Name: Organotypowa hodowla plastrów zarodków myszy z ekspresją GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym rozrostu nerwów obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Poznaj metodę przygotowania organotypowych plastrów zarodków myszy z GFP do obrazowania rozrostu nerwów rdzeniowych. Technika umożliwia czasowo-rozdzielczą analizę rozwoju układu nerwowego obwodowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy wyrażają wdzięczność autorom oryginalnego źródła za pomysł przeprowadzenia hodowli plastrów embrionów myszy5. Chcielibyśmy podziękować Joachimowi Kirschowi za hojne wsparcie naukowe oraz Annie Degen za pomoc techniczną podczas filmowania. Praca ta była finansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) oraz Uniwersytet Heidelbergu (Excellence Cluster Cellular Networks).

Część 1: Przygotowanie do krojenia i hodowli.
<ol>
	<li>Przygotować 10-cm płytki do hodowli tkankowych z pożywką do krojenia (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% płodowa surowica bydlęca, 0,5% glukozy, 1 mM glutaminy, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) oraz 3-cm wkładki z membraną hodowlaną Millicell-CM 0,4-μm i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
	<li>Podgrzać w mikrofalówce 4% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w PBS i utrzymać na płycie grzejnej w temperaturze około 37°C.</li>
	<li>Napełnić 10-cm bakteriologiczne szalki Petriego PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8mM KH2PO4) i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Przygotować urządzenie chłodzące do mikrotomu lub upewnić się, że kuweta z buforem i elementy chłodzące są przechowywane w zamrażarce w celu ich schłodzenia.</li>
</ol>
Część 2: Osadzanie zarodków w medium.
<ol>
	<li>Wyjąć zarodki z macicy i zbadać je za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w celu sprawdzenia ekspresji GFP.</li>
	<li>Umieścić zarodki na odwróconej szalce Petri o średnicy 10 cm i ułożyć je za pomocą pasków papieru Whatmana, aby usunąć nadmiar PBS.</li>
	<li>Nałożyć agarozę na zarodek, aby utrwalić go w tej pozycji. Pozostawić agarozę do stężenia.</li>
	<li>Ograniczyć obszar wokół zarodka poprzez wycięcie go żyletką.</li>
	<li>Obrócić zatopiony zarodek na drugą stronę.</li>
	<li>Nałożyć dodatkową agarozę na tkankę zarodkową, aby upewnić się, że zarodek jest całkowicie zatopiony.</li>
	<li>Przygotować blok agarozy z czystymi krawędziami i zamontować go na uchwycie wibratomu za pomocą Loctite 406, specjalnego kleju podobnego do "Krazy Glue".</li>
</ol>
Część 3: Procedura krojenia.
<ol>
	<li>Przygotować schłodzoną tackę z buforem oraz element chłodzący.</li>
	<li>Włożyć uchwyt z przyklejoną tkanką i dodać 1x HBSS (HBSS bez Ca2+ i Mg2+, bufor HEPES 10 mM pH 7.3, penicylina/streptomycyna 500 U/ml) do momentu całkowitego zakrycia próbki.</li>
	<li>Włożyć i zamocować uprzednio oczyszczone (70% etanol) ostrze mikrotomu.</li>
	<li>Przygotować skrawki o grubości 350 - 450 μm i przenieść je za pomocą skróconych szklanych pipet Pasteura do płytek hodowlanych przechowywanych w lodzie.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie usunąć agarozę z każdego skrawka i przenieść go na membrany hodowlane Millicell. Na jednej membranie w 10-cm płytce hodowlanej wypełnionej 6 mL pożywki można hodować około 4 skrawków.</li>
	<li>Inkubować skrawki w temperaturze 37°C i 5% CO2 (Pożywka: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% płodowa surowica bydlęca, 0.5% glukozy, 1mM glutaminy, 2.5 mM HEPES, pH 7.3). W przypadku wykonywania serii obrazowania time-lapse należy utrzymywać stałą objętość pożywki. Przy krótkich seriach obrazowania w określonych odstępach czasu wystarczy pozostawić pożywkę bez zmian. Przy dłuższych okresach hodowli zaleca się wymianę pożywki co 12-20 godzin.</li>
</ol>
Część 4: Obrazowanie wypustek nerwów rdzeniowych pod mikroskopem.


<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie nerwów rdzeniowych, umieszczając 10-cm płytkę do hodowli tkankowej zawierającą membrany hodowlane Millicell z przekrojami pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Oznacz orientację membran hodowlanych Millicell na stoliku mikroskopu, aby poprawnie je ustawić podczas kolejnego punktu czasowego obrazowania.</li>
	<li>Obrazuj wypustki nerwów rdzeniowych, używając obiektywów 4x (apertura numeryczna [NA] 0,1), 10x (NA 0,3) lub 20x (NA 0,5).</li>
</ol>
Rysunek 1 przedstawia serię obrazów ukazującą wzrost nerwu rdzeniowego podczas 20 godzin hodowli przy użyciu obiektywów 4x i 10x.
<img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Time-lapse zarodkowego wzrostu nerwów; obraz mikroskopowy; 4h, 14h, 24h; analiza rozwojowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1 Seria obrazów wzrostu nerwów rdzeniowych w przekroju poprzecznym embrionu tauGPF homozygotycznego. * = neurony ruchowe brzusznej części rdzenia kręgowego, strzałka = DRG. Oznaczono oś grzbietową (D)-brzuszną (V) przekroju. Paski skali: 200 μm.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

W rozległym porównaniu metod przygotowywania kultur plastrów embrionalnych zarodków myszy w połowie okresu gestacji (E10 - E12) zaobserwowaliśmy, że wibratom bezsprzecznie daje najbardziej wiarygodne wyniki, zarówno pod względem ogólnej żywotności kultur, jak i powtarzalności wzorców wyrastania nerwów. W przeciwieństwie do nich, plastry przygotowane przy użyciu siekacza do tkanek McIlwaina3 okazały się całkowicie nieżywotne. Pierwotnie stosowaliśmy metodę gilotynową4, w której cały miot zarodków moż...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Papier Whatmann</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Skrócone pipety wypalane ogniowo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładki Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>brak</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>seria PL</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>seria UPLFL &amp;#8211;PH</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Wyposażenie komory grzewczej</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 i inkubator S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję gfp do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

W wielu zastosowaniach pożądana jest hodowla embrionów myszy ex vivo w formie plastrów organotypowych. Na przykład wykorzystujemy linię myszy transgenicznych (tauGFP), w której ulepszona wersja zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) jest ekspresowana wyłącznie we wszystkich neuronach rozwijającego się ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego1, co umożliwia zarówno filmowanie unerwienia kończyny przedniej, jak i manipulowanie tym procesem za pomocą technik farmakologicznych i genetycznych2. Najbardziej krytycznym parametrem w udanej hodowli takich plastrów jest metoda ich przygotowania. Po obszernych testach różnych metod stwierdziliśmy, że wibrotom jest najlepszym możliwym urządzeniem do krojenia embrionów w taki sposób, aby rutynowo uzyskiwać hodowlę wykazującą żywotność przez okres kilku dni, a co najważniejsze, rozwijającą się w sposób specyficzny dla wieku. W przypadku embrionów w połowie okresu gestacji obejmuje to prawidłowy wzrost nerwów rdzeniowych z rdzenia kręgowego i zwojów rdzeniowych do ich celów w obwodzie oraz właściwe różnicowanie tkanki szkieletowej i mięśniowej.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przetwarzania całych zarodków z dni embrionalnych (E) od E10 do E12 w plastry o grubości 300 - 400 µm do hodowli w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek, które mogą być badane do dwóch dni po przygotowaniu plastrów. Kluczowym elementem sukcesu tego podejścia jest zastosowanie wibratomu do krojenia każdego zarodka zatopionego w agarozie. Następnie plastry hoduje się na wkładkach z membraną hodowlaną Millicell umieszczonych na małej objętości medium, co stanowi technikę hodowli na granicy faz. Jeden miot średnio z 7 zarodkami rutynowo pozwala na uzyskanie co najmniej 14 plastrów (2-3 plastry regionu kończyny przedniej z każdego zarodka), co nieznacznie różni się w zależności od wieku zarodków oraz grubości plastrów. Około 80% hodowanych plastrów wykazuje wypustki nerwowe, co można mierzyć przez cały okres hodowli2. Przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane z wykorzystaniem linii myszy tauGFP.

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

W wielu zastosowaniach pożądana jest hodowla embrionów mysich ex vivo w formie przekrojów organotypowych. Na przykład wykorzystujemy transgeniczną linię myszy (tauGFP) w...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie organotypowych przekrojów poprzecznych regionu kończyny przedniej embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania wzrostu nerwów rdzeniowych. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie zatopienie embrionów w niskotopliwym agarosie i ograniczenie obszaru tkanki oraz agarosy do regionu zainteresowania. Następnie blok agarosy jest montowany do etapowania.Następnie zarodki zatopione w bloku są przecinane za pomocą wibratomu. Ostatnim etapem procedury jest usunięcie agaru otaczającego plastry i przeniesienie plastrów do płytek hodowlanych. Następnie plastry są hodowane, co prowadzi do wyrastania nerwów obwodowych w kierunku peryferii, co można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak gilotyna czy rozdrabniacz do tkanek, jest fakt, że plastry są generowane w sposób bardziej kontrolowany i wykazują lepszą żywotność w kulturze. Z tego względu metoda ta może pomóc w badaniach z zakresu neurobiologii rozwoju, np. przy analizie prowadzenia i wyrastania nerwów rdzeniowych; procedurę zaprezentuje Isabel barman. Rozpocznij tę procedurę, przygotowując 10 cm

organotypic-slice-culture-gfp-expressing-mouse-embryos-for-real-time

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tkankowa hodowla skośna ekspresujących GFP zarodków myszy w celu wizualizowaniu w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ten film demonstruje hodowlę ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych embrionów myszy. Zarodki są izolowane i osadzane w agarozie. Za pomocą wibratomu uzyskuje się plastry zawierające jądra okoruchowe i oczy. Plastry są utrzymywane w kulturze i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Hodowla ex vivo i obrazowanie wycinków okoruchowych z transgenicznych zarodków myszy

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę przygotowania organotypowych plastrów zarodków myszy z GFP do obrazowania rozrostu nerwów rdzeniowych. Technika umożliwia czasowo-rozdzielczą analizę rozwoju układu nerwowego obwodowego.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Przeglądaj więcej filmów