Name: Transsekcja nerwu wzrokowego: model apoptozy neuronów u dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę transsekcji nerwu wzrokowego jako model apoptozy neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłych. Technika ta pozwala badać mechanizmy śmierci komórek zwojowych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PDK jest wspierany przez grant operacyjny CIHR (MOP 86523)

1. Technika chirurgiczna
<ol>
 <li>Doświadczenia należy przeprowadzać z zachowaniem zasad aseptyki oraz zgodnie z protokołami dotyczącymi wykorzystania zwierząt obowiązującymi w danej instytucji. Instrumenty i materiały (roztwory, substancje testowe, znaczniki, igły itp.) mające kontakt z żywą tkanką muszą być sterylne, aby zapobiec infekcjom, negatywnemu wpływowi na dobrostan zwierząt oraz potencjalnym zakłóceniom przebiegu badania.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
 <li>Szczury zostaną znieczulone przy użyciu weterynaryjnego systemu waporyzacji izofluranu. Do waporyzacji gazowego izofluranu należy użyć tlenu medycznego z przepływem 0.8 L/min. Umieścić zwierzę w dołączonej komorze anestezjologicznej i ustawić stężenie izofluranu na 4%, aż do spowolnienia oddechu i uspokojenia zwierzęcia.</li>
 <li>Następnie przełączyć przepływ gazu na maskę dopasowaną do aparatu stereotaktycznego i umieścić zwierzę w urządzeniu stereotaktycznym. Obniżyć stężenie izofluranu do 2% i monitorować znieczulenie. Większe zwierzęta (&gt;300g) mogą wymagać wyższego stężenia izofluranu. Znieczulenie powinno być monitorowane podczas operacji, a dawka izofluranu odpowiednio dostosowywana. Należy stale oceniać głębokość i częstotliwość oddechów oraz co 5 min przeprowadzać test ucisku palca u stopy w celu sprawdzenia braku reakcji na głęboki ból.</li>
 <li>Po zakończeniu operacji wyłączyć dopływ izofluranu i pozwolić zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut przed wyjęciem z urządzenia stereotaktycznego. Temperaturę ciała należy utrzymywać, przykrywając zwierzę kocem chirurgicznym i/lub stosując regulowaną matę grzewczą podczas zabiegu.</li>
</ol>
3. Metoda chirurgiczna
<ol>
 <li>Zwilż futro na szczycie głowy 70% etanolem, aby ułatwić jego wycięcie. Usuń futro z obszaru między oczami za pomocą trymera lub ostrych nożyczek. Oczyść miejsce nacięcia trzykrotnie, stosując naprzemiennie roztwór detergentu jodowego (Proviodine, Betadine itp.), a następnie 70% etanol. Przez cały czas trwania operacji utrzymuj rogówkę w stanie wilgotnym, nakładając na nią maść okulistyczną (Tears Naturale P.M.). Rozprowadź maść po powierzchni rogówki, ręcznie otwierając i zamykając powieki.</li>
 <li>Za pomocą ostrza nr 11 wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy, od około 0.5 cm przed oczami do 1 cm za oczami. Odchyl płat skóry nad okiem za pomocą pęsety i delikatnie oddziel leżącą poniżej tkankę łączną grzbietem skalpela. Następnie odsuń płat skóry bocznie i w dół, a następnie utrwal go za pomocą retraktora chirurgicznego, który można przymocować taśmą do podstawy instrumentu stereotaktycznego.</li>
 <li>Wykonaj nacięcie wzdłuż górnej krawędzi kości oczodołowej, odciągając nadleżącą powięź ostrymi pęsetami. Pozwoli to na odsunięcie powięzi pokrywającej oczodół oka. Krawędź kości oczodołowej można wyraźnie wyznaczyć, naciskając pęsetą na powięź nad oczodołem. Używając kauteryzatora lub skalpela, kontynuuj nacięcie w kierunku tylnej granicy oczodołu oka. Jako prowadnicę nacięcia wykorzystaj kość górnej części oczodołu. Następnie kontynuuj nacięcie w kierunku przedniej granicy oczodołu. Nacięcie górnej części oczodołu najlepiej wykonać za pomocą małego kauteryzatora, aby zapobiec krwawieniu z leżących poniżej naczyń komunikujących się z zatokami żylnymi.</li>
 <li>W przypadku wystąpienia krwawienia można podjąć kilka kroków. Po pierwsze, wywrzyj ucisk za pomocą sterylnych gazików chirurgicznych lub patyczków bawełnianych. Jeśli krwawienie nie ustąpi, nanieś na ten obszar za pomocą zakraplacza zimny, sterylny roztwór soli fosforanowej (PBS) i utrzymuj ucisk. Niewielkie krwawienie ustąpi po kilku sekundach zastosowania tej procedury. Jeśli krwawienie będzie trwało, odciągnij tkankę gazikiem chirurgicznym lub patyczkiem bawełnianym, aby zidentyfikować źródło krwawienia i szybko zkoagulować uszkodzone naczynie. Po opanowaniu krwawienia oczyść pole operacyjne z krwi, używając zimnego sterylnego PBS. Pole operacyjne należy okresowo oczyszczać w ten sposób, aby lepiej zwizualizować struktury w oczodole oka.</li>
 <li>Po oczyszczeniu nacięcia użyj pęsety i grzbietu skalpela, aby oczyścić tkankę łączną z tyłu oka, która pokrywa zawartość oczodołu. Grzbiet skalpela nr 11 sprawdza się dobrze ze względu na cienką końcówkę. Pozwoli to na otwarcie głębszych części jamy oczodołowej, zapewniając większe okno operacyjne do pracy. Podczas pracy w obrębie oka stosuj ostre, zakrzywione i ząbkowane pęsety Dumont #7b, ponieważ ich krzywizna i cienkie końcówki są idealne do manipulowania strukturami w oczodole. Ponadto ząbkowanie ułatwia chwytanie struktur.</li>
 <li>Następnie usuń tkankę łączną otaczającą gałąź oczną nerwu trójdzielnego, która znajduje się w pobliżu linii środkowej, i usuń nerw za pomocą pęsety. Krok ten nie jest konieczny, jednak usunięcie nerwu zapewni w późniejszym etapie większe okno dostępu do nerwu wzrokowego.</li>
 <li>Po usunięciu nerwu odsuń pęsetą naczynie krwionośne znajdujące się poniżej i całkowicie je zkoaguluj. Ten krok również nie jest konieczny, jednak kauteryzacja naczynia pozwala na jego przesunięcie do przodu, tworząc tym samym większe okno po dotarciu do nerwu wzrokowego.</li>
 <li>Używając ostrych pęset lub pęset z końcówkami zagiętymi do wewnątrz, ostrożnie chwyć i usuń cienką warstwę tkanki łącznej nad mięśniami pozagałkowymi i gruczołem łzowym. Odsuń mięśnie pozagałkowe od przodu do tyłu oczodołu. Chwyć proksymalną część mięśnia pęsetą i użyj drugiej pary zakrzywionych ząbkowanych pęset okulistycznych, aby przyłożyć trakcję zewnętrzną do mięśnia. Upewnij się, że pęsety okulistyczne są skierowane w tym samym kierunku co mięsień podczas ciągnięcia, aby zapobiec jego rozerwaniu. W ten sposób usuń najbardziej przedni mięsień oczodołu (mięsień skośny górny). Mięsień zostanie uwolniony z głębi oczodołu, a pozostałą jego część można odsunąć, aby obrócić oko na zewnątrz.</li>
 <li>Powtórz krok 3.8 z następnym mięśniem (mięsień prosty przyśrodkowy), który znajduje się między płatami gruczołu łzowego a gruczołem Hardera w pobliżu linii środkowej grzbietowej powierzchni oka. Przymocuj retraktor taśmą, aby utrzymać trakcję mięśni.</li>
 <li>Delikatnie usuń wszelką pozostałą tkankę łączną z powierzchni gruczołu łzowego i unieś gruczoł do góry za pomocą pęsety. Nie ściskaj ani nie miażdż gruczołu. Aby odsunąć gruczoł, należy zkoagulować tylko jedno naczynie na biegunie tylnym. Unieś tylny koniec gruczołu do góry, a następnie zkoaguluj naczynie.</li>
 <li>Następnie odchyl gruczoł łzowy do przodu, aby otworzyć tylną część oczodołu i umożliwić swobodny dostęp do mięśni leżących nad nerwem wzrokowym. Utrzymuj obszar w stałej wilgoci, używając sterylnego PBS i osuszając go gazikami chirurgicznymi lub patyczkami bawełnianymi.</li>
 <li>Używając ponownie ostrych pęset, usuń cienką tkankę łączną otaczającą mięśnie tylnej części oczodołu (mięsień dźwigacz powieki górnej i mięsień prosty górny) i rozdziel leżące poniżej pęczki mięśniowe. Odsuń mięśnie niezależnie lub razem, używając zakrzywionych ząbkowanych pęset okulistycznych, ponownie ciągnąc wzdłuż włókien mięśniowych. Przymocuj pozostałe odcinki mięśni do retraktora wraz z mięśniami odsuniętymi w krokach 3.8 i 3.9 i przymocuj retraktor taśmą, aby zastosować trakcję. Łącznie do retraktora przymocowanych zostanie 4 mięśnie. Spowoduje to obrócenie oka do przodu i na zewnątrz w celu odsłonięcia zawierającej tłuszcz osłonki otaczającej nerw wzrokowy.</li>
</ol>
4. Dostęp do nerwu wzrokowego
<ol>
 <li>Użyj ostrych pęset (Fine tip Dumont), aby pociągnąć do góry tkankę łączną otaczającą osłonkę tłuszczową nerwu wzrokowego. Wykonaj cięcie wzdłużne za pomocą małych sprężynowych nożyczek Vannasa. W razie potrzeby poszerz cięcie. Tłuszcz zawarty w osłonce zacznie wypływać po wykonaniu nacięcia. Następnie usuń płaty tkanki łącznej, ostrożnie pociągając krawędź do góry i odcinając półksiężycowate płaty tkanki.</li>
 <li>Usuń tłuszcz pokrywający nerw wzrokowy, pociągając go pęsetą i jednocześnie odcinając nożyczkami sprężynowymi Vannas. Utrzymuj obszar w czystości, używając sterylnego PBS i gazików chirurgicznych do usuwania niewielkich ilości krwi pojawiających się podczas usuwania tkanki.</li>
 <li>Nerw wzrokowy jest teraz widoczny. Aby uzyskać dostęp do nerwu, należy usunąć otaczającą go osłonkę oponową, nie uszkadzając tętnicy ocznej, która odżywia wewnętrzną warstwę siatkówki. Zbadaj układ naczyniowy osłonki oponowej, delikatnie obracając ją pęsetą. Poszukaj obszaru pozbawionego naczyń krwionośnych, który pozwoli na wykonanie cięcia wzdłużnego w osłonce oponowej.</li>
 <li>Używając pęsety Fine tip Dumont, uciśnij oponę twardą i pociągnij ją do góry. W pobliżu podstawy powstałego trójkątnego klina opony twardej, użyj sprężynowych nożyczek Vannasa, aby wykonać małe nacięcie w osłonce. Wsuń dolne ostrze nożyczek w nacięcie i przetnij osłonkę równolegle do kierunku przebiegu nerwu wzrokowego, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych cięciami bocznymi. Użyj pęsety i nożyczek, aby odsunąć oponę twardą na obie strony nerwu wzrokowego.</li>
 <li>Jedyną pozostałą osłoną nerwu jest błona pajęczynowa. Jest ona bardzo cienka i przezroczysta. Aby sprawdzić, czy błona jest nadal obecna, użyj ostrych pęset, aby ucisnąć powierzchnię nerwu. Jeśli błona pajęczynowa jest obecna, uciśnij ją i pociągnij do góry, tworząc trójkątny klin tkanki. Wykonaj małe nacięcie końcówką nożyczek, analogicznie do kroku 4.4. Następnie wsuń dolne ostrze nożyczek i wykonaj cięcie wzdłużne w błonie pajęczynowej. Następnie użyj nożyczek i pęsety, aby odsunąć błonę pajęczynową na obie strony nerwu wzrokowego.</li>
 <li>Używając mikrochirurgicznego haczyka, unieś nerw wzrokowy z osłonki oponowej. Przesuń końcówkę haczyka wokół zewnętrznej krawędzi nerwu i upewnij się, że haczyk pozostaje w kontakcie z nerwem, aby nie pochwycić opon mózgowych i nie przeciąć ich przypadkowo. Delikatnie unieś nerw wzrokowy z osłonki oponowej i całkowicie przetnij nerw za punktem podtrzymywanym przez haczyk. Przecięty kikut nerwu wzrokowego będzie teraz miał wolny koniec, co umożliwi usunięcie haczyka.</li>
 <li>Jeśli komórki zwojowe siatkówki (RGCs) mają zostać znakowane retrogradnie w celu ilościowej oceny przeżywalności, umieść mały fragment gąbki żelatynowej nasączonej 3% Fluorogold (lub innym markerem retrogradnym) na przeciętym kikutie nerwu wzrokowego (patrz <a href="https://www.jove.com/details.php?id=2261">protokół JoVE 2261</a>).</li>
</ol>
5. Zamknięcie i rekonwalescencja
<ol>
 <li>Zwolnij trakcję mięśni pozagałkowych i przywróć oko do pozycji neutralnej. Podczas tej czynności upewnij się, że gelfoam został dociśnięty do oczodołu, aby podczas obracania oka z powrotem na miejsce gelfoam pozostał wokół kikutu nerwu wzrokowego. Przywróć gruczoł łzowy i mięśnie pozagałkowe do ich naturalnych pozycji.</li>
 <li>Przywróć płat skóry do linii środkowej i zaszyj ranę. Nałóż maść oftalmiczną do obu oczu. Następnie wyłącz źródło izofluranu i pozwól zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut. Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce lub w klatce pod lampą grzewczą w celu rekonwalescencji. Nie umieszczaj żadnej ściółki w klatce regeneracyjnej, aby wyeliminować ryzyko aspiracji ściółki podczas wybudzania.</li>
 <li>Po operacji zwierzęta powinny być utrzymywane indywidualnie. Leki przeciwbólowe pooperacyjne należy podawać zgodnie z wytycznymi organów ds. opieki nad zwierzętami, a zwierzęta powinny być uważnie monitorowane po zabiegu.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Przecięcie nerwu wzrokowego prowadzi do utraty 90% uszkodzonych RGC w ciągu 14 dni po aksonotomii 9-11. Głównym mechanizmem śmierci RGC jest apoptoza 9, 12. Normalna gęstość RGC wynosi około 2500 komórek/mm2. Do wizualizacji wstecznie znakowanych RGC po aksonotomii można wykorzystać obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne. Apoptoza RGC jest opóźniona o około 4 dni po aksonotomii, co stwarza okno czasowe dla manipulacji eksperymentalnych. W 1. dniu po aksonotomii i wstecznym znakowaniu Fluorogoldem, ciała komórek RGC w warstwie komórek zwojowych siatkówki oraz pęczki aksonów w warstwie włókien nerwowych siatkówki są wyraźnie widoczne podczas obrazowania preparatu w montażu płaskim (Ryc. 1a). Do 14. dnia po aksonotomii większość RGC obumiera, a nieliczne pozostałe komórki RGC są rozproszone pomiędzy mikroglejem siatkówki (Ryc. 1b). Gdy RGC ulegają apoptozie, mikroglej fagocytuje martwe komórki, w wyniku czego zostaje oznakowany transkomórkowo fluorescencyjnym znacznikiem, który służył do znakowania RGC 13, 14. Wygląd znacznika w fagosomach mikrogleju różni się od jego wyglądu w przeżywających RGC. Mikroglej zawiera znacznik w silnie skoncentrowanych i niezwykle jasnych fagosomach, które są stosunkowo duże i rozproszone w całej cytoplazmie (Ryc. 1c). RGC wykazują bardziej rozproszony wzór barwienia (Ryc. 1c) z małymi, punktowatymi pęcherzykami, które zostały przetransportowane wstecznie wzdłuż aksonów i wypełniają cytoplazmę komórki. Pęcherzyki te są znacznie mniejsze i wykazują mniej intensywną fluorescencję, co pozwala odróżnić przeżywające RGC od mikrogleju. Ponadto mikroglej ma znacznie mniejsze ciała komórkowe i wykazuje tendencję do morfologii gwiaździstej lub ameboidalnej, w przeciwieństwie do RGC, które mają stosunkowo duże i zaokrąglone ciała komórkowe. Drzewa dendrytyczne RGC mogą również pomóc w ich odróżnieniu od krótkich, jasnych wypustek mikrogleju podczas kwantyfikacji przeżywalności komórek. Przeżywalność komórek można określić ilościowo w różnych obszarach siatkówki, a gęstość (komórek/mm2) można ekstrapolować z powierzchni odpowiadających mikrofotografii, ponieważ RGC występują w pojedynczej warstwie w obrębie warstwy komórek zwojowych.
<img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Neuronauka; obraz mikroskopowy komórek zwojowych siatkówki; wizualizacja struktury komórkowej; markery RGC." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Mikrofotografie epifluorescencyjne komórek RGC znakowanych Fluorogold po aksonotomii i aplikacji znacznika do kikutu nerwu wzrokowego. (A) 1 dzień po aksonotomii – komórki RGC i ich pęczki aksonalne są znakowane znacznikiem w postaci drobnych punktów. (B) Do 14. dnia po aksonotomii obumarło 90% komórek RGC; widoczna jest również jasna fluorescencja mikrogleju, który fagocytował martwe komórki. (C) Większe powiększenie ilustrujące różnicę między komórkami RGC a mikroglejem (czerwone groty strzałek) w 14. dniu po aksonotomii. Pasek skali na A i B wynosi 50 μm. Pasek skali na C wynosi 25 μm.

<ol><li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li>
<li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development%2C+survival%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li>
<li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons%3A+where+have+they+gone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li>
<li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Restor.+Neurol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li>
<li>Valenzuela, G. arcia, E, S. C. S. harma <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li>
<li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump%3A+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li>
<li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li>
<li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10%2C+interleukin-4%2C+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li>
<li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li>
<li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li>
<li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Istnieje wiele wariantów tej procedury chirurgicznej, a niektóre z etapów opisanego protokołu nie są niezbędne. Aby uzyskać dostęp do nerwu, wystarczy odsunąć jedynie mięśnie pokrywające nerw wzrokowy. Skutkuje to jednak bardzo ograniczoną przestrzenią roboczą wokół nerwu, co utrudnia krytyczne końcowe etapy przecinania. W określonych sytuacjach pożądana jest transfekcja komórek z kikuta nerwu wzrokowego i w takim przypadku korzystna jest zwiększona przestrzeń dostępu uzyskiwana poprzez odsunięcie wszystkich mięśni pozag...

<table><tbody><tr><td>Stereotaksyczny zestaw ramowy</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maska gazowa dla szczurów</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold (Hydroksystilbamidyny bimetansulfonian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proviodine</td><td>Medline Industries</td><td>MDS093945H</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannasa</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgiczny haczyk</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>Szatkownicza pinceta okulistyczna z rowkami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Ostra zakrzywiona pinceta Dumont #7b z rowkami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr></tbody></table>

przecięcie nerwu wzrokowego: model apoptozy neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Komórki zwojowe siatkówki (RGCs) to neurony ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które przekazują informacje wzrokowe z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. 
Do nerwu wzrokowego można uzyskać dostęp w obrębie oczodołu i całkowicie go przeciąć (wykonać aksotomię), co prowadzi do przerwania aksonów całej populacji RGCs. Przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptycznej śmierci komórek neuronalnych w dorosłym OUN 1-4. Model ten jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ ciało szklistkowate oka pełni rolę kapsuły do dostarczania leków do siatkówki, umożliwiając manipulacje eksperymentalne poprzez zastrzyki doszklistkowe. Dyfuzja substancji chemicznych przez ciało szklistkowate zapewnia ich działanie na całą populację RGCs. Ponadto RGCs można selektywnie przetransfekować, aplikując krótkie interferujące RNA (siRNAs), plazmidy lub wektory wirusowe do przeciętego końca nerwu wzrokowego 5-7 lub wstrzykując wektory do ich celu, czyli wzgórka górnego 8. 
Pozwala to badaczom na analizę mechanizmów apoptozy w pożądanej populacji neuronalnej bez zakłócającego wpływu na inne neurony lub otaczającą gleję. 
Dodatkową zaletą jest łatwość i dokładność, z jaką można określić przeżywalność komórek po urazie. Siatkówka jest płaską, warstwową tkanką, a RGCs znajdują się w jej najwewnętrznej warstwie – warstwie komórek zwojowych. Przeżywalność RGCs można śledzić w czasie, aplikując fluorescencyjny znacznik (3% Fluorogold) do przeciętego końca nerwu wzrokowego w momencie aksotomii lub wstrzykując znacznik do wzgórka górnego (celu RGCs) na tydzień przed aksotomią. Znacznik jest transportowany retrogradnie, znakując całą populację RGCs. Ponieważ warstwa komórek zwojowych jest monowarstwą (ma grubość jednej komórki), gęstość RGCs można określić w tkance zamontowanej na płasko, bez konieczności stosowania stereologii. Przecięcie nerwu wzrokowego prowadzi do apoptycznej śmierci 90% uszkodzonych RGCs w ciągu 14 dni po aksotomii 9-11. Apoptoza RGCs ma charakterystyczny przebieg czasowy, w którym śmierć komórek jest opóźniona o 3-4 dni po aksotomii, po czym następuje szybka degeneracja komórek. Zapewnia to okno czasowe dla manipulacji eksperymentalnych skierowanych przeciwko szlakom zaangażowanym w apoptozę.

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Dziewięćdziesiąt procent komórek zwojowych siatkówki (RGCs), których aksony zostały całkowicie przecięte (aksotomia), obumiera w ciągu 14 dni po aksotomii. Model ten jest łatwy do manipulacji eksperymentalnych i wykazuje wysoką powtarzalność.

Przecięcie nerwu wzrokowego: Model apoptozy neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym

Komórki zwojowe siatkówki (RGCs) są neuronami ośrodkowego układu nerwowego (CNS), które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego.
Nerw wzrokowy może zostać...

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) to neurony ośrodkowego układu nerwowego, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pomocą nerwu wzrokowego. Przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptycznej śmierci komórek neuronalnych w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym. W niniejszej procedurze przecięcie nerwu wzrokowego wykonuje się poprzez otwarcie górnej części oczodołu, aby uzyskać dostęp do struktur pokrywających nerw wzrokowy.Gruczoł łzowy oraz mięśnie pozagałkowe zostają odsunięte, a osłonki oponowe nerwu wzrokowego zostają otwarte. Następnie nerw wzrokowy zostaje uniesiony z osłonek oponowych i przecięty. Ostatecznie 90% uszkodzonych komórek zwojowych siatkówki, których aksony tworzą nerw wzrokowy, ginie w wyniku programowanej śmierci komórki w ciągu dwóch tygodni od urazu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi modelami uszkodzeń mózgu jest większa powtarzalność przecięcia nerwu wzrokowego oraz łatwiejsza możliwość kierowania manipulacji eksperymentalnych na uszkodzone neurony. Zastosowania tej techniki obejmują terapie urazów i chorób ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ siatkówka nerwowa jest częścią dorosłego ośrodkowego układu nerwowe

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przecięcie Nerwu Wzrokowego: Model Apoptozy Neuronów Dorosłych w Ośrodkowym Układzie Nerwowym

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Model ten jest idealny do przeprowadzania szeregu manipulacji eksperymentalnych, które oddziałują na siatkówkę w sposób globalny lub są skierowane bezpośrednio do uszkodzonej populacji neuronów komórek zwojowych siatkówki.

Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Niniejszy protokół przedstawia sposób wstecznego znakowania komórek zwojowych siatkówki oraz późniejsze wywołanie urazu poprzez zmiażdżenie nerwu wzrokowego w celu analizy przeżywalności i apoptozy komórek zwojowych siatkówki. Jest to eksperymentalny model choroby dla różnych typów neuropatii nerwu wzrokowego, w tym jaskry.

Mysi model urazu zmiażdżeniowego nerwu wzrokowego do badania przeżywalności komórek zwojowych siatkówki

Źródło: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem osłonki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych. J. Vis. Exp. (2020). Ten film przedstawia obrazowanie i kwantyfikację regeneracji aksonów w aksotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura (RGN) współhodowanych z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami glejowymi otaczającymi węch. RGN są znakowane immunologicznie, z czerwonymi somi i zielonymi aksonami. Obrazy...

Obrazowanie i kwantyfikacja regeneracji aksonów w akskotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Aby zająć się mechanizmami demielinizacji i apoptozy neuronów w uszkodzeniach korowych zapalnych zaburzeń demielinizacyjnych, używane są różne modele zwierzęce. Opisujemy tutaj podejście ex vivo polegające na użyciu limfocytów T CD8 + specyficznych dla oligodendrocytów na wycinkach mózgu, co powoduje śmierć oligodendroglialną i neuronalną. Omówiono potencjalne zastosowania i ograniczenia modelu.

Model ex vivo ataku limfocytów T kierowanego przez oligodendrocyty w ostrych wycinkach mózgu

Prezentujemy protokół chirurgiczny szczegółowo opisujący, jak wykonać aksotomię cięcia lub zgniecenia nerwu twarzowego u myszy. Akskotomia nerwu twarzowego może być wykorzystana do badania fizjologicznej reakcji na uszkodzenie nerwu i testowania technik terapeutycznych.

Aksotomia nerwu twarzowego u myszy: model do badania reakcji neuronów ruchowych na uraz

Wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) występuje często w jaskrze. W pracy opisano innowacyjne podejście operacyjne do częściowej transsekcji nerwu wzrokowego. Zastosowanie tego oszczędzającego miejsce podejścia operacyjnego rozszerza zakres zastosowań modelu i umożliwia eksplorację mechanizmów wtórnych uszkodzeń w RGC w nowy sposób.

Częściowa transsekcja nerwu wzrokowego u szczurów: model ustalony z nowym podejściem operacyjnym do oceny wtórnego zwyrodnienia komórek zwojowych siatkówki

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Protokół ten opisuje niestandardowy system powietrza nadciśnieniowego przeznaczony do wywoływania uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) układu zamkniętego (OUN) u myszy, w tym urazów oczu, mózgu i rdzenia kręgowego. Celem tego protokołu jest zapewnienie naukowcom ram do łatwego dostosowywania i rozszerzania systemu do ich unikalnych badań nad urazami OUN.

System do leczenia ogniskowych, zamkniętych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego

Ten artykuł przedstawia szczegółowe instrukcje dotyczące wykonywania zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika przy użyciu standardowych technik chirurgii okulistycznej.

Chirurgiczne podejście do zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika

Poznaj metodę transsekcji nerwu wzrokowego jako model apoptozy neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłych. Technika ta pozwala badać mechanizmy śmierci komórek zwojowych siatkówki.

Przecięcie nerwu wzrokowego: Model apoptozy neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym

Przeglądaj więcej filmów