Name: Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w OUN ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T14:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metody manipulacji komórkami zwojowymi siatkówki po przecięciu nerwu wzrokowego u ssaków. Techniki te pozwalają badać mechanizmy apoptozy neuronów dorosłego OUN i testować czynniki przeciwapoptotyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PDK jest wspierany przez grant operacyjny CIHR (MOP 86523)

1. Technika chirurgiczna
<ol>
<li>Doświadczenia należy przeprowadzać z zachowaniem technik aseptycznych oraz zgodnie z protokołami dotyczącymi wykorzystania zwierząt obowiązującymi w danej instytucji. Instrumenty i materiały (roztwory, substancje testowe, znaczniki, igły itp.) mające kontakt z żywą tkanką muszą być sterylne, aby zapobiec infekcjom, negatywnym skutkom dla dobrostanu zwierząt oraz potencjalnemu niekorzystnemu wpływowi na badanie.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
<li>Szczury zostaną poddane znieczuleniu przy użyciu weterynaryjnego systemu parowania izofluranu. Do parowania gazu izofluranowego należy użyć tlenu medycznego z przepływem 0,8 L/min. Umieść zwierzę w dołączonej komorze anestezjologicznej i ustaw stężenie izofluranu na 4%, aż do spowolnienia oddechu i sedacji zwierzęcia.</li>
<li>Następnie przełącz przepływ gazu na przyłącze maski gazowej ramy stereotaktycznej i umieść zwierzę w aparaturze stereotaktycznej. Zmniejsz stężenie izofluranu do 2% i monitoruj znieczulenie. Większe zwierzęta (&gt;30g) mogą wymagać wyższego stężenia izofluranu. Znieczulenie powinno być monitorowane podczas operacji, a dawka izofluranu odpowiednio dostosowana. Należy stale oceniać głębokość i częstotliwość oddechów oraz co 5 min przeprowadzać test ucisku palca u stopy w celu sprawdzenia braku odczuwania głębokiego bólu.</li>
<li>Po zakończeniu operacji wyłącz izofluran i pozwól zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut przed wyjęciem z urządzenia stereotaktycznego. Temperaturę ciała należy utrzymać, przykrywając zwierzę kocem chirurgicznym i/lub stosując regulowany podgrzewacz podczas operacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie strzykawki do zastrzyków wewnątrzgałkowych
<ol>
<li>W pierwszej kolejności należy złożyć system strzykawki do wykonywania wtryskiwań doszklawnych. Do wtryskiwania używa się strzykawki Hamilton RN Gastight 1701 o objętości 10 μL. Należy usunąć wszelkie igły lub nakrętki RN znajdujące się na końcu strzykawki.</li>
<li>Włóż tulejkę PFA do tulejki w uchwycie PEEK złącza kompresyjnego. Następnie włóż kompletne złącze do końca strzykawki i lekko przykręć nad nim nakrętkę RN.</li>
<li>Wsuń jeden koniec rurki PEEK o średnicy 1/16 cala do złącza kompresyjnego, przez otwór w nakrętce RN. Upewnij się, że rurka PEEK jest w pełni osadzona. Dokręć nakrętkę RN, aby ścisnąć tulejkę i uszczelnić rurkę PEEK.</li>
<li>Wykonaj krok 3.2 na obu końcach szklanego łącznika Dual RN. Przymocuj wolny koniec rurki PEEK do jednego końca szklanego łącznika Dual RN, dokręcając nakrętkę RN.</li>
<li>Wyciągnięta szklana mikropipeta będzie stanowić igłę i korpus systemu wtryskiwania. Do wykonania szklanych pipet należy użyć szklanych kapilar o grubych ściankach i średnicy zewnętrznej 1,5 mm, a następnie wsunąć szklaną pipetę do wolnego końca szklanego łącznika Dual RN. Dokręć nakrętkę RN, aby unieruchomić pipetę.</li>
<li>Cienka końcówka wyciągniętych szklanych mikropipet jest zazwyczaj zbyt mała do wykonywania wtryskiwań doszklawnych. Aby stworzyć końcówkę o odpowiedniej średnicy, należy odłamać czubek szklanej pipety pod kontrolą wizualną, używając mikroskopu chirurgicznego. Matowy koniec szklanego preparatu do mikroskopu dobrze nadaje się do odłamywania pipety. Trzymając pipetę pod kątem, należy pocierać końcówką o matową powierzchnię szkła, aby wywołać pęknięcie. Idealnie, jeśli końcowa krawędź będzie lekko ścięta. Uzyskanie dobrej końcówki może wymagać kilku prób, dlatego przed użyciem należy przygotować kilka pipet.</li>
<li>System wtryskiwania jest hydrauliczny. W związku z tym strzykawka, łącznik z rurki PEEK, szklany łącznik Dual RN oraz szklana mikropipeta muszą zostać wypełnione olejem mineralnym przed użyciem. Używając zestawu do przygotowania (Priming kit) firmy Hamilton Syringe Co. (PRMKIT), wypełnij strzykawkę przygotowawczą olejem mineralnym. Użyj igły o dużej średnicy, aby umożliwić łatwy przepływ lepki olej. Zamień igłę na igłę Hamilton 9030, która pasuje do wnętrza korpusu strzykawki Hamilton 10 μL. Następnie nałóż gumową przegrodę (septum) na igłę Hamilton 9030, aby zapewnić szczelność podczas wtryskiwania oleju mineralnego.</li>
<li>Wsuń igłę Hamilton 9030 strzykawki przygotowawczej do tylnej części korpusu strzykawki Hamilton 10 μL systemu wtryskiwania. Mocno dociśnij przegrodę do końca strzykawki, aby stworzyć uszczelnienie.</li>
<li>Powoli wciśnij tłok. Zobaczysz, jak olej mineralny przepływa przez szklane elementy systemu wtryskiwania, aż w końcu wypełni szklaną pipetę. Przepchnij cały olej przez system wtryskiwania, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z kanału. Jeśli w strzykawce wypełniającej kończy się olej mineralny, powoli wycofuj igłę, jednocześnie stale dozując olej, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Ponownie napełnij strzykawkę przygotowawczą i powtórz wtryskiwanie.</li>
<li>Gdy cały system zostanie wypełniony olejem mineralnym i będzie pozbawiony pęcherzyków, włóż oryginalny tłok strzykawki Hamilton 10 μL. Wciśnij tłok do końca jego zakresu, aby usunąć nadmiar oleju mineralnego z systemu. Przetrzyj szklaną mikropipetę oraz koniec strzykawki 70% etanolem.</li>
<li>Wycofaj tłok strzykawki do oznaczenia 2 μL na korpusie. Końcówka szklanej mikropipety wypełni się powietrzem, tworząc strefę buforową między olejem mineralnym a cieczą przeznaczoną do wtryskiwania. Korpus pipety można teraz napełnić, umieszczając koniec mikropipety w pożądanym roztworze i wycofując tłok strzykawki Hamilton. Do oka dorosłego szczura nie należy wstrzykiwać więcej niż 4-5 μL roztworu.</li>
</ol>
4. Procedura iniekcji doszklistkowej: globalne celowanie w siatkówkę
<ol>
<li>Gdy zwierzę jest znieczulone i zabezpieczone w aparacie stereotaksycznym (zgodnie z opisem w sekcji 2), należy zastosować krople do oczu Alcaine w celu miejscowego znieczulenia rogówki. Otwórz powieki palcami i nanieś jedną kroplę roztworu znieczulającego na powierzchnię rogówki.</li>
<li>Do wykonania iniekcji potrzebne są dwie osoby: jedna do wprowadzenia szklanej pipety do komory ciała szklistego i utrzymania jej pozycji oraz druga do naciśnięcia tłoka strzykawki, która dostarcza wymagany roztwór.</li>
<li>Pod mikroskopem chirurgicznym chwyć palcami szklaną mikropipetę oraz szklany łącznik Dual RN. Rozsuń powieki palcami wolnej ręki, tworząc kształt litery „V” po przeciwnej stronie miejsca iniekcji. Dzięki zastosowaniu trakcji powiek oko zostanie uniesione z oczodołu, odsłaniając powierzchnię tylną za limbusowi. Utworzenie kształtu „V” palcami po przeciwnej stronie miejsca wstrzyknięcia tworzy podporę dla oka, zapewniając stabilność podczas iniekcji.</li>
<li>Ostrożnie wprowadź końcówkę szklanej mikropipety przez spojówkę, w obszarze pozbawionym naczyń krwionośnych, a następnie przez twardówkę, pod kątem skierowanym w dół. Podczas przebijania twardówki przez pipetę powinno być wyczuwalne lekkie „kliknięcie”. Wprowadzenie pipety pod lekkim kątem w dół zmniejsza ryzyko uszkodzenia soczewki podczas wprowadzania igły.</li>
<li>Osoba trzymająca strzykawkę powinna teraz wstrzyknąć 4 μL roztworu, naciskając tłok do oznaczenia 2 μL na strzykawce. Cała iniekcja powinna trwać około jednej do dwóch sekund. Wstrzykiwanie w bardzo powolnym tempie &gt;3 sekundy ogranicza początkowe rozprzestrzenianie się roztworu w komorze ciała szklistego. Pod mikroskopem będzie można zaobserwować przepływ wstrzykniętego roztworu przez ciało szkliste, co potwierdzi powodzenie procedury.</li>
<li>Utrzymaj mikropipetę w bezruchu przez około 5 sekund, a następnie wycofaj ją w tym samym kierunku, w którym została wprowadzona. Spojówka powróci na miejsce nad niewielkim otworem, pomagając uszczelnić nakłucie twardówki.</li>
<li>Pokryj powierzchnię rogówki okulistyczną maścią do oczu (Tears Naturale P.M.), aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas rekonwalescencji, a następnie przenieś zwierzę do klatki pooperacyjnej.</li>
<li>Leki przeciwbólowe po zabiegu powinny być podawane zgodnie z wytycznymi organów ds. opieki nad zwierzętami, a zwierzęta powinny być uważnie monitorowane po operacji.</li>
</ol>
5. Selektywne targetowanie komórek zwojowych siatkówki z kikuta nerwu wzrokowego
<ol>
<li>Podawanie znaczników, leków, plazmidów, siRNA lub wektorów wirusowych do kikuta nerwu wzrokowego po aksonotomii pozwala na bezpośrednie targetowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez transport retrogradacyjny. Procedurę tę realizuje się poprzez uprzednie przeprowadzenie przecięcia nerwu wzrokowego zgodnie z „Protokołem przecięcia nerwu wzrokowego”22.</li>
<li>Istnieją dwie główne metody wykonania tej procedury: z użyciem gąbki żelatynowej (gelfoam) lub poprzez bezpośrednią iniekcję do nerwu wzrokowego.</li>
<li>Metoda z gąbką żelatynową jest podobna do znakowania retrogradacyjnego; jednak przy podawaniu substancji eksperymentalnych do nerwu wzrokowego zaleca się uprzednie znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez iniekcję znaczników retrogradacyjnych do wzgórza górnego na 1 tydzień przed aksonotomią. Jest to istotne dla śledzenia komórek, ponieważ w niektórych przypadkach znaczniki neuronalne mogą zakłócać transport retrogradacyjny substancji eksperymentalnych lub odwrotnie.</li>
<li>Bezpośrednio po przecięciu nerwu wzrokowego na przekrojony kikut nerwu kładzie się niewielki kawałek gąbki żelatynowej nasączonej roztworem eksperymentalnym. Następnie zawartość oczodołu przywraca się na miejsce. Podczas przywracania oka do pozycji neutralnej należy użyć pęsety, aby docisnąć kawałek gąbki żelatynowej do oczodołu, upewniając się, że pozostaje ona na końcu nerwu wzrokowego.</li>
<li>Technika iniekcyjna jest bardziej skuteczna w przypadku podawania substancji, które muszą dostać się do cytoplazmy aksonu, aby zostać przetransportowane retrogradacyjnie przez przepływ aksoplazmatyczny. Dotyczy to siRNA i plazmidów, a w niektórych przypadkach także wektorów wirusowych. Do wstrzyknięcia pożądanego roztworu do przekrojonego nerwu wzrokowego używa się strzykawki Hamiltona o objętości 5-10 μL.</li>
<li>Brzeg nerwu wzrokowego należy uchwycić precyzyjną pęsetą Dumont. Końcówkę igły wprowadza się do nerwu wzrokowego równolegle do nerwu, aż do momentu, gdy ścięcie igły przestanie być widoczne. Wprowadzona igła zostanie całkowicie otoczona przez nerw. Zaleca się stosowanie igieł z krótkim ścięciem.</li>
<li>Po wprowadzeniu igły do nerwu należy delikatnie ścisnąć boki nerwu precyzyjną pęsetą i wstrzyknąć jedną czwartą roztworu, obracając strzykawkę o jedną czwartą obrotu zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.</li>
<li>Należy powtarzać krok 5.7 aż do wykonania pełnego obrotu igły i wstrzyknięcia całej zawartości strzykawki. Dla uzyskania najlepszych wyników należy wstrzyknąć łącznie 10 μL roztworu, używając szczelnej strzykawki Hamiltona o objętości 10 μL.</li>
<li>Należy usunąć końcówkę strzykawki z nerwu. Nadmiar wstrzykniętego płynu, który cofnął się z nerwu, pozostawia się w oczodole, ponieważ stworzy on dodatkowy rezerwuar umożliwiający pobranie substancji przez końce aksonów.</li>
<li>Zawartość oczodołu przywraca się do pierwotnej pozycji, zamyka ranę i pozwala zwierzęciu na rekonwalescencję.</li>
<li>Leki przeciwbólowe pooperacyjne należy podawać zgodnie z wytycznymi właściwych organów ds. opieki nad zwierzętami, a stan zwierząt po operacji należy uważnie monitorować.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Iniekcje wewnątrzgałkowe celują globalnie we wszystkie komórki siatkówki i sprawdzają się w dostarczaniu substancji do uszkodzonych RGC, ponieważ komórki zwojowe znajdują się w najwewnętrznej warstwie neuronalnej siatkówki, sąsiadując z komorą ciała szklistego. RGC można również celować bezpośrednio, dostarczając substancje do przeciętego kikuta nerwu wzrokowego. RGC oznakowane wstecznie Fluorogold można celować za pomocą peptydów, leków, wektorów, plazmidów lub siRNA z poziomu kikuta nerwu, jak zilustrowano na Rysunku 1. Rysunek 1A-C pokazuje lokalizację peptydu znakowanego Cy3 w somatach RGC, które zostały uprzednio oznakowane poprzez wstrzyknięcie Fluorogold do wzgórza górnego. Peptydy znakowane Cy3 wstrzyknięto do nerwu wzrokowego bezpośrednio po aksonotomii, a siatkówkę obrazowano na żywo, aby zapobiec wypłukiwaniu peptydów z tkanki podczas fiksacji. Rysunek 1D-F przedstawia lokalizację siRNA znakowanych Cy3 oraz znacznika wstecznego Fluorogold w aksonotomizowanych RGC. siRNA znakowane Cy3 wstrzyknięto do kikuta nerwu wzrokowego bezpośrednio po aksonotomii, a następnie wykonano obrazowanie żywej siatkówki.
<img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające ekspresję białek komórkowych z zastosowaniem markerów zielonych i czerwonych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Mikrografie epifluorescencyjne komórek zwojowych siatkówki (RGC) w preparatach siatkówki rozłożonych na płasko (flatmount) 1 dzień po aksonotomii i wstrzyknięciu do kikutu nerwu wzrokowego znakowanych peptydów lub siRNAs. (A) Retrogradne znakowanie Fluorogold w aksonotomizowanych RGC 1 dzień po aksonotomii. (B) Fluorescencja Cy3 w RGC po transporcie retrogradnym znakowanych peptydów, 1 dzień po aksonotomii i wstrzyknięciu peptydów do nerwu wzrokowego. (C) Nałożenie obrazów (A) i (B) wykazujące selektywną lokalizację znakowanych Cy3 peptydów w RGC znakowanych Fluorogold. (D-F) Ciała komórkowe RGC znakowanych Fluorogold (D) są również wypełnione znakowanymi Cy3 siRNAs (E), wstrzykniętymi do kikutu nerwu wzrokowego 24 godziny wcześniej, co pokazano nałożonym obrazie (F). Pasek skali na A-C wynosi 50 μmPasek skali na zdjęciach D-F wynosi 20 μm.

<ol><li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li>
<li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development%2C+survival%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li>
<li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons%3A+where+have+they+gone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li>
<li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Restor.+Neurol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li>
<li>Arai-Gaun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1+induced+in+muller+cells+plays+a+protective+role+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1 induced in muller cells plays a protective role in retinal ischemia-reperfusion injury in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 4226-4232 (2004).</li>
<li>Bainbridge, J. W., Tan, M. H., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: the eye.</a> Gene Ther. 13, 1191-1197 (2006).</li>
<li>Polo, A. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+delivery+of+brain-derived+neurotrophic+factor+by+adenovirus-infected+Muller+cells+temporarily+rescues+injured+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3978-3983 (1998).</li>
<li>Herard, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+targeted+against+amyloid+precursor+protein+impairs+synaptic+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">siRNA targeted against amyloid precursor protein impairs synaptic activity in vivo.</a> Neurobiol Aging. 27, 1740-1750 (2006).</li>
<li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upregulation+of+GLAST-1+is+an+indirect+antiapoptotic+mechanism+of+GDNF+and+neurturin+in+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The upregulation of GLAST-1 is an indirect antiapoptotic mechanism of GDNF and neurturin in the adult CNS.</a> Cell Death Differ. 15, 471-483 (2008).</li>
<li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10%2C+interleukin-4%2C+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li>
<li>Naik, R., Mukhopadhyay, A., Ganguli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+the+retina%3A+focus+on+non-viral+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to the retina: focus on non-viral approaches.</a> Drug Discov Today. 14, 306-315 (2009).</li>
<li>van Adel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+via+lentiviral-mediated+transfer+protects+axotomized+retinal+ganglion+cells+for+an+extended+period+of+time%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time.</a> Hum Gene Ther. 14, 103-115 (2003).</li>
<li>Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+and+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors and the retina.</a> Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).</li>
<li>Allocca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+transfer+for+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene transfer for retinal diseases.</a> Expert Opin Biol Ther. 6, 1279-1294 (2006).</li>
<li>Surace, E. M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+AAV+vectors+for+retinal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer.</a> Vision Res. 48, 353-359 (2008).</li>
<li>Garcia-Valenzuela, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon-mediated+gene+transfer+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo.</a> J Neurobiol. 32, 111-122 (1997).</li>
<li>Koeberle, P. D., Wang, Y., Schlichter, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.1+and+Kv1.3+channels+contribute+to+the+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+after+optic+nerve+transection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo.</a> Cell Death Differ. 17, 134-144 (2010).</li>
<li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump%3A+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li>
<li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li>
<li>Leon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+injury+stimulates+axon+regeneration+in+the+mature+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve.</a> J Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).</li>
<li>Mansour-Robaey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ocular+injury+and+administration+of+brain-derived+neurotrophic+factor+on+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 1632-1636 (1994).</li>
<li>D'Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+Nerve+Transection%3A+A+Model+of+Adult%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optic Nerve Transection: A Model of Adult.</a> J Vis Exp. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przecięcie nerwu wzrokowego jest wysoce powtarzalnym modelem apoptozy neuronów dorosłego OUN. Manipulacje eksperymentalne przedstawione w niniejszej pracy umożliwiają badanie mechanizmów apoptozy RGC po urazie.
Iniekcje doszklne są przydatne do ogólnego targetowania siatkówki. Procedura ta wymaga wprawy, ponieważ krytyczne jest uniknięcie uszkodzenia soczewki końcówką szklanej pipety. Wykazano, że uszkodzenie soczewki powoduje uwalnianie czynników wzrostu, co zmienia przeżywalność i regeneracj...

A correction to the article Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS was made.

Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

<table><tbody><tr><td>Stereotaktyczna rama chirurgiczna</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maska gazowa dla szczurów</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krople do oczu Alcaine</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona 10 &amp;mu;l (1701RN; 26s/2&amp;#8221;/2)</td><td>Hamilton Co</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Złączki zaciskowe 1/16 cala</td><td>Hamilton Co</td><td>55751-01</td><td></td></tr><tr><td>Tubing PEEK, średnica zewnętrzna 1/16 cala, średnica wewnętrzna 0,010 cala</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z226661</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny szklany łącznik RN</td><td>Hamilton Co</td><td>55752-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania olejem mineralnym: zawiera strzykawkę, igły, septa gumowe</td><td>Hamilton Co</td><td>PRMKIT</td><td></td></tr></tbody></table>

metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Komórki zwojowe siatkówki (RGCs) to neurony OUN, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. Do nerwu wzrokowego można uzyskać dostęp w obrębie oczodołu i całkowicie go przeciąć (przeprowadzić aksotomizację), co powoduje przerwanie aksonów całej populacji RGCs. Przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptycznej śmierci komórek neuronalnych w dorosłym OUN 1-4. Model ten jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ komora ciała szklistego oka pełni funkcję kapsuły do dostarczania leków do siatkówki, umożliwiając manipulacje eksperymentalne poprzez wstrzyknięcia doszkliste. Dyfuzja substancji chemicznych przez ciało szkliste zapewnia ich działanie na całą populację RGCs. Do komory ciała szklistego można również wprowadzić wektory wirusowe, plazmidy lub krótkie interferujące RNA (siRNAs) w celu zainfekowania lub transfekcji komórek siatkówki 5-12. Wysoki tropizm wektorów wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) jest korzystny w celowaniu w RGCs, przy współczynniku infekcji sięgającym 90% komórek w pobliżu miejsca wstrzyknięcia 6, 7, 13-15. Ponadto RGCs mogą być selektywnie transfekowane poprzez aplikację siRNAs, plazmidów lub wektorów wirusowych na przecięty koniec nerwu wzrokowego 16-19 lub wstrzykiwanie wektorów do ich celu w wzgórzu górnym 10. Pozwala to badaczom na studiowanie mechanizmów apoptozy w uszkodzonej populacji neuronów bez zakłócających efektów na inne neurony postronne lub otaczającą gleję. Apoptoza RGCs ma charakterystyczny przebieg czasowy, w którym śmierć komórek jest opóźniona o 3-4 dni po aksotomii, po czym następuje szybka degeneracja komórek. Stwarza to okno czasowe dla manipulacji eksperymentalnych skierowanych przeciwko szlakom zaangażowanym w apoptozę. Manipulacje bezpośrednio celujące w RGCs z przeciętego kikutu nerwu wzrokowego wykonuje się w momencie aksotomii, bezpośrednio po przecięciu nerwu. W przeciwieństwie do tego, gdy substancje są dostarczane drogą doszklistą, mogą być one wstrzykiwane przed operacją lub w ciągu pierwszych 3 dni po operacji, poprzedzając rozpoczęcie apoptozy w aksotomizowanych RGCs. W niniejszym artykule prezentujemy kilka metod manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego.

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Model ten jest idealny do przeprowadzania szeregu manipulacji eksperymentalnych, które oddziałują na siatkówkę w sposób globalny lub są skierowane bezpośrednio do uszkodzonej populacji neuronów komórek zwojowych siatkówki.

Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są neuronami ośrodkowego układu nerwowego, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. Nerw wzrokowy może być...

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) to neurony ośrodkowego układu nerwowego, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. W towarzyszącym filmie zaprezentowano metodę eksodonizacji, czyli przecinania aksonów całej populacji RGC, jako model apoptycznej śmierci komórek nerwowych w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym. W niniejszym materiale metoda ta została połączona z procedurami bezpośredniego dostarczania czynników neurotroficznych, krótkich interferujących RNA, plazmidów lub wektorów wirusowych kodujących białka anty-ATO do uszkodzonych komórek zwojowych siatkówki lub do siatkówki w celu oddziaływania na nią w sposób globalny.Aparat do iniekcji wewnątrzgałkowych zostaje zmontowany i wykorzystany do wstrzykiwania substancji do komory ciała szklistego oka w celu ukierunkowanego oddziaływania na komórki zwojowe siatkówki. Do wstrzykiwania substancji do nerwu wzrokowego stosuje się Gelfoam lub strzykawki Hamiltona. Wyniki obrazowania kikuta wskazują, że przeżywalność komórek zwojowych siatkówki może zostać zwiększona poprzez podanie czynników antyapoptotycznych.Wykorzystując te techniki, niniejszą metodę można zastosować do identyfikacji

methods-for-experimental-manipulations-after-optic-nerve-transection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody doświadczalnych manipulacji po przecięciu nerwu wzrokowego w OUN ssaków

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Dziewięćdziesiąt procent komórek zwojowych siatkówki (RGCs), których aksony zostały całkowicie przecięte (aksotomia), obumiera w ciągu 14 dni po aksotomii. Model ten jest łatwy do manipulacji eksperymentalnych i wykazuje wysoką powtarzalność.

Przecięcie nerwu wzrokowego: Model apoptozy neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym

Niniejszy protokół przedstawia sposób wstecznego znakowania komórek zwojowych siatkówki oraz późniejsze wywołanie urazu poprzez zmiażdżenie nerwu wzrokowego w celu analizy przeżywalności i apoptozy komórek zwojowych siatkówki. Jest to eksperymentalny model choroby dla różnych typów neuropatii nerwu wzrokowego, w tym jaskry.

Mysi model urazu zmiażdżeniowego nerwu wzrokowego do badania przeżywalności komórek zwojowych siatkówki

Ten film demonstruje rejestrację aktywności neuronalnej mózgu przez okno optyczne u myszy transgenicznych. Myszy wyrażają białko fluorescencyjne, które umożliwia wykrywanie aktywności neuronalnej. Niewielka część czaszki jest ostrożnie usuwana w celu zainstalowania okna optycznego, a następnie czaszka jest pokrywana czarnym cementem, aby zablokować światło przed obrazowaniem.

Instalacja okien optycznych w mózgu myszy transgenicznych w celu zobrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznego dostępu do nerwu wzrokowego u znieczulonego zwierzęcia i precyzyjnego dostarczania lizolecytyny w celu wywołania ogniskowej demielinizacji, tworząc warunki neuropatologiczne do dalszych badań.

Indukowanie miejscowej demielinizacji w nerwie wzrokowym za pomocą lizolecytyny

Bezpośrednia iniekcja do nerwu wzrokowego szczura jest przydatna do badań regeneracyjnych. Demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę bezpośredniego wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura, która nie wymaga otwierania czaszki. Dzięki tej metodzie powikłania chirurgiczne są zminimalizowane, a powrót do zdrowia jest szybszy.

Minimalnie inwazyjna technika wstrzykiwania do nerwu wzrokowego szczura

Ogniskowa demienizacja jest indukowana w nerwie wzrokowym za pomocą mikroiniekcji lizolecytyny. Wzrokowe potencjały wywołane są rejestrowane za pomocą elektrod czaszkowych wszczepionych w korę wzrokową w celu zbadania przewodzenia sygnału wzdłuż szlaku wzrokowego in vivo. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne leżące u podstaw implantacji elektrod i mikroiniekcji nerwu wzrokowego.

Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

Wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) występuje często w jaskrze. W pracy opisano innowacyjne podejście operacyjne do częściowej transsekcji nerwu wzrokowego. Zastosowanie tego oszczędzającego miejsce podejścia operacyjnego rozszerza zakres zastosowań modelu i umożliwia eksplorację mechanizmów wtórnych uszkodzeń w RGC w nowy sposób.

Częściowa transsekcja nerwu wzrokowego u szczurów: model ustalony z nowym podejściem operacyjnym do oceny wtórnego zwyrodnienia komórek zwojowych siatkówki

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Ten artykuł przedstawia szczegółowe instrukcje dotyczące wykonywania zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika przy użyciu standardowych technik chirurgii okulistycznej.

Chirurgiczne podejście do zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika

Ten protokół opisuje unikalną technikę wykorzystującą podejście przezspojówkowe do dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu wykonania zastrzyków.

Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

Poznaj metody manipulacji komórkami zwojowymi siatkówki po przecięciu nerwu wzrokowego u ssaków. Techniki te pozwalają badać mechanizmy apoptozy neuronów dorosłego OUN i testować czynniki przeciwapoptotyczne.

Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Przeglądaj więcej filmów