Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w OUN ssaków

Komórki zwojowe siatkówki lub RG cs to neurony ośrodkowego układu nerwowego, które przekazują informacje wizualne z siatkówki do mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. W towarzyszącym filmie zademonstrowano metodę ekssodomizacji lub cięcia aksonów całej populacji RGC jako model apoptotycznej śmierci komórek nerwowych w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym. W tym przypadku metoda ta jest połączona z procedurami, które są bezpośrednio ukierunkowane na czynniki neurotroficzne, krótkie interferujące RNA, plazmidy lub wektory wirusowe, które kodują białka anty ATO do uszkodzonych komórek zwojowych siatkówki lub siatkówki, aby globalnie celować w siatkówkę.

Aparat do wstrzykiwań wewnątrzgałkowych jest montowany i używany do wstrzykiwania substancji do komory ciała szklistego oka, aby specyficznie celować w komórki zwojowe siatkówki. Umieszcza się piankę żelową lub strzykawki Hamilton do wstrzykiwania substancji do nerwu wzrokowego. Wyniki obrazowania kikuta wskazują, że przeżywalność komórek zwojowych siatkówki może być zwiększona poprzez dostarczanie czynników antyapoptotycznych.

Korzystając z tych technik, Metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji białek, które są zaangażowane w apoptozę dorosłych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę choroby ośrodkowego układu nerwowego, ponieważ przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptozy neuronów w dorosłym OUN Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice zmagają się z uszkodzeniem soczewki podczas wkładania szklanej pipety do komory ciała szklistego oka. Aby przygotować system strzykawkowy do wstrzyknięć wewnątrzgałkowych, należy rozpocząć od usunięcia igły lub nakrętki RN.

Obecny na 10-mikrolitrowej strzykawce 1701 Hamilton o pojemności 10 mikrolitrów. Włóż dziki PFA do dzikiego kubka szczytowego złączki zaciskowej. Następnie włóż kompletną złączkę do końca strzykawki i luźno przykręć nakrętkę RN od góry.

Włóż jeden koniec jednej 16-calowej rurki szczytowej do złączki zaciskowej przez otwór w nakrętce RN. Upewnij się, że rurka daszka jest całkowicie osadzona. Dokręć nakrętkę RN, aby ścisnąć dziki, który uszczelni rurkę szczytową.

Powtórz ten proces na obu końcach podwójnej szklanej złączki RN. Przymocuj wolny koniec rurki szczytowej do jednego końca podwójnego łącznika szklanego RN, dokręcając nakrętkę RN. Szklana mikropipeta utworzy igłę i cylinder systemu iniekcyjnego.

Włóż szklaną pipetę do wolnego końca podwójnej szklanej złączki RN. Dokręć nakrętkę RN, aby zamocować pipetę na miejscu. Pod mikroskopem preparacyjnym utwórz końcówkę o odpowiedniej średnicy, trzymając ciągniętą mikropipetę pod kątem i pocierając końcówką wzdłuż szklanego matowienia szkiełka, aby utworzyć przerwę.

Idealnie, ostatnia końcówka powinna być lekko ścięta. Następnie użyj zestawu do zalewania firmy Hamilton Syringe Company wypełnionego strzykawką, łącznikiem rurki szczytowej, podwójnym szklanym łącznikiem RN i szklaną mikropipetą z olejem mineralnym do użycia. W hydraulicznym układzie wtryskowym wymień igłę na igłę Hamilton 9 0 0 3 0.

Następnie umieść gumową przegrodę na igle Hamilton 9 0 0 3 0, aby zapewnić uszczelnienie podczas wstrzykiwania oleju mineralnego. Włożyć igłę Hamilton 9 0 0 3 0 strzykawki do zasysania w tylnej części cylindra 10-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona w układzie wtryskowym. Dociśnij mocno przegrodę do końca strzykawki, aby utworzyć uszczelnienie.

Powoli wciskaj tłok, olej mineralny przejdzie przez szklane elementy układu wtryskowego. Napełnianie szklanej pipety. Przepchnij cały olej przez układ wtryskowy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza wzdłuż drogi.

Jeśli w strzykawce do napełniania zaczyna brakować oleju mineralnego, należy powoli wyjąć igłę, cały czas dozując olej. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza, należy ponownie napełnić strzykawkę zalewową i ponownie wstrzyknąć. Gdy cały układ zostanie napełniony olejem mineralnym, włóż oryginalny tłok 10 mikrolitrów.

Strzykawka Hamilton całkowicie wciska tłok, aby usunąć dodatkowy olej mineralny z układu. Wytrzyj szklaną mikropipetę i końcówkę strzykawki do czysta. Przy 70% etanolu wycofaj tłok do oznaczenia dwóch mikrolitrów na lufie.

Końcówka szklanej mikropipety wypełni się powietrzem, zapewniając strefę buforową między olejem mineralnym a płynem, który ma zostać wstrzyknięty. Napełnij cylinder pipety, umieszczając koniec mikropipety w żądanym roztworze i wyjmując tłok strzykawki Hamiltona. Nie więcej niż cztery do pięciu mikrolitrów roztworu zostanie wstrzyknięte do oka dorosłego szczura w celu wykonania wstrzyknięcia wewnątrzgałkowego.

Zacznij od przełączenia przepływu gazu na nasadkę maski przeciwgazowej dla ramy stereotaktycznej. Następnie umieść znieczulonego fluorem szczura w aparacie stereotaktycznym. Zmniejsz stężenie fluoru do 2% i monitoruj znieczulenie.

Przykryj zwierzę kocem chirurgicznym. Aby utrzymać temperaturę ciała przez cały czas trwania zabiegu, otwórz powieki i umieść jedną kroplę roztworu znieczulającego acan. Na powierzchni rogówki iniekcja wymaga dwóch osób, z których jedna wkłada szklaną pipetę do komory ciała szklistego i utrzymuje pozycję pipety.

I drugi, aby wcisnąć tłok na strzykawce, który dostarcza pożądany roztwór. Pod mikroskopem chirurgicznym chwyć szklaną mikropipetę i podwójną szklaną złączkę RN, rozłóż powieki, tworząc kształt litery V naprzeciwko miejsca wstrzyknięcia Palce uniosą się poza orbitę. Delikatnie przełóż końcówkę szklanej mikropipety przez obszar pozbawiony naczyń krwionośnych i przez twardówkę pod kątem w dół.

Gdy pipeta wniknie w twardówkę, wyczuwalny będzie niewielki trzask. Osoba trzymająca strzykawkę powinna teraz wstrzyknąć cztery mikrolitry roztworu, wciskając tłok do oznaczenia dwóch mikrolitrów na strzykawce. Wstrzyknięcie powinno trwać około jednej do dwóch sekund.

Pomyślnie wstrzyknięty roztwór przepłucze się przez komorę ciała szklistego, przytrzyma mikropipetę nieruchomo przez około pięć sekund, a następnie wycofa się w tym samym kierunku Po wprowadzeniu igły spojówka opadnie z powrotem nad mały otwór, pomagając uszczelnić nakłucie twardówki. Po zakończeniu operacji wyłącz izofluor i pozwól zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut. Pokryj powierzchnię rogówki maścią okulistyczną do oczu Aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas rekonwalescencji, należy wyjąć zwierzę z urządzenia stereotaktycznego i umieścić je z powrotem w klatce ratunkowej.

Manipulowanie komórkami zwojowymi siatkówki poprzez transport wsteczny po ex otomii. Najpierw wykonaj transsekcję nerwu wzrokowego zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole transsekcji nerwu wzrokowego wideo, 2, 2, 4, 1 leki znacznikowe. Plazmidy, siRNA lub wektory wirusowe można nakładać na kikut nerwu wzrokowego.

Istnieją dwie główne metody wykonania tej procedury przy użyciu pianki żelowej lub bezpośredniego wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego. Jeśli stosowana jest metoda pianki żelowej, upewnij się, że komórki zwojowe siatkówki zostały wstępnie znakowane poprzez wstrzyknięcie znaczników wstecznych do górnego wzgórka na tydzień przed taksonomią. Natychmiast po przecięciu nerwu wzrokowego umieszcza się mały kawałek pianki żelowej nasączonej roztworem doświadczalnym na przeciętym kikutu nerwu wzrokowego, a następnie zawartość oczodołu wraca do poprzedniego miejsca.

Kiedy oko powróci do neutralnej pozycji, użyj kleszczy, aby wepchnąć kawałek pianki żelowej w dół do orbity, upewniając się, że pozostaje on nad końcem nerwu wzrokowego. Technika wstrzykiwania jest bardziej skuteczna w dostarczaniu substancji, które muszą uzyskać dostęp do cytoplazmy aksonu, aby mogły być w dużym stopniu transportowane przez op przepływ plazmowy, Szczelna strzykawka Hamiltona o pojemności 10 mikrolitrów służy do wstrzykiwania pożądanego roztworu do przeciętego nerwu wzrokowego. Pożądana jest igła z krótkim skosem.

Umieścić w strzykawce 10 mikrolitrów roztworu, który ma być wstrzyknięty. Zazwyczaj plazmidy irna lub wektory wirusowe do wstrzyknięcia chwytają krawędź nerwu wzrokowego za pomocą kleszczy Dumonta z cienką końcówką. Włóż koniec igły do nerwu wzrokowego, równolegle do nerwu.

Dopóki skos nie będzie już widoczny, wprowadzona igła będzie otoczona ze wszystkich stron nerwem. Po wprowadzeniu igły delikatnie ściśnij boki nerwu kleszczykami z cienką końcówką i wstrzyknij jedną czwartą roztworu, obracając strzykawkę. Jedna czwarta obrotu zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.

Kontynuować powtarzanie tych czynności aż do zakończenia pełnego obrotu igły i wstrzyknięcia całej zawartości strzykawki. Zdjąć końcówkę strzykawki z nerwu. Wstrzyknięty płyn, który ma refluks zwrotny, należy pozostawić w obrębie orbity, ponieważ utworzy to dodatkową pulę do wchłonięcia przez końce aksonów.

Przywróć zawartość oczodołu do pierwotnego położenia, zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie. Po zabiegu zwierzęta powinny być trzymane niezależnie od siebie. Pooperacyjne leki przeciwbólowe powinny być podawane zgodnie z wytycznymi opieki nad zwierzęciem.

Władze i zwierzęta powinny być dokładnie monitorowane po operacji. Jak pokazano w tym filmie, RGC może być bezpośrednio ukierunkowany poprzez dostarczanie peptydów, leków, wektorów, plazmidów lub siRNA do przeciętego kikuta nerwu wzrokowego. W tym reprezentatywnym przykładzie przeprowadzono znakowanie wsteczne fluorozłotem, a trzy peptydy znakowane SI zostały natychmiast wstrzyknięte do nerwu wzrokowego.

Następnie przeprowadzono obrazowanie siatkówki na żywo, aby zapobiec wypłukiwaniu peptydów z tkanki podczas fiksacji, jak widać tutaj, trzy znakowane SI peptydy wstrzyknięte do nerwu wzrokowego były retro, znacznie transportowane z powrotem do somato RGC w siatkówce. W tym przykładzie trzy znakowane SIRNA SI zostały wstrzyknięte do kikuta nerwu wzrokowego. Bezpośrednio po taksonomii i ponownym wykonaniu obrazowania siatkówki na żywo, trzy znakowane SI siRNA wstrzyknięte do nerwu wzrokowego były wsteczne, transportowane przez RG CS, na co wskazuje ich kolokalizacja.

Z etykietowaniem wstecznym fluorgoldu Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu kilku sekund, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy uważać, aby nie uszkodzić soczewki. Nie zapominaj, że praca z cząsteczkami wirusów może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać wytycznych instytucjonalnych dotyczących pracy z zagrożeniami biologicznymi.