obrazy żywych kultur pokazują wypustki neurytów oraz obrazowanie poziomu wapnia z wykorzystaniem Fura-2.

Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę nienaruszonych jąder i torbieli linii zarodkowej poczwarek Drosophila melanogaster. Metoda ta pozwala na mikroskopową obserwację spermatogenezy ex vivo. Ponadto opisano test farmakologiczny wpływu inhibitorów na określone etapy rozwoju komórek rozrodczych w jądrach poczwarki.

Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Tutaj opisujemy procedurę przechwytywania na żywo obrazów gastrulacji Drosophila. Umożliwiło nam to lepsze zrozumienie zwężenia wierzchołkowego związanego z wczesnym rozwojem i dalszą analizę mechanizmów rządzących ruchami komórek podczas modyfikacji struktury tkanki.

Obrazowanie zmiany kształtu komórki i ruchu komórek w gastrulacji Drosophila przy użyciu transgenicznych much reporterowych DE-kadheryny

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Linie komórkowe Drosophila są ważnymi odczynnikami zarówno dla badań podstawowych, jak i biomedycznych. Ten artykuł zawiera protokoły rozmrażania, subhodowli i kriokonserwacji powszechnie stosowanych linii komórkowych Drosophila, aby pomóc naukowcom w włączeniu tych odczynników do ich badań.

Rozmrażanie, hodowla i kriokonserwacja linii komórkowych Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Wysoce pożądana jest długoterminowa metoda konserwacji szczepów Drosophila jako alternatywa dla częstego przenoszenia dorosłych much do fiolek ze świeżą żywnością. Protokół ten opisuje kriokonserwację pierwotnych komórek rozrodczych Drosophila i odrodzenie szczepu poprzez ich przeszczepienie do agametycznych zarodków gospodarza.

Kriokonserwacja pierwotnych komórek rozrodczych i ożywienie szczepów Drosophila

Poznaj metodę przygotowania pierwotnych komórek z zarodków Drosophila do analizy RNAi i obrazowania komórkowego. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów w komórkach mięśniowych i neuronowych.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

Przeglądaj więcej filmów