Mikroendoskopia światłowodowa o wysokiej rozdzielczości do obrazowania komórkowego in situ

Tradycyjnie badania biologiczne i kliniczne, które wymagają analizy mikroskopowej w rozdzielczości na poziomie komórkowym, przeprowadza się poprzez przeprowadzanie wielu eksperymentów równolegle z pojedynczymi próbkami usuniętymi z badania w sekwencyjnym czasie. Punkty do oceny za pomocą mikroskopii świetlnej, podczas gdy mikroskopia konfokalna, wielofotonowa i druga harmoniczna są przydatnymi technikami obrazowania in situ. Wymagana infrastruktura jest złożona i kosztowna, obejmuje skanujące systemy laserowe i złożone źródła światła. Tutaj pokazujemy, jak zbudować światłowodowy system mikroendoskopowy o wysokiej rozdzielczości w ciągu jednego dnia, używając gotowych komponentów za mniej niż 5 000 USD.

Platforma oferuje elastyczność w zakresie rozdzielczości obrazu, pola widzenia i długości fali roboczej. Po pierwsze, montowana jest prosta rama mikroskopu fluorescencyjnego epi, aby pomieścić źródło światła, soczewki filtrów optycznych, wiązkę światłowodową i kamerę CCD. Następnie instalowane są soczewki obrazujące, które tworzą powiększony obraz wiązki światłowodowej na kamerze CCD.

Następnie instalowane jest źródło LED z optyką oświetleniową w celu dostarczenia fluorescencyjnego światła wzbudzającego do próbki. Wreszcie, dzięki zmontowanemu mikroendoskopowi, obrazowanie w czasie rzeczywistym ujawnia szczegóły na poziomie komórkowym próbek znakowanych fluorescencyjnie, w tym kultur in vitro, modeli zwierzęcych in vivo i ludzi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna lub wielofotonowa, jest to, że jest wystarczająco prosta i niedroga, dzięki czemu naukowcy pracujący w różnych dziedzinach mogą ją szybko wdrożyć i dostosować do swoich konkretnych potrzeb.

Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości należy traktować jako konfigurację bazową z kilkoma możliwymi wariantami montażu i zastosowania. Wybierając komponenty do konkretnego zastosowania, należy wziąć pod uwagę nieodłączne zależności związane z mikroskopią fluorescencyjną między stężeniem fluorolu, oświetleniem fotowybielającym, intensywnością, czułością kamery, wzmocnieniem i czasem ekspozycji. Platforma ta jest przeznaczona do stosowania z pro flawiną jako fluorescencyjnym środkiem kontrastowym, ale może być skonfigurowana do pracy z innymi barwnikami fluorescencyjnymi.

Pro flavin to jasne barwienie jądra o szczytowych długościach fal absorpcji i emisji odpowiednio 445 nanometrów i 515 nanometrów. Stosowanie innych środków kontrastowych będzie wymagało od użytkownika doboru emisji wzbudzenia, a filtry dichroiczne odpowiednio do montażu systemu mikroendoskopu rozpoczną się od połączenia dwóch sześciocalowych prętów klatkowych z dwoma 1,5-calowymi prętami klatkowymi, aby utworzyć parę prętów o długości 7,5 cala. Przykręć pręty do jednej powierzchni składanego lusterka, a następnie zainstaluj lustro o średnicy jednego cala.

Następnie przykręć cztery pręty 0,5 cala w przeciwległą powierzchnię składanego lusterka. Wsuń kostkę klatki na 7.5-calowe pręty klatki przez dwa dolne otwory przelotowe. Wkręć dwucalowe pręty w boczną powierzchnię kostki klatki.

Używając adaptera z mocowaniem C do SM one, przymocuj kamerę do płyty klatki. Zamocuj płytę klatki na 0.5-calowych prętach klatki równo z powierzchnią czołową składanego zespołu lusterka. Wybierz soczewkę tubusu o średnicy jednego cala, aby utworzyć obraz wiązki światłowodu w aparacie.

Ogniskowa obiektywu powinna być tak dobrana, aby przyczyna wiązki światłowodowej była próbkowana przez co najmniej dwa piksele. Po zobrazowaniu w aparacie włóż obiektyw do tubusu obiektywu o długości trzech cali i zabezpiecz obiektyw pierścieniem ustalającym. Klucz płaski jest pomocny do wkręcania pierścieni ustalających w długie tubusy obiektywów.

Wrzuć filtr emisyjny do trzycalowego tubusu obiektywu na pierwszy pierścień ustalający i dodaj kolejny pierścień, aby zamocować filtr na miejscu. Upewnij się, że orientacja filtra jest zgodna z konwencją wskazaną przez producenta filtra. Przykręć tubus obiektywu w bok kostki klatki znajdującej się najbliżej kamery CCD.

Ta pozycja jest również pokazana tutaj. Zwróć uwagę, że na schemacie ten obiektyw i filtr są pokazane bez trzycalowego tubusu obiektywu. Aby uzyskać przejrzystość, podłącz aparat do komputera i view obraz na ekranie.

Skieruj zespół klatki na odległy obiekt i przesuwaj sześcian klatki wzdłuż szyn, aż obraz obiektu będzie ostry. Za pomocą śrubokręta dokręć cztery znajdujące się po bokach kostki klatki. te chwytają szyny po dokręceniu, przytrzymując kostkę na miejscu.

Zapewni to, że soczewki tubusu utworzą ostry obraz wiązki włókien na aparacie w połączeniu z soczewką obiektywową z korekcją nieskończoności. Następnie włóż lusterko diiczne do uchwytu i umieść je pod kątem 45 stopni w kostce klatki. Przykręć soczewkę obiektywu za pomocą adaptera z jednym gwintem RMS do SM i regulowanego tubusu obiektywu w powierzchnię kostki klatki naprzeciwko uchwytu soczewki tubusu.

Następnie wkręć złącze SMA w płytę klatkową i zamontuj je na prętach w przybliżeniu w odległości roboczej soczewki obiektywu. Dodaj płytę podstawy i zaślepkę do otwartych boków kostki klatki. Następnie zamontuj diodę LED na płycie klatki i wsuń ją na koniec dwucalowych prętów.

Dodaj soczewkę do tubusu obiektywu o średnicy 0,5 cala tak, aby po wkręceniu tej rurki w bok sześcianu klatki utworzył obraz diody LED, który wypełnia tylną aperturę soczewki obiektywu. Dodaj również filtr wzbudzenia do tubusu obiektywu. Na tym etapie można zastosować sterownik LED do sterowania natężeniem światła świetlnego za pomocą żywicy epoksydowej.

Podłącz złącze SMA dla światłowodu 1030 mikronów do wiązki światłowodowej o polu widzenia 720 mikronów. Szczegółowe informacje na temat złącza światłowodowego można znaleźć w laboratoriach T Thor, numer części FN dziewięć sześć. Przewodnik po konektorowaniu i polerowaniu światłowodów.

Przykręć wiązkę oczek złącza SMA do gniazda SMA zamontowanego na klatce Pręty kierują dystalny koniec wiązki w kierunku szerokopasmowego źródła światła, wystarczy oświetlenie fluorescencyjne. Następnie obserwuj obraz proksymalnej powierzchni wiązki na kamerze CCD. Na koniec wyreguluj położenie soczewki obiektywu, wkręcając lub wykręcając kostkę klatkową.

Dopóki obraz wiązki włókien nie będzie ostry, indywidualna przyczyna powinna być wyraźnie widoczna. Rozdzielczość przestrzenną mikroendoskopu można zwiększyć, mocując mikrosoczewkę lub zespół soczewek do dystalnej końcówki wiązki włókien. Ta optyka jest skonfigurowana w taki sposób, że zamiast umieszczać końcówkę pęczka bezpośrednio na tkance, końcówka jest obrazowana na powierzchni tkanki z powiększeniem dem.

Zwiększając w ten sposób przestrzenną częstotliwość próbkowania narzuconą przez przyczynę przewodnictwa światła wiązki włókien. Stopień powiększenia odpowiada wzrostowi rozdzielczości przestrzennej i jednocześnie proporcjonalnemu spadkowi pola widzenia. Wybierz soczewkę uśmiechniętą o żądanym powiększeniu i odległości roboczej do swojego zastosowania.

Upewnij się, że średnica soczewki odpowiada średnicy wiązki włókien. Planujesz pracować z. Zamontuj wiązkę światłowodów i soczewkę uśmiechu na oddzielnych trzyosiowych stopniach ręcznego pozycjonowania pod mikroskopem małej mocy lub stereoskopem, aby uzyskać dokładne wyrównanie.

Następnie umieść kroplę kleju optycznego na soczewce lub powierzchni wiązki. Za pomocą pozycjonerów ręcznych zetknij się ze sobą. Wystaw interfejs na działanie światła UV w dawce zalecanej przez producenta do utwardzenia kleju.

Aby chronić soczewkę uśmiechu i klejony interfejs, użyj krótkiego odcinka aluminiowej rurki kapilarnej, aby otoczyć złącze. Nasuń rurkę na złącze i zabezpiecz na miejscu kroplą żywicy epoksydowej na każdym końcu rurki, użyj rurki termokurczliwej, aby zakończyć montaż. Przed wykonaniem mikroendoskopowego obrazowania należy nałożyć środek kontrastowy na komórki lub tkankę, które mają być zobrazowane, aby zobrazować komórki i hodowlę.

Po pierwsze, usuń pożywkę wzrostową za pomocą peppe. Następnie dodaj pro roztwór flawiny, delikatnie pipetując do studzienki. Po krótkiej inkubacji, trwającej do jednej minuty, usunąć roztwór pro flawiny za pomocą peppe i wyrzucić.

Przepłucz komórki, dodając i usuwając świeży roztwór PBS do studni, zamontuj dystalny koniec wiązki włókien w bezpiecznym uchwycie z ręcznym pozycjonowaniem stages na osi x, Y, Z dla stabilności. Podczas obrazowania po nałożeniu barwnika na komórki lub tkankę, umieść wiązkę światłowodu w lekkim kontakcie z próbką. Wyświetl obraz wiązki światłowodowej na ekranie komputera, korzystając z oprogramowania dostarczonego przez producenta kamery lub dowolnego niestandardowego oprogramowania, które możesz chcieć opracować.

Dostosuj ustawienia czasu ekspozycji i wzmocnienia aparatu, aby uzyskać obraz o akceptowalnej jasności. Po prawidłowym zmontowaniu mikroendoskop będzie działał jako mikroskop fluorescencyjny epi przekazywany przez spójną wiązkę światłowodową. W celu uzyskania optymalnych wyników obrazowania należy zwrócić uwagę na spełnienie trzech kluczowych warunków.

Po pierwsze, proksymalna powierzchnia wiązki światłowodów powinna zostać zobrazowana na kamerze CCD bez rozmycia, aby osiągnąć pełną rozdzielczość systemu. Tu. Część wiązki włókien jest obrazowana ze słabą ostrością, lekką ostrością i dobrą ostrością. Optymalna ostrość jest ustalana poprzez regulację rzeczywistego położenia soczewki obiektywu względem powierzchni wiązki.

Po drugie, bliższa powierzchnia wiązki włókien powinna być równomiernie oświetlona na całej jej średnicy. Jak opisano wcześniej, osiąga się to poprzez skonfigurowanie optyki oświetleniowej do oświetlenia coli. Pokazany tutaj obraz został uzyskany, gdy jednolita próbka fluorescencyjna jest oświetlona w tej preferowanej konfiguracji.

Odpowiedni wynik w krytycznym oświetleniu jest pokazany tutaj. Struktura diody LED jest obrazowana na powierzchni wiązki włókien, co powoduje pojawienie się tego niechcianego wzoru nałożonego na prawdziwą strukturę próbki. Po trzecie, ważne jest, aby upewnić się, że zarówno proksymalne, jak i dystalne powierzchnie wiązki włókien powinny być czyste i wolne od zadrapań i odprysków.

W tym przykładzie szczątki obrazu są przymocowane do powierzchni wiązki, a uszkodzenia w postaci małego wióra na godzinie piątej są widoczne na obwodzie światłowodu. Zanieczyszczenia można usunąć z powierzchni wiązki, czyszcząc je w taki sam sposób, jak w przypadku konwencjonalnych złączy światłowodowych za pomocą papieru do soczewek i izopropanolu lub standardowych narzędzi do czyszczenia światłowodów. 1483 komórki oznaczono pro flawiną, a wiązkę gołych włókien lekko umieszczono na próbce.

Obrazowanie in vitro pokazano tutaj, gdy soczewka z grymasem 2,5x została połączona z końcówką wiązki, uzyskano poprawę rozdzielczości przestrzennej i zmniejszenie pola widzenia. Obrazowanie in vivo, w którym wiązka włókien o średnicy zewnętrznej 0,5 milimetra została przepuszczona przez igłę o rozmiarze 21 i przeprowadzona do tkanki tłuszczowej poduszeczki tłuszczowej myszy została przeprowadzona, jak pokazano na tym filmie, adipocyty są wyraźnie widoczne wraz z ruchem spowodowanym cyklem sercowym. W tym przykładzie obrazowanie błony śluzowej jamy ustnej u zdrowego ochotnika przeprowadzono przy użyciu większego wiązki włókien o średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra.

We wszystkich przykładach pokazana pro flawina była używana jako fluorescencyjny środek kontrastowy znakujący jądra. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować i zmontować mikroendoskop światłowodowy do obrazowania fluorescencyjnego komórek i tkanek w C dwóch.