Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) to neurony ośrodkowego układu nerwowego, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. W towarzyszącym filmie zaprezentowano metodę eksodomizacji, czyli przecinania aksonów całej populacji RGC, jako model apoptycznej śmierci komórek nerwowych w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym. W niniejszym opracowaniu metoda ta została połączona z procedurami bezpośredniego dostarczania czynników neurotroficznych, krótkich interferujących RNA, plazmidów lub wektorów wirusowych kodujących białka antyapoptotyczne do uszkodzonych komórek zwojowych siatkówki lub do siatkówki w celu oddziaływania na nią w sposób globalny.

Aparat do iniekcji wewnątrzgałkowych zostaje zmontowany i wykorzystany do wstrzykiwania substancji do komory ciała szklistego oka w celu specyficznego ukierunkowania na komórki zwojowe siatkówki. Do wstrzykiwania substancji do nerwu wzrokowego stosuje się albo Gelfoam, albo strzykawki Hamiltona. Wyniki obrazowania kikuta wskazują, że przeżywalność komórek zwojowych siatkówki może zostać zwiększona poprzez podanie czynników antyapoptotycznych.

Wykorzystując te techniki, metoda ta może zostać użyta do identyfikacji białek biorących udział w apoptozie neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę chorób ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptozy neuronalnej w dorosłym OUN. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mają trudności z powodu uszkodzenia soczewki podczas wprowadzania szklanej pipety do komory ciała szklistego oka. Aby przygotować system strzykawkowy do iniekcji wewnątrzgałkowych, należy zacząć od usunięcia igły lub nakrętki RN.

Przygotuj strzykawkę Hamiltona 10 µL RN Gast Tight 1701. Włóż pierścień PFA do gniazda pierścienia w złączce ściskowej. Następnie wsuń całą złączkę do końca strzykawki i lekko przykręć nakrętkę RN od góry.

Wprowadź jeden koniec rurki PEEK o średnicy 1/16 cala do złączki ściskaniej przez otwór w nakrętce RN. Upewnij się, że rurka PEEK jest całkowicie osadzona. Dokręć nakrętkę RN, aby ścisnąć pierścień zaciskowy, co zapewni szczelność rurki PEEK.

Powtórz ten proces na obu końcach szklanego łącznika podwójnego RN. Przymocuj wolny koniec rurki szczytowej do jednego końca szklanego łącznika podwójnego RN, dokręcając nakrętkę RN. Szklana mikropipeta będzie stanowić igłę i cylinder układu wtryskowego.

Wprowadź szklaną pipetę do wolnego końca szklanego łącznika RN. Dokręć nakrętkę RN, aby unieruchomić pipetę. Pod mikroskopem stereoskopowym uformuj końcówkę o odpowiedniej średnicy, trzymając wyciągniętą mikro-pipetę pod kątem i pocierając jej końcówkę o matową powierzchnię szkiełka przedmiotowego, aby doprowadzić do pęknięcia.

W idealnym przypadku końcówka powinna być lekko ścięta. Następnie, używając zestawu do płukania firmy Hamilton Syringe Company, należy napełnić strzykawkę, łącznik rurek (peak tubing linker), szklaną złączkę podwójną RN oraz szklaną mikropipetę olejem mineralnym w celu przygotowania do użycia. W systemie wtrysku hydraulicznego należy wymienić igłę na igłę Hamilton 9 0 0 3 0.

Następnie na igłę Hamilton 9 0 0 3 0 nałóż gumową przegrodę, aby zapewnić szczelność podczas wstrzykiwania oleju mineralnego. Wprowadź igłę Hamilton 9 0 0 3 0 strzykawki do odpowietrzania w tylną część cylindra strzykawki Hamilton 10 µL systemu wtryskowego. Mocno dociśnij przegrodę do końca strzykawki, aby stworzyć uszczelnienie.

Powoli naciśnij tłok, aby olej mineralny przepłynął przez szklane elementy systemu iniekcyjnego, wypełniając szklaną pipetę. Przepchnij cały olej przez system iniekcyjny, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza wzdłuż całego toru.

Jeśli olej mineralny w strzykawce do napełniania kończy się, powoli wycofuj igłę, stale dozując olej. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, ponownie napełnij strzykawkę do odpowietrzania i powtórz iniekcję. Gdy cały system zostanie wypełniony olejem mineralnym, włóż oryginalny tłok strzykawki 10 µL.

W strzykawce Hamiltona całkowicie dociśnij tłok, aby usunąć nadmiar oleju mineralnego z układu. Przetrzyj do czysta szklaną mikropipetę oraz koniec strzykawki. Za pomocą 70% etanolu wycofaj tłok do oznaczenia 2 µL na cylindrze.

Koniec szklanej mikropipety wypełni się powietrzem, co stworzy strefę buforową między olejem mineralnym a płynem przeznaczonym do wstrzyknięcia. Napełnij korpus pipety, umieszczając koniec mikropipety w odpowiednim roztworze i wycofując tłok strzykawki Hamiltona. W celu wykonania iniekcji wewnątrzgałkowej do oka dorosłego szczura wstrzykuje się nie więcej niż 4–5 µL roztworu.

Zacznij od przełączenia przepływu gazu na przyłącze maski gazowej ramy stereotaktycznej. Następnie umieść szczura znieczulonego izofluranem w aparacie stereotaktycznym. Obniż stężenie izofluranu do 2% i monitoruj znieczulenie.

Przykryj zwierzę kocem chirurgicznym. Aby utrzymać temperaturę ciała podczas całej operacji, otwórz powieki i podaj jedną kroplę roztworu anestetyka. Iniekcja na powierzchnię rogówki wymaga udziału dwóch osób, z czego jedna musi wprowadzić pipetę szklaną do komory ciała szklistego i utrzymać jej pozycję.

Kolejną ręką należy nacisnąć tłok strzykawki, aby podać odpowiedni roztwór. Pod mikroskopem chirurgicznym chwyć szklaną mikropipetę oraz podwójną szklaną złączkę RN, następnie rozszerz powieki, tworząc kształt litery V naprzeciwko miejsca wstrzyknięcia. Przy pomocy palców oko zostanie wyniesione z oczodołu. Delikatnie wprowadź końcówkę szklanej mikropipety w obszarze pozbawionym naczyń krwionośnych, przez twardówkę, pod kątem skierowanym w dół.

W momencie przebicia twardówki pipetą wyczuwalne będzie lekkie kliknięcie. Osoba trzymająca strzykawkę powinna teraz wstrzyknąć 4 µL roztworu, naciskając tłok do oznacznika 2 µL na strzykawce. Iniekcja powinna trwać od jednej do dwóch sekund.

Po pomyślnym wstrzyknięciu roztwór zostanie przepłukany przez komorę ciała szklistego; należy utrzymać mikro pipetę w bezruchu przez około pięć sekund, a następnie wycofać ją w tym samym kierunku, w którym wprowadzano igłę. Spowoduje to powrót spojówki nad niewielki otwór, co pomoże uszczelnić nakłucie twardówki. Po zakończeniu zabiegu należy wyłączyć izofluran i pozwolić zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut. Aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas rekonwalescencji, należy pokryć jej powierzchnię maścią okulistyczną, a następnie wyjąć zwierzę z urządzenia stereotaktycznego i przenieść je do klatki regeneracyjnej.

W celu manipulacji komórkami zwojowymi siatkówki poprzez transport retrogradny po wykonaniu ekotomii. Najpierw należy przeprowadzić przecięcie nerwu wzrokowego zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym filmie dotyczącym protokołu przecinania nerwu wzrokowego, 2, 2 4, 1 markerów i leków. Plasmidy, siRNA lub wektory wirusowe można podać do kikuta nerwu wzrokowego.

Istnieją dwie główne metody wykonania tej procedury: z użyciem gąbki żelowej (gel foam) lub poprzez bezpośrednią iniekcję do nerwu wzrokowego. W przypadku zastosowania metody z gąbką żelową należy upewnić się, że komórki zwojowe siatkówki zostały wcześniej oznakowane poprzez wstrzyknięcie tracerów retrogradowych do wzgórza górnego na tydzień przed taksonomią. Bezpośrednio po przecięciu nerwu wzrokowego należy umieścić niewielki fragment gąbki żelowej nasączonej roztworem eksperymentalnym na przekrojonym kikutie nerwu wzrokowego, a następnie przywrócić zawartość oczodołu na poprzednie miejsce.

Po przywróceniu oka do pozycji neutralnej, należy za pomocą pęsety docisnąć kawałek gąbki żelowej do oczodołu, upewniając się, że pozostaje ona nad końcem nerwu wzrokowego. Technika wstrzykiwania jest bardziej skuteczna w przypadku podawania substancji, które muszą przedostać się do cytoplazmy aksonu, aby zostać przetransportowane wstecznie przez przepływ cytoplazmatyczny. Do wstrzyknięcia pożądanego roztworu do przeciętego nerwu wzrokowego używa się szczelnej strzykawki Hamiltona o objętości 10 µL. Zaleca się stosowanie igły z krótkim skosem.

Napełnij strzykawkę 10 µL roztworu przeznaczonego do wstrzyknięcia (zazwyczaj plazmidów irna lub wektorów wirusowych). Chwyć krawędź nerwu wzrokowego za pomocą pęsety Dumont z cienkimi końcówkami. Wprowadź końcówkę igły do nerwu wzrokowego, równolegle do nerwu.

Do momentu, aż skos przestanie być widoczny, wprowadzona igła zostanie z każdej strony otoczona przez nerw. Po wprowadzeniu igły delikatnie ściśnij boki nerwu za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami i wstrzyknij jedną czwartą roztworu, obracając strzykawką. Obrót o jedną czwartą w prawo lub w lewo.

Powtarzaj te kroki do momentu wykonania pełnego obrotu igły i wstrzyknięcia całej zawartości strzykawki. Wyjmij końcówkę strzykawki z nerwu. Pozostaw w obrębie oczodołu wszelki wstrzyknięty płyn, który cofnął się z nerwu, ponieważ utworzy on dodatkowy zbiornik umożliwiający wchłanianie przez końce aksonów.

Przywróć zawartość oczodołu na jej oryginalne miejsce, zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie. Po operacji zwierzęta powinny być utrzymywane w osobnych klatkach. Leki przeciwbólowe po operacji należy podawać zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami w Twojej jednostce.

Po zabiegu chirurgicznym należy uważnie monitorować stan zwierząt. Jak pokazano w tym filmie, do komórek zwojowych siatkówki (RGC) można dotrzeć bezpośrednio, dostarczając peptydy, leki, wektory, plazmidy lub siRNA do przekrojonego kikut nerwu wzrokowego. W tym reprezentatywnym przykładzie przeprowadzono wsteczne znakowanie fluoro gold, a następnie natychmiast wstrzyknięto do nerwu wzrokowego peptydy znakowane SI three.

Następnie przeprowadzono obrazowanie siatkówki na żywo, aby zapobiec wymywaniu peptydów z tkanki podczas utrwalania; jak widać tutaj, trzy znakowane peptydy wstrzyknięte do nerwu wzrokowego zostały przetransportowane wstecznie do ciał komórek RGC w siatkówce. W tym przykładzie do kikuta nerwu wzrokowego wstrzyknięto trzy znakowane siRNA. Bezpośrednio po takotomii ponownie wykonano obrazowanie siatkówki na żywo; trzy znakowane siRNA wstrzyknięte do nerwu wzrokowego zostały przetransportowane wstecznie przez RGC, co potwierdza ich kolokalizacja.

W przypadku wstecznego znakowania FluoroGold, po opanowaniu techniki, może ona zostać wykonana w ciągu kilku sekund, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy uważać, aby nie uszkodzić soczewki. Należy pamiętać, że praca z cząstkami wirusowymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać instytucjonalnych wytycznych dotyczących pracy z materiałami biologicznymi wysokiego ryzyka.