Name: Protokół zakażeń Plasmodium falciparum u komarów i oznaczania fenotypu infekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Poznaj metodę zakażeń Plasmodium falciparum u komarów Anopheles gambiae i oznaczania fenotypu infekcji w przewodzie pokarmowym. Protokół obejmuje hodowlę gametocytów, karmienie membranowe i analizę mikroskopową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A. Przygotowanie hodowli gametocytów>:
<ol>
<li>Doprowadzić świeżą ludzką krew i surowicę do temperatury 37oC w łaźni wodnej.</li>
<li>W dygestorium, w warunkach sterylnych, pipetować 1 mL ocieplonej krwi do probówki typu Eppendorf. Wirować krew w wirówce przez 5 minut przy 2200 rpm. Erytrocyty powinny utworzyć osad; usunąć i wylać klarowną surowicę. Przemyć erytrocyty równą objętością nowej surowicy 3 razy, aby uzyskać krew pełną dla gametocytów.</li>
<li>Wyjąć hodowlę gametocytów z inkubatora CO2 lub słoika z utleniaczem (candle jar). Hodowlę tę należy prowadzić na podłożu RPMI i podawać komarom w 16. dniu hodowli. Aby określić % gametocytemii (w 16. dniu hodowli), przygotować cienki rozmaz z jednej kropli krwi na szkiełku przedmiotowym i wykonać barwienie Giemsą. Określić liczbę gametocytów w polu widzenia hodowli pasożytów. Zazwyczaj mieści się ona w zakresie 2 - 4%. Obliczyć objętość krwi pełnej potrzebną do uzyskania pożądanego końcowego % gametocytemii (0,3 - 1%).</li>
<li>Usunąć większość podłoża z hodowli gametocytów za pomocą pipety, uważając, aby nie zakłócić i nie wessać pasożytów (pasożyty będą widoczne jako czarne, podczas gdy podłoże będzie jasnoróżowe/czerwone). Pipetować pozostałe podłoże i pasożyty do probówki Falcon 15 ml. Wirować w wirówce przez 5 minut przy 2200 rpm. Pasożyty i erytrocyty utworzą osad; usunąć i wylać nadsącz z podłoża, nie zakłócając osadu pasożytów.</li>
<li>Połączyć pasożyty z objętością przygotowanej krwi pełnej (z kroku A2), aby uzyskać pożądaną końcową gametocytemię zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami. Mieszać dokładnie za pomocą pipety (~1 minuta).</li>
</ol>
Jest to próbka, którą podadzą Państwo komarom. Przechowywać w 37oC w łaźni wodnej.
B. Karmienie komarów>:
<ol>
<li>Umieść komary Anopheles (~30-50 osobników) w wyłożonych woskiem kubkach tekturowych przykrytych siatką zabezpieczoną gumką recepturką lub tekturową pokrywką dołączoną do kubka. Na tym etapie używamy aspiratora zasilanego bateryjnie.</li>
<li>Przygotuj cyrkulacyjną łaźnię wodną, mocując dysze po obu stronach szklanych karmników do gumowych rurek. Połącz szeregowo tyle karmników, ile jest potrzebnych; jeden koniec szeregu powinien być połączony rurką z cyrkulatorem łaźni wodnej (częścią, która tłoczy wodę przez karmniki), a drugi koniec szeregu powinien składać się z gumowej rurki zanurzonej w łaźni, aby umożliwić odpływ cyrkulującej wody z powrotem do łaźni. Włącz łaźnię, aż woda osiągnie temperaturę około 37oC i zacznie cyrkulować przez karmniki z powrotem do łaźni. Jest to niezbędne, aby krew pozostała ciepła i aby pasożyty przeżyły.</li>
<li>Przygotuj membranę (używamy małych kwadratów rozciągniętej parafimy), naciągając ją wokół szklanego karmnika membranowego i dociskając w celu szczelnego zamknięcia otworu karmnika. Membrana ta będzie imitować skórę.</li>
<li>Umieść jeden karmnik stroną z membraną do dołu na każdym kubku z komarami i zabezpiecz karmniki za pomocą zacisków lub taśmy. Membrana powinna przylegać do siatki, aby komary miały do niej dostęp z wnętrza kubka.</li>
<li>Ostrożnie pipetuj posiłek z krwi z pasożytami (z kroku A5) do szyjki karmnika, upewniając się, że krew przedostanie się przez całą szyjkę do zbiornika i zetknie się z membraną, tak aby komary miały dostęp do krwi. Używamy około 200 μl krwi na karmnik, ale ilość ta może się różnić.</li>
<li>Pozostaw komary do żerowania. Pozwalamy im żerować przez ≈30 minut (czas zmienny w zależności od eksperymentu; w większości eksperymentów okresowo monitorujemy, ile osobników już pobrało posiłek, obserwując zawartość krwi w odwłoku).</li>
<li>Po żerowaniu usuń karmniki z kubków z komarami. Wyłącz łaźnię wodną i odłącz karmniki od rurek.</li>
<li>Usuń membranę i namocz karmniki w 10% wybielaczu w celu dekontaminacji, a następnie wypłucz wodą. Umieść zanieczyszczone materiały (membrany, ręczniki papierowe, rękawiczki itp.) w małym worku na odpady biologiczne i wyrzuć do dużego pojemnika na odpady biologiczne.</li>
<li>Uśpij komary, umieszczając kubki w lodówce lub pomieszczeniu chłodniczym. Gdy komary zostaną całkowicie uśpione, przenieś je na szalkę Petriego umieszczoną w wiadrze z lodem. Posortuj komary, uważnie obserwując odwłoki pod kątem jakichkolwiek oznak pobrania posiłku z krwi, i odrzuć te, które nie żerowały. Niektóre komary będą całkowicie przepełnione krwią, podczas gdy inne będą wykazywać wąski pas spożytej krwi; wszystkie są akceptowalne jako „nakarmione”. Włóż nakarmione komary z powrotem do kubków tekturowych.</li>
<li>Zapewnij komarom posiłek cukrowy (kawałek waty nasączony 10% sacharozą) i inkubuj w normalnych warunkach insektarium przez 7 dni. Codziennie należy monitorować wskaźnik śmiertelności komarów. Ponadto wata powinna być stale wilgotna od sacharozy, aby owady nie były pozbawione pożywienia. Wskazane jest również dodanie ręcznika papierowego nasączonego wodą destylowaną, aby utrzymać odpowiednią wilgotność dla komarów. Komary te są zainfekowane P. falcipraum, dlatego należy zachować wszelkie środki ostrożności, aby żadne z nich nie uciekło z kubka. Najlepiej umieścić kubki w małej klatce dla podwójnej ochrony.</li>
</ol>
C. Disekcja jelit środkowych komarów i szacowanie liczby oocyst:
<ol style="margin-top: 0in">
<li style="tab-stops: list .5in">Odessać komary (z kroku B) z tekturowych kubków za pomocą aspiratora zasilanego bateryjnie. Znieczulić komary znajdujące się w wyjmowanym zbiorniku aspiratora, przenosząc go do chłodni lub zakopując zbiornik w lodzie na co najmniej 5 minut lub do momentu, aż komary przestaną się poruszać.</li>
<li style="tab-stops: list .5in">Przenieść znieczulone komary ze zbiornika do szklanej szalki Petri umieszczonej w lodzie. Rozłożyć komary w jednej warstwie i przykryć plastikową pokrywą szalki. Komary, które nie zmieściły się na szalce, pozostawić w zbiorniku i zwrócić go do chłodni lub lodu.</li>
<li style="tab-stops: list .5in">Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieść pojedynczego komara z szalki do 100 ul PBS na szkiełku przedmiotowym umieszczonym pod mikroskopem sekcyjnym. Pozostałe komary pozostawić pod przykryciem w schłodzonej szalce Petri.</li>
<li style="tab-stops: list .5in">Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami chwycić komara za klatkę piersiową i tylną część odwłoka. Rozdzielić ciało, aż odsłoni się jelito środkowe. Użyć pęsety, aby usunąć nadmiar tkanki z jelita. Jelito wygląda jak biały, workowaty organ. Usunąć nadmiar tkanki z jelita. Umieścić jelito w jednym z dołków szkiełka przedmiotowego z 12 dołkami i zanurzyć w 5-10 μl 0,2% mercurochromu. Rozgnieść pozostałości ciała i wyrzucić na wilgotny ręcznik papierowy. Powtarzać czynność dla kolejnych komarów, aż szkiełko z 12 dołkami zostanie zapełnione. Przykryć zamocowane jelita szkiełkiem nakrywkowym.</li>
<li style="tab-stops: list .5in">Zbadać jelita pod mikroskopem świetlnym, poszukując okrągłych oocyst, które barwią się na intensywny różowy kolor w kontraście do przeźroczystej lub bladoróżowej tkanki jelita. Policzyć oocysty, zapisać wynik i przejść do następnej próbki. Kontynuować procedurę dla wszystkich komarów ze wszystkich grup badawczych.</li>
<li style="tab-stops: list .5in">Po zakończeniu przetrzeć szkiełko ręcznikiem papierowym. Ręcznik papierowy z jelitami oraz ręcznik z pozostałościami ciał umieścić w małym worku na odpady biologiczne i wyrzucić do kosza. Przez cały czas trwania procedury należy nosić rękawiczki. Należy zachować ostrożność, aby żadne zainfekowane komary nie uciekły.</li>
</ol>

<ol><li>Avila, S. L., Ferreira, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+diagnosis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Malaria diagnosis: a review.</a> Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).</li>
<li>Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+PCR+assay+for+quantifying+Plasmodium+falciparum+infections+in+the+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector.</a> Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).</li>
<li>Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Plasmodium+malariae+infection+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors.</a> Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).</li>
<li>Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+study+of+oocyst-sporozoite+transition+in+malaria+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors.</a> Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).</li>
<li>Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+results+of+light+microscopy+with+the+results+of+PCR+method+in+the+diagnosis+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax.</a> J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).</li>
<li>Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step%2C+PCR-based+method+for+the+detection+and+differentiation+of+Plasmodium+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Trop+Med+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax.</a> Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mosquito+genes+on+Plasmodium+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of mosquito genes on Plasmodium development.</a> Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).</li>
<li>Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+and+Anopheles+transcriptomes+during+oocyst+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).</li>
</ol>

W procesie zakażania *Plasmodium* oraz określania fenotypu zakażenia mogą występować pewne różnice, a poszczególne laboratoria mogą stosować odmienne techniki.

<table><tbody><tr><td>Anopheles</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>komary</td></tr><tr><td>Plasmodium falciparum</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>pasożyt. Gametocyty o znanej gametocytemii.</td></tr><tr><td>probówki stożkowe 15 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>tworzywo sztuczne</td></tr><tr><td>Surowica, krew</td><td></td><td></td><td></td><td>człowiek, O+</td></tr><tr><td>0,2% merkurochromu</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamella szklana</td><td></td><td></td><td></td><td>płytka 12-dołkowa</td></tr><tr><td>mikroskop świetlny</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>licznik komórek</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór wybielacza</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet</td><td></td><td></td><td></td><td>do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>karmiarka dla komarów</td><td></td><td></td><td></td><td>szklane podajniki membranowe, rurki gumowe dopasowane do podajników</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td></td><td></td><td></td><td>slass</td></tr><tr><td>pinceta precyzyjna</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>1X, sterylne</td></tr><tr><td>łaźnia wodna z cyrkulacją</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">pipetman</td></tr></tbody></table>

protokół zakażania komarów *plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu zakażeniom *Plasmodium* w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy zakresu zakażeń komarów *Plasmodium*. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.

Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia

Gdy gen zostanie zidentyfikowany jako potencjalnie odporny na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w obrębie...

Nazywam się George Dimopoulos i reprezentuję Instytut Badań nad Malarią w Szkole Zdrowia Publicznego Uniwersytetu Johns Hopkins. Przedstawimy Państwu procedurę zakażania komarów Anopheles gambiae pasożytami Plasmodium falciparum oraz sposób określania fenotypu zakażenia w jelicie środkowym komara. Do przeprowadzenia tej procedury niezbędny jest inkubator CO2 do hodowli pasożytów. Alternatywnie, w przypadku braku inkubatora CO2, można zastosować słoik z zapaloną świecą (tzw. candle jar).Oczywiście potrzebujemy również insektarium, standardowego sprzętu do biologii molekularnej i biologii komórki, takiego jak mikroskopy stereoskopowe oraz mikroskopy świetlne. Potrzebujemy łaźni wodnych. Potrzebujemy systemu sztucznego karmienia komarów przez membranę oraz wirówek.Cześć, nazywam się ISH i pracuję w laboratorium dr. George'a Deposa. Jestem pracownikiem postdocalnym. Nazywam się Lindsay Garver i jestem doktorantką.Pierwszym krokiem infekcji plazmy jest przygotowanie hodowli plazmy. Jeśli nie dysponujesz inkubatorem z dwutlenkiem węgla, możesz użyć słoika ze świeczką, w którym umieścisz płytkę sześciodołkową z hodowlą gato, następnie zapalisz świeczkę i szczelnie zamkniesz słoik. Pierwszym krokiem jest przygotowanie świeżej ludzkiej krwi oraz surowicy i umieszczenie ich najpierw w kąpieli wodnej w temperaturze 37°C w celu rozmrożenia oraz ogrzania, ponieważ niezbędna jest krew i surowica o wysokiej temperaturze.Aby przygotować krew, należy odstawić jedną próbkę świeżej krwi ludzkiej. Świeżą krew należy wirować z prędkością 2000 RPM przez pięć minut w celu osadzenia erytrocytów. Po zakończeniu wirowania należy odlać klarowną nadsączkę, a czerwony osad, który stanowi RBC, należy przemyć trzykrotnie w ludzkim serum.Do osadu dodajemy równą objętość ludzkiej surowicy, mieszamy i ponownie wirujemy przy 2000 RPM przez pięć minut. Krok ten powtarzamy trzykrotnie. W efekcie otrzymujemy osady erytrocytów gotowe do dodania do hodowli ganocyte.Kultura plasmodium znajdująca się w inkubatorze CO2 musi być utrzymywana w medium RPMA przez 16 dni; w 16. dniu są one gotowe do zakażenia. Ponieważ pracujemy z kulturą plasmodium, na każdym etapie należy zachować szczególną ostrożność. Pierwszym krokiem jest hodowla pasożytów w laboratorium klasy BC2, która powinna być przeprowadzona w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Wszystkie końcówki do pipet oraz wszystkie probówki typu Eppendorf muszą zostać wyrzucone do pojemnika na odpady biologiczne, a wszelkie pozostałe rozwiązania, takie jak nasze pipety manometryczne, muszą zostać umyte w 10% roztworze wybielacza; podczas tej czynności należy nosić rękawiczki i fartuchy laboratoryjne. Z hodowli z 16. dnia należy pobrać małą kroplę krwi na szkiełko przedmiotowe, wykonać rozmaz i poddać go barwieniu, a następnie zbadać pod mikroskopem świetlnym.Procentowy udział GAMMAT można określić z kultury gametocytów w 16. dniu. Usunąć większość medium, dbając o to, aby nie zakłócić ani nie zassać pasożytów, które znajdują się na dnie; następnie pipetować resztę medium i pasożytów. Po wymieszaniu pasożytów z erytrocytami, zawiesinę pasożytów przenieść do probówki z zakrętką, a następnie poddać wirowaniu w wirówce z prędkością 2000 RPM przez pięć minut.Po wirowaniu pasożyty utworzą osad wraz z erytrocytami. Nadosad stanowi medium RPMI, a na dnie znajduje się osad zawierający pasożyty. Usuń nadosad, czyli medium RPMI, pozostawiając erytrocyty wraz z pasożytami.Należy zachować ostrożność podczas manipulowania mediami, aby nie zakłócić układu pasożytów i erytrocytów. Procentowa zawartość GATOT, wyznaczana przez GIMs 10, zazwyczaj mieści się w przedziale od 2 do 4%. Po zakończeniu wirowania, gdy erytrocyty i pasożyty są gotowe, zostają one ze sobą zmieszane, a objętość krwi do dodania jest określana na podstawie końcowego procentowego stężenia gatot. Musi ono być dokładne i zazwyczaj mieści się w zakresie od 0,3 do 1%; taka zawiesina zostanie wykorzystana do karmienia komarów phys.W przypadku infekcji Presidium S stosowany jest szklany karmnik, który służy do karmienia komarów przez membranę. Krew wprowadza się przez widoczny niewielki otwór, a następnie jest ona w nim przechowywana. Po bokach, na dole, znajdują się dwie dysze podłączone do kąpieli wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C.Aby przygotować karmnik do podawania pokarmu, pobieramy mały fragment folii. Rozciągamy go za dwa końce z każdej z czterech stron, a następnie nakładamy na otwartą stronę szklanego karmnika, aby utworzyć cienką warstwę błony imitującą skórę. Jest to tzw. karmienie przez błonę.Jest to łaźnia wodna z cyrkulacją, która utrzymuje wodę w temperaturze 37°C i jednocześnie tłoczy ją przez szklany element grzejny, aby krew pozostawała ciepła w 37°C. Podłączamy szklany element grzejny za pomocą małych kapilar do łaźni wodnej z cyrkulacją, a następnie włączamy urządzenie, aby woda zaczęła krążyć; woda i krew nigdy się nie mieszają, ponieważ znajdują się w dwóch oddzielnych komorach. Jest to mały kubek zawierający komary *Anopheles gambiae*.W pierwszej kolejności szklany podajnik zostaje umieszczony na klatce, a na nim kładzie się obciążnik, aby membrana (film) była zrównana z siatką. Do podajnika dodaje się około 200 µL krwi zawierającej pasożyty w wymaganym procencie gametocytów, upewniając się, że krew spłynie na sam dół, aby komary miały do niej dostęp.Proces karmienia kontynuuje się przez około 30 minut. Po zakończeniu karmienia szklany podajnik należy dokładnie umyć w 10% roztworze wybielacza, a pozostałe membrany oraz taśmy należy odczepić i wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne. Po zakończeniu karmienia krwią należy oddzielić komary, które nie przyjęły pokarmu, od tych nakarmionych.W tym celu zniesiono aktywność komarów, umieszczając małe kubeczki zawierające komary po pobraniu krwi w pomieszczeniu chłodniczym na od 5 do 10 minut. Jak widać, komary są już zniesioną w niskiej temperaturze. Otwieramy pokrywkę i przenosimy komary do małej szalki Petriego, która spoczywa na wiadrze z lodem, aby komary przez cały czas pozostawały w chłodzie i nie mogły uciec.Należy pamiętać, że są to komary zakażone plasmodium, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do ich ucieczki. Gdy komary znajdą się w chłodni, przenosimy je do zwykłego insekciarium, w którym utrzymywana jest temperatura pokojowa, jednak komary zawsze umieszczamy w szalce Petriego, która znajduje się w wiadrze z lodem, aby pozostały one w stanie uśpienia. Można zobaczyć, w jaki sposób oddzielić komary karmione od tych niekarmionych.Osobniki po żerowaniu mają w sobie krew. Są one w pełni nasycone. Niektóre z nich żerowały na krwi częściowo, więc nie są w pełni nasycone.Niektóre z nich mają niewielką ilość krwi w odwłoku, inne natomiast mają jej znacznie więcej. Jednostki nienasycone nie mają w odwłoku żadnej krwi, dzięki czemu można bardzo łatwo odróżnić osobniki nasycone od nienasyconych. Przedstawione tutaj dorosłe samice komarów są nasycone krwią, dlatego przeniesiemy je z szalki Petriego do tekturowych kubeczków wyłożonych woskiem.Po umieszczeniu komarów po karmieniu krwią w kubkach, dodajemy mały kawałek waty nasączonej 10% sucrose, aby mogły one pobierać 10% sucrose przez kolejne siedem dni inkubacji; umieszczamy również mały, złożony ręcznik papierowy w celu utrzymania wilgotności wewnątrz kubka i przykrywamy go szalką Petriego. Komary zakażone plasmodium są umieszczane w oddzielnej małej klatce, co zapewnia podwójną ochronę; klatkę umieszczamy w laboratorium BSL-3, w którym utrzymuje się temperaturę 27 °C i wilgotność 80%. Siedem dni po karmieniu krwią komary przetrzymywane w insektorium w podwójnej klatce są z niego wyjmowane i przenoszone do pomieszczenia chłodniczego w celu ich uśpienia.Po uśpieniu komarów zostają one przeniesione do szalki Petriego, która jest umieszczona w wiadrze z lodem. Teraz przygotowujemy się do sekcji komarów. Wypreparujemy jelito środkowe i będziemy szukać cysty.Pierwszym krokiem jest dodanie 100 µL PBS na szkiełko przedmiotowe umieszczone pod mikroskopem stereoskopowym. W kolejnym kroku, używając pęsety, przenosimy pojedynczego komara z czarki Petriego do PBS znajdującego się na szkiełku przedmiotowym pod mikroskopem stereoskopowym.Pozostałe osobniki pozostają na schłodzonej szalce Petriego. Aby przeprowadzić sekcję komarów, należy przytrzymać komara w obrębie tułowia jedną pęsetą, a tylną część odwłoka drugą pęsetą. Następnie należy powoli rozciągać ciało, aż do odsłonięcia jelita środkowego.Wygląda to jak biały woreczek; należy użyć pęsety, aby usunąć nadmiar tkanki i pozostałe części ciała. Tak, to jest jelito środkowe, które wygląda jak biały woreczek i zawiera zawartość. Przeniesiemy teraz jelito środkowe na szkiełko z 12 wgłębnikami i zanurzymy w 5–10 µL 0,2% Microprobe, co ustabilizuje jelito środkowe; następnie należy wyjąć szkiełko.Używając szkiełka nakrywkowego, wykonujemy ten krok dla wszystkich zakażonych komarów. Jelito ma jaskraworóżowy kolor; przeniesiemy to preparat pod mikroskop świetlny, aby policzyć obciążenie OS. Obserwujemy teraz środek jelita wypreparowany z zakażonych komarów.Środkowy jelito przypomina gładki organ i przy zastosowaniu barwienia ROM wykazuje bardzo lekki różowy kolor, natomiast SST powinno być intensywnie różowe na tle bladego różu tkanki jelita. Te środkowe jelita pochodzą z zainfekowanych komarów, ale nie wykazują obecności SST, więc mogą nie być zainfekowane. Gdyby jednak środkowe jelito było zainfekowane, SST objawiłoby się jako mały, intensywnie różowy krąg, a w obrębie jednego środkowego jelita mogą czasami występować liczne skupiska od 22 do 500.Niniejsza procedura polegała na zakażeniu ludzkiej krwi pasożytami plasmodium rum, podaniu tej zakażonej krwi komarom ly Gambian, wypreparowaniu jelita środkowego z tych komarów oraz określeniu liczby oocyst w tych zakażonych jelitach środkowych. Technika ta jest istotna, ponieważ stanowi najbliższą możliwą do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych aproksymację transmisji malarii u ludzi.

protocol-for-plasmodium-falciparum-infections-mosquitoes-infection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Protokół dotyczący infekcji Plasmodium falciparum u komarów i oznaczania fenotypu infekcji

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum.  Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Szczegółowe badania nad stadiami pasożytów malarii u komarów są niezbędne do opracowania skutecznych strategii blokowania transmisji. Protokół ten pokazuje, jak skutecznie hodować zakaźne gametocyty, a następnie karmić te gametocyty komarami w celu wytworzenia stadiów komara P. falciparum.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

Poznaj metodę zakażeń Plasmodium falciparum u komarów Anopheles gambiae i oznaczania fenotypu infekcji w przewodzie pokarmowym. Protokół obejmuje hodowlę gametocytów, karmienie membranowe i analizę mikroskopową.

Protokół zakażania komarów Plasmodium falciparum i określania fenotypu zakażenia

Przeglądaj więcej filmów