Name: Mikroendoskopia światłowodowa o wysokiej rozdzielczości do obrazowania komórkowego in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Poznaj metodę montażu niedrogiego mikroendoskopu światłowodowego do obrazowania komórkowego in situ. System umożliwia badaczom obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały częściowo sfinansowane przez National Institutes of Health w ramach grantu R01 EB007594, Departament Obrony w ramach Breast Cancer Research Program (wniosek BCO74699P7) oraz fundację Susan G. Komen w ramach grantu 26152/98188972.

1. Montaż mikroendoskopu
Opisany tutaj wysokorozdzielczy mikroendoskop (rycina 1a) należy traktować jako konfigurację bazową, z wieloma możliwymi wariantami montażu i zastosowania. Szczegółowo opisujemy tutaj implementację platformy zaprojektowaną do pracy z proflaviną jako fluorescencyjnym środkiem kontrastowym. Proflavina jest jasnym barwnikiem jąder komórkowych z maksymalnymi długościami fali absorpcji i emisji wynoszącymi odpowiednio 445 nm i 515 nm. Zastosowanie innych środków kontrastowych będzie wymagało od użytkownika odpowiedniego doboru filtrów wzbudzenia, emisji i dichroicznych. Wiele elementów wysokorozdzielczego mikroendoskopu ma charakter ogólny i może być pozyskanych od wielu dostawców. Na przykład optomechaniczne komponenty pozycjonujące są dostępne u dostawców takich jak Thorlabs, Newport czy Linos. Kompaktowe kamery CCD są oferowane przez firmy m.in. Point Grey Research, Prosilica oraz Retiga; czułość kamery należy dobrać, biorąc pod uwagę jasność stosowanego fluoroforu oraz pożądaną liczbę klatek na sekundę. Diody emitujące światło (LED) o wysokiej mocy można nabyć m.in. od Luxeon, Cree i Nichia. Wiązki światłowodowe są dostępne u producentów takich jak Sumitomo, Fujikura i Schott. Przy wyborze komponentów do konkretnej aplikacji użytkownik powinien uwzględnić inherentne zależności występujące w mikroskopii fluorescencyjnej pomiędzy stężeniem fluoroforu, fotoblaknięciem, intensywnością oświetlenia, czułością kamery, wzmocnieniem i czasem ekspozycji.
<ol>
<li>Połącz pręty klatki o długości 6" z prętami o długości 1,5", aby utworzyć parę prętów o długości 7,5". Wkręć te pręty w jedną ściankę modułu lustra załamującego. W przeciwległą ściankę wkręć pręty o długości 0,5". Nasuń kostkę klatki na pręty klatki, korzystając z dwóch dolnych otworów przelotowych. Wkręć pręty o długości 2" w boczną ściankę kostki klatki (rycina 1b).</li>
<li>Przymocuj kamerę do płytki klatki, używając adaptera z mocowania C na SM1. Zabezpiecz płytkę klatki na prętach klatki o długości 0,5", tak aby była zlicowana z powierzchnią modułu lustra załamującego.</li>
<li>Włóż soczewkę tubusową do tubusu soczewki o długości 3" i zabezpiecz soczewkę pierścieniem zaciskowym. Ogniskowa soczewki powinna być dobrana tak, aby rdzenie wiązki światłowodowej były próbkowane przez co najmniej dwa piksele po rzutowaniu na kamerę. Wsuń filtr emisyjny do tubusu na pierwszy pierścień zaciskowy i dodaj kolejny pierścień, aby unieruchomić filtr. Przestrzegaj konwencji orientacji filtra wskazanej przez producenta. Wkręć tubus soczewki w bok kostki klatki najbliżej kamery CCD. Należy zauważyć, że na rycinie 1c soczewka ta oraz filtr są pokazane bez tubusu soczewki 3" dla większej przejrzystości.</li>
<li>Podłącz kamerę do komputera i wyświetl obraz na ekranie. Skieruj zespół klatki na odległy obiekt i przesuwaj kostkę klatki wzdłuż szyn, aż obraz stanie się ostry. Zablokuj kostkę klatki w tej pozycji. (Jest to prosta metoda zapewnienia, że soczewka tubusowa utworzy ostry obraz w połączeniu z obiektywem korygowanym do nieskończoności).</li>
<li>Włóż lustro dichroiczne do uchwytu i umieść je pod kątem 45° w kostce klatki.</li>
<li>Wkręć obiektyw, za pomocą adaptera gwintu z RMS na SM1 oraz regulowanego tubusu soczewki, w ściankę kostki klatki przeciwległą do uchwytu soczewki tubusowej. Zamiast regulowanego tubusu soczewki można zastosować translatory w osi z dla łatwiejszego ostrzenia. Wkręć złącze SMA w płytkę klatki i zamontuj ją na prętach, mniej więcej w odległości roboczej obiektywu.</li>
<li>Zamontuj diodę LED na płytce klatki i nasuń ją na koniec prętów o długości 2". Dodaj soczewkę do tubusu soczewki o średnicy 0,5" w taki sposób, aby po wkręceniu tubusu w bok kostki klatki utworzył on obraz diody LED wypełniający tylną aperturę obiektywu. Ta konfiguracja (oświetlenie Köhlera) zapewni równomierne oświetlenie proksymalnej powierzchni wiązki światłowodowej. Dodaj filtr wzbudzenia do tubusu soczewki 0,5" i zabezpiecz go pierścieniem zaciskowym (rycina 1c).</li>
<li>Przymocuj złącze SMA do wiązki światłowodowej. Wkręć wiązkę ze złączem SMA w gniazdo SMA zamontowane na prętach klatki. Skieruj dystalny koniec wiązki w stronę szerokopasmowego źródła światła (wystarczy oświetlenie fluorescencyjne) i obserwuj obraz proksymalnej powierzchni wiązki na kamerze CCD. Reguluj pozycję obiektywu, wkręcając go lub wykręcając z kostki klatki, aż obraz wiązki światłowodowej stanie się ostry. Pojedyncze rdzenie powinny być wyraźnie widoczne (rycina 2).</li>
</ol>
2. Montaż soczewki GRIN
Rozdzielczość przestrzenną mikroendoskopu można zwiększyć poprzez przymocowanie mikrosoczewki lub układu soczewek do dystalnego końca wiązki włókien. Optyka ta jest skonfigurowana w taki sposób, że zamiast bezpośredniego przykładania końca wiązki do tkanki, obraz końcówki jest rzutowany na powierzchnię tkanki z pomniejszeniem, co zwiększa częstotliwość próbkowania przestrzennego wymuszoną przez rdzenie światłowodowe wiązki. Stopień pomniejszenia odpowiada zwiększeniu rozdzielczości przestrzennej, a jednocześnie proporcjonalnemu zmniejszeniu pola widzenia. Elementy soczewek o gradientowym współczynniku załamania (GRIN) są kompatybilne z włóknami optycznymi i dostępne m.in. w firmach GrinTech, NSG oraz Schott, a także mogą być bezpośrednio łączone z dystalnym końcem wiązki włókien.
<ol>
<li>Wybierz soczewkę GRIN o powiększeniu i odległości roboczej odpowiedniej dla Twojej aplikacji. Upewnij się, że średnica soczewki jest większa niż średnica wiązki światłowodowej, z którą zamierzasz pracować. Zaleca się, aby wiązkę światłowodową i soczewkę GRIN zamontować na osobnych 3-osiowych manualnych pozycjonerach pod mikroskopem o niskim powiększeniu lub stereoskopem, aby zapewnić dokładne wyrównanie przed połączeniem.</li>
<li>Nanieś kroplę kleju optycznego (np. kleju utwardzanego promieniami UV Norland) na powierzchnię soczewki lub wiązki. Doprowadź oba komponenty do kontaktu za pomocą manualnych pozycjonerów. Naświetl miejsce styku światłem UV zgodnie z dawką zalecaną przez producenta.</li>
<li>Aby chronić soczewkę GRIN i miejsce połączenia, można zastosować krótki odcinek aluminiowej rurki kapilarnej (Small Parts Inc.), aby osłonić złącze. Nasuń rurkę na złącze i przymocuj ją za pomocą epoksydy. Do wykończenia zespołu można użyć rurki termokurczliwej.</li>
</ol>
3. Obrazowanie mikroendoskopowe
<ol>
<li>Nanieś środek kontrastowy na komórki lub tkankę przeznaczoną do obrazowania. W przypadku proflawiny (0,01% w/v w PBS), obrazowanie in vitro komórek w kulturze można przeprowadzić poprzez krótką inkubację (&lt; 1 minuty) i dokładne płukanie. Obrazowanie preparatów tkankowych ex vivo lub tkanek in vivo jest możliwe po miejscowym zastosowaniu barwnika. Stwierdzono, że pobieranie proflawiny w tych warunkach jest niemal natychmiastowe, a obrazowanie może być wykonane w ciągu kilku sekund i trwa przez kilka minut.</li>
<li>Umieść wiązkę światłowodową w lekkim kontakcie z obrazowaną próbką. Podczas obrazowania komórek w kulturze lub preparatów tkankowych ex vivo zaleca się zamocowanie dystalnego końca wiązki światłowodowej w stabilnym uchwycie z manualnymi stolikami pozycjonującymi w osiach XYZ, aby zapewnić stabilność podczas obrazowania.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:

Po prawidłowym złożeniu mikroendoskop będzie działać jako mikroskop epifluorescencyjny, z obrazem przesyłanym przez koherentny wiązkę światłowodów. Aby uzyskać optymalne wyniki obrazowania, należy zadbać o spełnienie trzech kluczowych warunków:
<ol>
<li>Proksymalna powierzchnia wiązki światłowodowej powinna zostać odwzorowana na kamerze CCD bez rozogniskowania, aby uzyskać pełną rozdzielczość systemu. Rycina 2a,b,c przedstawia fragment wiązki światłowodowej przy słabej ostrości, lekkim rozogniskowaniu oraz dobrej ostrości, odpowiednio. Optymalny punkt ostrości uzyskuje się poprzez regulację pozycji osiowej obiektywu względem powierzchni wiązki.</li>
<li>Proksymalna powierzchnia wiązki światłowodowej powinna być równomiernie oświetlona w obrębie całej jej średnicy (pola widzenia). Jak opisano w tekście protokołu (1.7), osiąga się to poprzez skonfigurowanie optyki oświetlenia zgodnie z zasadą oświetlenia Köhlera. Rycina 2d przedstawia obraz uzyskany podczas oświetlania jednorodnej próbki fluorescencyjnej w tej zalecanej konfiguracji, natomiast rycina 2e pokazuje odpowiadający jej wynik przy oświetleniu krytycznym. W tym drugim przypadku struktura diody LED jest odwzorowana na powierzchni wiązki światłowodowej, co skutkuje pojawieniem się tego niepożądanego wzoru nałożonego na rzeczywistą strukturę próbki.</li>
<li>Zarówno proksymalna, jak i dystalna powierzchnia wiązki światłowodowej powinny być czyste i wolne od zarysowań oraz odprysków. Rycina 2f obrazuje obecność zanieczyszczeń przylegających do powierzchni wiązki oraz uszkodzenie w postaci małego odprysku na godzinie 5 na obwodzie włókna. Zanieczyszczenia z powierzchni wiązki można usunąć, czyszcząc je w ten sam sposób, co konwencjonalne złącza światłowodowe, używając papieru do soczewek i izopropanolu lub standardowych narzędzi do czyszczenia światłowodów. Jeśli którykolwiek koniec wiązki światłowodowej jest zarysowany lub wyszczerbiony, bądź jeśli wiązka pęknie wzdłuż swojej długości, powierzchnię można wyrównać poprzez szlifowanie standardowymi technikami ręcznymi lub mechanicznymi. Zalecamy papier ścierny o ziarnistości 12-15 μm do wstępnego szlifowania zgrubnego oraz papier 0.5-1.0 μm do końcowego polerowania.</li>
</ol>
Rycina 3a przedstawia obrazowanie 1483 komórek in vitro po znakowaniu proflawiną i lekkim umieszczeniu gołego wiązki włókien na próbce. Rycina 3b obrazuje poprawę rozdzielczości przestrzennej i zmniejszenie pola widzenia dzięki zastosowaniu soczewki GRIN 2,5x przyklejonej do końcówki wiązki. Film 1 przedstawia obrazowanie in vivo tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego w modelu mysim. W tym przypadku wiązka włókien o średnicy zewnętrznej 0,5 mm (pole widzenia 330 μm) została wprowadzona przez igłę 21G i przesunięta w głąb tkanki. Komórki tłuszczowe są wyraźnie widoczne, a ruch wynikający z cyklu pracy serca jest dostrzegalny w tym zapisie przy 15 klatkach na sekundę. Rycina 3c przedstawia obrazowanie błony śluzowej jamy ustnej u zdrowego ochotnika, tym razem z użyciem większej wiązki włókien o średnicy zewnętrznej 1,5 mm (pole widzenia 1,4 mm). We wszystkich pokazanych przykładach proflawina została zastosowana jako fluorescencyjny kontrast do znakowania jąder komórkowych.

 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Układ optyczny ilustrujący obrazowanie tkanki za pomocą wiązki światłowodów; obejmuje LED, lustro dichroiczne, CCD." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Montaż mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości (HRME). (a) Schemat systemu HRME. (b) Montaż głównej optomechanicznej struktury wsporczej. (c) Dodanie elementów optycznych, diody LED do oświetlenia oraz kamery CCD. (d) Fotografia systemu HRME zamkniętego w obudowie o wymiarach 10" x 8" x 2,5".
 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe przedstawiające rozmieszczenie nanostruktur; możliwe wyniki analizy wzoru dyfrakcyjnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Konfiguracja HRME. Przykłady obrazowania za pomocą wiązki światłowodowej przy (a) słabym ostrzeniu, (b) zbliżonym do dobrego ostrzeniu, (c) idealnym ostrzeniu. Na (d) przedstawiono obraz jednorodnego celu fluorescencyjnego znajdującego się na dystalnym końcu wiązki, wykonany przy oświetleniu Koehlera (jednorodnym). (e) Jednorodny cel fluorescencyjny obrazowany przy oświetleniu krytycznym, z widoczną strukturą źródła na obiekcie. (f) Luźne tkanki i komórki mogą przylegać do czoła wiązki światłowodowej, która jest również podatna na niewielkie uszkodzenia na obwodzie.
 <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopowy kultur komórkowych przy zwiększeniach: skale 100 µm, 40 µm i 250 µm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazowanie za pomocą HRME. (a) Komórki 1483 in vitro, obrazowane za pomocą gołego wiązka włókien (IGN-08/30) po znakowaniu proflawiną 0,01% (w/v). (b) Ta sama kultura komórek 1483 co w (a), obrazowana za pomocą wiązki włókien z przymocowaną soczewką GRIN 2,5x. (c) Obraz prawidłowej błony śluzowej jamy ustnej człowieka in vivo po miejscowym zastosowaniu proflawiny 0,01% (w/v).
Film 1. Obrazowanie tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy poprzez wprowadzenie wiązki światłowodów o średnicy zewnętrznej 450 μm do światła igły 21G wprowadzonej do tkanki. Proflawina 0,01% (w/v) została podana w miejsce obrazowania za pomocą tej samej igły przed wprowadzeniem światłowodu obrazującego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
<li>Muldoon, T. J., Anandasabapathy, S., Maru, D., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+in+Barrett%27s+esophagus%3A+a+novel%2C+low-cost+endoscopic+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging in Barrett's esophagus: a novel, low-cost endoscopic microscope.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 737-744 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Thekkek, N., Roblyer, D., Maru, D., Harpaz, N., Potack, J., Anandasabapathy, S., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+image+analysis+criteria+for+the+high-resolution+microendoscopic+detection+of+neoplasia+in+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus.</a> J. Biomed. Opt. 15, 026027-026027 (2010).</li>
<li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li>
<li>Dubaj, V., Mazzolini, A., Wood, A., Harris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+fibre+bundle+contact+imaging+probe+employing+a+laser+scanning+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Optic fibre bundle contact imaging probe employing a laser scanning confocal microscope.</a> J. Microsc. 207, 108-117 (2002).</li>
<li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Inst%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li>
<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP i DY nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia. RRK posiada patenty dotyczące platform obrazowania mikroendoskopowego.

Opisana tutaj technika mikroendoskopii o wysokiej rozdzielczości zapewnia badaczom w obszarze podstawowych badań biomedycznych i klinicznych elastyczną, niezawodną i kosztowo efektywną metodę wizualizacji szczegółów komórkowych in situ. Przedstawiliśmy protokół montażu systemu obrazowania oraz zademonstrowaliśmy jego zastosowanie w hodowlach komórkowych in vitro oraz w tkankach zwierzęcych i ludzkich in vivo. Chociaż w zaprezentowanych tutaj wynikach obrazowania jako fluorescencyjny środek kontrastowy zastosowano proflawinę, inne grupy zademonstrowały wersje systemu z długościami fal oświetlenia LED i filtrami dobranymi do widm pobudzenia / emisji innych barwników 5-7.
Rozdzielczość i pole widzenia są początkowo określone przez odstęp między rdzeniami oraz średnicę obrazowania wiązki światłowodowej. Użyliśmy wiązek o odstępie między rdzeniami wynoszącym około 4 μm oraz średnicach obrazowania 330 μm (film 1), 720 μm (rycina 2, rycina 3a,b) i 1400 μm (rycina 3c). Mniejsze wiązki mogą być wprowadzane przez igły o mniejszym rozmiarze i są znacznie bardziej elastyczne niż większe włókna. My oraz inni autorzy 8 odnotowaliśmy w niektórych przypadkach występowanie emisji autofluorescencji z samej wiązki światłowodowej. Podczas prób wzbudzania fluoroforów w zakresie fal UV lub zbierania emisji w czerwonym zakresie widma należy zwrócić uwagę na poziom autofluorescencji wiązki światłowodowej, który wpływa na całkowity zmierzony sygnał.
Choć w większości raportowanych do tej pory prac nad mikroendoskopią o wysokiej rozdzielczości wykorzystywano gołe wiązki światłowodowe, dodatkowe powiększenie można uzyskać dzięki zastosowaniu soczewek GRIN przytwierdzonych do dystalnego końca. Soczewki GRIN stanowią prosty i ekonomiczny sposób na zwiększenie rozdzielczości przestrzennej, choć ich podatność na aberracje optyczne oraz ograniczona NA są dobrze znane. Jeśli wydajność soczewki GRIN jest niewystarczająca dla konkretnego zastosowania, można zastosować hybrydowe obiektywy GRIN / sferyczne 9 lub miniaturowe zestawy soczewek obiektywowych 10-11.
Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości działa zasadniczo jak szerokopolowy mikroskop epi-fluorescencyjny; w związku z tym nie należy spodziewać się sekcjonowania optycznego (takiego jak w mikroskopii konfokalnej lub nieliniowej). Z naszego doświadczenia wynika, że przy zastosowaniu światła wzbudzenia o długości fali 455 nm oraz miejscowo podanej proflawiny jako środka kontrastowego, światło jest zbierane głównie z głębokości odpowiadającej kilku warstwom komórek.
Niniejszy protokół ma na celu umożliwienie czytelnikowi montażu mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości na blacie laboratoryjnym, przy zajmowanej powierzchni zaledwie 10" x 8". W razie potrzeby system można zamknąć w obudowie, a komponenty elektryczne (LED i kamerę) zasilić za pomocą pakietu baterii (Rysunek 1d). Wiele kompaktowych kamer może być zasilanych przez porty IEEE-1394 (Firewire) i USB komputera gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Kamera CCD</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>Wybrany do zastosowania z proflawiną &amp;#8211; inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>Wybrany do zastosowania z proflawiną &amp;#8211; inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów</td></tr><tr><td>Filtr emisji</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>Wybrany do zastosowania z proflawiną &amp;#8211; inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>Wybrany do zastosowania z proflawiną &amp;#8211; inne fluorofory mogą wymagać innych komponentów</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka tubusowa</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>Należy dobrać ogniskową, aby uzyskać wymagane powiększenie w kamerze CCD</td></tr><tr><td>Soczewka kondensora</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>Kostka systemu Cage</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>Pręty i płytki systemu Cage</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka lustra zwrotnego</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>Tubusy soczewkowe</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (lub SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery / sprzęgła</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>Złącza SMA</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>Wiązka światłowodowa</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>Dostępne są wiązki o większej lub mniejszej średnicy (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Wiele badań biologicznych i klinicznych wymaga podłużnego badania i analizy morfologii oraz funkcji z rozdzielczością na poziomie komórkowym. Tradycyjnie wiele eksperymentów prowadzi się równolegle, usuwając poszczególne próbki z badania w sekwencyjnych punktach czasowych w celu oceny za pomocą mikroskopii świetlnej. Opracowano kilka technik intravitalnych, a mikroskopia konfokalna, wielofotonowa i generacji drugiej harmonicznej wykazały możliwość zastosowania w obrazowaniu in situ 1. Jednak w przypadku tych systemów wymagana infrastruktura jest złożona i kosztowna, obejmując skanujące systemy laserowe i skomplikowane źródła światła. Przedstawiamy tutaj protokół projektowania i montażu wysokorozdzielczego mikroendoskopu, który można zbudować w jeden dzień, korzystając z gotowych komponentów za kwotę poniżej 5 000 USD. Platforma ta oferuje elastyczność w zakresie rozdzielczości obrazu, pola widzenia i długości fali roboczej; opisujemy, w jaki sposób parametry te można łatwo zmodyfikować, aby sprostać konkretnym potrzebom użytkownika końcowego.
My zespół oraz inni badacze analizowali zastosowanie mikroendoskopu o wysokiej rozdzielczości (HRME) w hodowlach komórkowych in vitro 2-5, w wyciętych 6 i żywych tkankach zwierzęcych 2,5 oraz w ludzkich tkankach in vivo 2,7. Użytkownicy zgłaszali stosowanie kilku różnych fluorescencyjnych środków kontrastowych, w tym proflawiny 2-4, pochodnej benzoporfiryny monoacid ring A (BPD-MA) 5 oraz fluoresceiny 6,7, z których wszystkie otrzymały pełną lub badawczą zgodę FDA na stosowanie u ludzi. Mikroendoskopia o wysokiej rozdzielczości w formie opisanej w niniejszym opracowaniu może być atrakcyjna dla szerokiego grona badaczy pracujących w naukach podstawowych i klinicznych. Technika ta oferuje skuteczne i ekonomiczne podejście, które uzupełnia tradycyjną mikroskopię laboratoryjną, umożliwiając użytkownikowi wykonywanie wysokorozdzielczego obrazowania podłużnego in situ.

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Wiele badań biologicznych i klinicznych wymaga długofalowego badania oraz analizy morfologii i funkcji z rozdzielczością na poziomie komórkowym.

Tradycyjnie badania biologiczne i kliniczne wymagające analizy mikroskopowej z rozdzielczością na poziomie komórkowym były przeprowadzane poprzez równoległe wykonanie wielu eksperymentów, z których poszczególne próbki usuwano z badania w następujących po sobie punktach czasowych w celu oceny za pomocą mikroskopii świetlnej, podczas gdy mikroskopia konfokalna, wielofotonowa i mikroskopia drugiego harmonicznego są przydatnymi technikami obrazowania in situ. Wymagana infrastruktura jest złożona i kosztowna, obejmując skaningowe systemy laserowe i zaawansowane źródła światła. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak w jeden dzień zbudować wysokorozdzielczy światłowodowy system mikroendoskopii, wykorzystując dostępne komercyjnie komponenty za kwotę poniżej 5 000 US dollars.Platforma oferuje elastyczność w zakresie rozdzielczości obrazu, pola widzenia oraz długości fali roboczej. W pierwszej kolejności montowana jest prosta rama mikroskopu fluorescencyjnego w układzie epi, aby pomieścić źródło światła, filtry optyczne, soczewki, wiązkę światłowodową oraz kamerę CCD. Następnie instalowane są soczewki obrazujące, które tworzą powiększony obraz wiązki światłowodowej na matrycy kamery CCD.Następnie instaluje się źródło LED z optyką oświetleniową w celu dostarczenia światła wzbudzenia fluorescencyjnego do próbki. Ostatecznie, przy użyciu zmontowanego mikroendoskopu, obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala na ujawnienie szczegółów na poziomie komórkowym w próbkach znakowanych fluorescencyjnie, w tym w kulturach in vitro, modelach zwierzęcych in vivo oraz u ludzi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy wielofotonowa, jest jej dostateczna prostota i niski koszt, dzięki czemu badacze z różnych dziedzin mogą ją szybko wdrożyć i dostosować do swoich specyficznych potrzeb.Opisany tutaj mikroendoskop o wysokiej rozdzielczości należy traktować jako konfigurację bazową, z możliwością wprowadzenia kilku modyfikacji w montażu i zastosowaniu. Wybierając komponenty do konkretnej aplikacji, należy wziąć pod uwagę zależności występujące w mikroskopii fluorescencyjnej pomiędzy stężeniem fluoroforu, oświetleniem powodującym fotobielenie, intensywnością, czułością kamery, wzmocnieniem oraz czasem ekspozycji. Platforma ta została zaprojektowana do pracy z proflawiną jako fluorescencyjnym środkiem kontrastowym, lecz może zostać skonfigurowana do pracy z innymi barwnikami fluorescencyjnymi.Pro flavin jest jasnym barwnikiem do jąder komórkowych z maksymalną długością fali absorpcji i emisji wynoszącą odpowiednio 445 nanometrów i 515 nanometrów. Stosowanie innych środków kontrastowych będzie wymagało od użytkownika odpowiedniego doboru filtrów wzbudzenia, emisji oraz filtrów dichroicznych w celu złożenia systemu mikroendoskopu. Rozpocznij od połączenia dwóch sześciocalowych prętów klatkowych z dwoma prętami klatkowymi o długości 1,5 cala, aby utworzyć parę prętów o długości 7,5 cala. Wkręć pręty w jedną stronę jednostki lustra składanego, a następnie zainstaluj lustro o średnicy jednego cala.Następnie wkręć cztery pręty o długości 0,5 cala w przeciwległą ściankę jednostki lustra składanego. Nasuń kostkę klatki na pręty klatki o długości 7,5 cala przez dwa dolne otwory przelotowe. Wkręć pręty o długości dwóch cali w boczną ściankę kostki klatki.Używając adaptera z mocowaniem C na SM1, przymocuj kamerę do płyty klatki. Zamocuj płytę klatki na prętach klatki o średnicy 0,5 cala, tak aby była zlicowana z powierzchnią jednostki lustra składanego. Wybierz soczewkę tubusową o średnicy jednego cala, aby utworzyć obraz wiązki światłowodowej na kamerze.Ogniskową obiektywu należy dobrać w taki sposób, aby obraz wiązki światłowodowej był próbkowany przez co najmniej dwa piksele. W celu obrazowania za pomocą kamery, należy włożyć obiektyw do trzymającej go tuby o długości trzech cali i zabezpieczyć go pierścieniem mocującym. Do przykręcania pierścieni mocujących w długich tubach obiektywowych pomocny jest klucz płaski.Włóż filtr emisyjny do trzycalowej tuby obiektywu, kładąc go na pierwszym pierścieniu mocującym, a następnie dodaj kolejny pierścień, aby zabezpieczyć filtr na miejscu. Upewnij się, że orientacja filtra jest zgodna z konwencją wskazaną przez producenta filtra. Wkręć tubę obiektywu w bok kostki klatki znajdujący się najbliżej kamery CCD.To położenie jest tutaj również przedstawione. Należy zauważyć, że na schemacie soczewka i filtr są pokazane bez trzechcalowej rury obiektywu. Dla większej przejrzystości należy podłączyć kamerę do komputera i wyświetlić obraz na ekranie.Skieruj zestaw klatki w stronę oddalonego obiektu i przesuń kostkę klatki wzdłuż prowadnic, aż obraz obiektu stanie się ostry. Za pomocą śrubokręta dokręć cztery śruby znajdujące się po bokach kostki klatki. Śruby te po dokręceniu blokują prowadnice, utrzymując kostkę w wybranej pozycji.Zapewni to, że soczewki tubusowe utworzą skupiony obraz wiązki światłowodowej na kamerze w połączeniu z obiektywem z korekcją w nieskończoność. Następnie włóż lustro dwukierunkowe do uchwytu i umieść je pod kątem 45 stopni w kostce klatki. Przykręć obiektyw za pomocą adaptera gwintu RMS na SM1 oraz regulowanego tubusu soczewkowego do ścianki kostki klatki przeciwległej do uchwytu soczewek tubusowych.Następnie wkręć złączy SMA w płytkę klatkową i zamontuj ją na prętach w odległości odpowiadającej w przybliżeniu odległości roboczej obiektywu. Do otwartych boków sześcianu klatkowego dodaj płytkę podstawy oraz zaślepkę. Następnie zamontuj diodę LED na płytce klatkowej i nasuń ją na końce dwucalowych prętów.Włóż soczewkę do tubusu soczewkowego o średnicy 0,5 cala w taki sposób, aby po wkręceniu tubusu w bok kostki klatkowej obraz diody LED wypełniał tylną aperturę obiektywu. Dodatkowo umieść filtr wzbudzenia w tubusie soczewkowym. Na tym etapie do sterowania intensywnością światła iluminacyjnego można użyć sterownika LED, a elementy przymocować za pomocą żywicy epoksydowej.Podłącz złącze SMA dla włókna o średnicy 1030 mikronów do światłowodowego wiązki o polu widzenia 720 mikronów. Szczegółowe informacje na temat złączania światłowodów znajdują się w publikacji firmy Thorlabs, numer katalogowy FN 96: Przewodnik po złączaniu i polerowaniu włókien optycznych.Wkręć wiązkę światłowodową z końcówkami SMA do gniazda SMA zamontowanego na prętach klatki. Skieruj dystalny koniec wiązki w stronę szerokopasmowego źródła światła; wystarczy oświetlenie fluorescencyjne. Następnie obserwuj obraz proksymalnej końcówki wiązki na kamerze CCD. Na koniec wyreguluj położenie obiektywu, wkręcając go lub wykręcając z kostki klatki.Aż do momentu uzyskania ostrego obrazu wiązki włókien, poszczególne rdzenie powinny być wyraźnie widoczne. Rozdzielczość przestrzenną mikroendoskopu można zwiększyć, mocując mikrosoczewkę lub układ soczewek do dystalnego końca wiązki włókien. Układy optyczne te są skonfigurowane w taki sposób, że zamiast bezpośredniego przykładania końca wiązki do tkanki, obraz końcówki jest rzutowany na powierzchnię tkanki z określonym powiększeniem.Zwiększa to częstotliwość próbkowania przestrzennego narzuconą przez światłowodowy wiązka prowadzącą światło. Stopień powiększenia soczewki GRIN odpowiada zwiększeniu rozdzielczości przestrzennej, a jednocześnie proporcjonalnemu zmniejszeniu pola widzenia. Wybierz soczewkę GRIN o powiększeniu i odległości roboczej odpowiedniej dla Twojej aplikacji.Należy upewnić się, że średnica soczewki odpowiada średnicy wiązki włókien, z którą planuje się pracować. Montuje się wiązkę włókien oraz soczewkę GRIN na oddzielnych trójosiowych manualnych stołach pozycjonujących pod mikroskopem o małym powiększeniu lub stereomikroskopem w celu precyzyjnego wyrównania.Następnie nanieś kroplę kleju optycznego na powierzchnię soczewki lub wiązki. Używając pozycjonerów manualnych, doprowadź oba elementy do kontaktu. Naświetl styk światłem UV z dawką zalecaną przez producenta, aby utwardzić klej.Aby chronić soczewkę GRIN oraz powierzchnię połączenia, należy użyć krótkiego odcinka aluminiowej rurki kapilarnej w celu osłonięcia styku. Nasuń rurkę na połączenie i zabezpiecz ją kroplą żywicy epoksydowej na każdym końcu rurki, a następnie użyj rurki termokurczliwej, aby dokończyć montaż. Przed obrazowaniem mikroendoskopowym należy podać środek kontrastowy do komórek lub tkanek, które mają zostać zobrazowane, w celu obrazowania komórek i hodowli.W pierwszej kolejności należy usunąć pożywkę za pomocą pipety. Następnie do dołka należy delikatnie nanieść roztwór proflawiny. Po krótkiej inkubacji trwającej do jednej minuty, roztwór proflawiny należy odessać pipetą i wylać.Przepłucz komórki, dodając i usuwając świeży roztwór PBS z dołka; zamocuj dystalny koniec wiązki światłowodów w stabilnym uchwycie z manualnymi przekładniami poosiowymi X, Y, Z w celu zapewnienia stabilności. Podczas obrazowania, po aplikacji barwnika do komórek lub tkanki, umieść wiązkę światłowodów w lekkim kontakcie z próbką. Obraz z wiązki światłowodów wyświetlaj na ekranie komputera, korzystając z oprogramowania dostarczonego przez producenta kamery lub dowolnego własnego oprogramowania, które zdecydujesz się opracować.Dostosuj czas ekspozycji oraz ustawienia wzmocnienia kamery, aby uzyskać obraz o odpowiedniej jasności. Po prawidłowym montażu mikroendoskop będzie działał jako mikroskop epifluorescencyjny przekazujący obraz poprzez spójny wiązek światłowodowy. Aby uzyskać optymalne wyniki obrazowania, należy zadbać o spełnienie trzech kluczowych warunków.W pierwszej kolejności należy obrazować proksymalną powierzchnię wiązki światłowodowej na kamerze CCD bez rozmycia, aby uzyskać pełną rozdzielczość systemu. Tutaj przedstawiono fragment wiązki światłowodowej obrazowany przy słabej ostrości, lekkiej ostrości oraz dobrej ostrości. Optymalną ostrość uzyskuje się poprzez regulację rzeczywistej pozycji obiektywu względem powierzchni wiązki.Po drugie, proksymalna powierzchnia wiązki włókien powinna być równomiernie oświetlona w całym jej przekroju. Jak opisano wcześniej, osiąga się to poprzez skonfigurowanie optyki oświetlenia dla oświetlenia kolistego. Przedstawiony tutaj obraz został uzyskany podczas oświetlenia jednorodnej próbki fluorescencyjnej w tej preferowanej konfiguracji.Odpowiedni wynik przy oświetleniu krytycznym przedstawiono tutaj. Struktura diody LED jest obrazowana na czoło wiązki światłowodowej, co prowadzi do pojawienia się tego niepożądanego wzoru nałożonego na rzeczywistą strukturę próbki. Po trzecie, należy upewnić się, że zarówno czoło proksymalne, jak i dystalne wiązki światłowodowej są czyste i wolne od zarysowań oraz odprysków.W tym przykładzie do czoła wiązki przyczepiły się zanieczyszczenia, a na obwodzie włókna widoczne jest uszkodzenie w postaci niewielkiego odprysku na godzinie piątej. Zanieczyszczenia z czoła wiązek można usunąć, czyszcząc je w taki sam sposób jak konwencjonalne złącza światłowodowe, używając papieru soczewkowego i izopropanolu lub standardowych narzędzi do czyszczenia światłowodów. 1483 komórki zostały znakowane proflawiną, a goła wiązka światłowodowa została lekko przyłożona do próbki.Przedstawiono tutaj obrazowanie in vitro; po połączeniu wiązki z soczewką GRIN o powiększeniu 2,5x uzyskano poprawę rozdzielczości przestrzennej oraz zmniejszenie pola widzenia. Przeprowadzono obrazowanie in vivo, w którym wiązkę światłowodową o średnicy zewnętrznej 0,5 mm wprowadzono przez igłę 21G do tkanki podskórnej gruczołu piersiowego myszy, co pokazano na tym filmie; adipocyty są wyraźnie widoczne wraz z ruchem wynikającym z cyklu pracy serca. W tym przykładzie wykonano obrazowanie błony śluzowej jamy ustnej u zdrowego ochotnika z wykorzystaniem większej wiązki światłowodowej o średnicy zewnętrznej 1,5 mm.We wszystkich przykładach jako fluorescencyjny kontrast do znakowania jąder komórkowych zastosowano pro flavin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat projektowania i montażu światłowodowego mikroendoskopu do obrazowania fluorescencyjnego komórek i tkanek in vivo.

high-resolution-fiber-optic-microendoscopy-for-situ-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysokiej rozdzielczości mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórek in situ

Opisano pełną konstrukcję niestandardowego systemu obrazowania konfokalnego z przeskanowaniem w czasie rzeczywistym. System ten, który może być łatwo wykorzystany do mikroskopii i mikroendoskopii w tempie wideo, umożliwia zastosowanie szeregu geometrii obrazowania i aplikacji niedostępnych w standardowych komercyjnych systemach konfokalnych, przy ułamku ich kosztów.

Skaningowa mikroskopia konfokalna w czasie rzeczywistym i mikroendoskopia

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj metodę montażu niedrogiego mikroendoskopu światłowodowego do obrazowania komórkowego in situ. System umożliwia badaczom obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Przeglądaj więcej filmów