Name: Oznaczanie metylacji DNA genów wdrukowanych w bielmo rzodkiewnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę oznaczania metylacji DNA genów wdrukowanych w bielmie Arabidopsis thaliana. Protokół obejmuje izolację bielma, sekwencjonowanie bisulfitowe i analizę statusu metylacji alleli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują paniom Jennifer M. Lommel i Tara N. Rognan za pielęgnację roślin Arabidopsis. Praca ta była finansowana z funduszy startowych Saint Louis University oraz grantów National Institutes of Health 1R15GM086846-01 i 3R15GM086846-01S1 przyznanych W. Xiao.

I. Krzyżowanie genetyczne
1. Kastracja rośliny żeńskiej
Aby rozróżnić allele matczyne i ojcowskie za pomocą polimorfizmu sekwencji DNA, jako rodzice żeński i męski zostaną wybrane dwa różne ekotypy, np. Columbia-0 (Col-0) i Ler. Rośliny powinny być młode i zdrowe. Rodzica żeńskiego można poddać emaskulacji, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, wizjera powiększającego lub gołym okiem. Należy zlokalizować kwiaty w stadium 12 (Smyth et al., 190) i usunąć wszelkie kwiaty lub strąki znajdujące się powyżej i poniżej nich, odcinając nożyczkami podstawę szypułki. Pęsetę należy wysterylizować, delikatnie zanurzając końcówkę w zlewce z 95% etanolem, co usunie ziarna pyłku z pęsety i jednocześnie je zabije. Używając pęsety, należy delikatnie rozdzielić pąki kwiatowe, a następnie ostrożnie usunąć 4 działki kielicha, 4 płatki i 6 pręcików, pozostawiając słupek nieosłonięty i nienaruszony. Podczas tego procesu należy starać się nie uszkodzić słupków.
2. Wybór dawcy pyłku i przeprowadzenie zapylania
Najlepszymi dawcami pyłku są rozwinięte kwiaty w stadium 14, w których płatki są rozpostarte pod kątem 90 ° względem słupka (Smyth et al., 190), co wiąże się z obfitym uwalnianiem pyłku. Należy uchwycić kwiat u podstawy, tuż powyżej szypułki, co spowoduje jego pełne otwarcie. Następnie należy przenieść pyłek z pręcika na znamię przygotowanego słupka. Po zapyleniu znamię zostanie pokryte żółtym pyłkiem, co można łatwo zaobserwować pod mikroskopem.
3. Oznakowanie krzyża
Po zapyleniu wszystkich wykastrowanych słupków na roślinie, oznaczamy krzyżówkę za pomocą etykiety jubilerskiej, podając informacje o rodzicach żeńskich i męskich oraz datę. W glebie w pobliżu rośliny umieszczamy palik, za pomocą sznurka przywiązujemy łodygę kwiatostanu do palika, a zapylone słupki przykrywamy plastikową torebką.
II. Izolacja tkanek endospermy u Arabidopsis
1. Przygotowanie materiałów
Zazwyczaj przygotowujemy niezbędne materiały przed pobraniem tkanek endospermy i embrionu: zbiornik z ciekłym azotem, ciekły azot, mikroskop stereoskopowy, dwie nowe pary pęset precyzyjnych (5 INOX. FST firmy Dumont biology, Szwajcaria), szkiełka przedmiotowe do mikroskopu (3" X 1" X 1,0 mm) oraz roztwór 0,3 M sorbitolu i 5 mM MES o pH 5,7.
2. Zbieranie strączków
W 7. lub 8. dniu po zapyleniu (DAP) nasiona są gotowe do zbioru w fazie od średniej do późnej torpedy embriogenezy i mogą zostać poddane sekcji w celu wyodrębnienia endospermy oraz zarodka. Czasami może to zająć 9–10 DAP, jeśli ewmaskulowane kwiaty były zbyt młode.
3. Izolacja endospermy i zarodka
Ponieważ nasiona Arabidopsis są bardzo małe, do izolacji endospermy i embrionu używamy mikroskopu stereoskopowego. Umieszczamy łuszczkę w 8. dniu po zapyleniu (8-DAP) pod mikroskopem, za pomocą jednej pęsety trzymamy szypułkę łuszczki, a końcówką drugiej pęsety rozsuwamy łuszczkę w miejscu zrastania się dwóch pręcików. Za pomocą pęsety przenosimy jedno nasiono do roztworu 0,3 M sorbitolu i 5 mM MES o pH 5,7, wykonujemy niewielkie nacięcie od strony mikropylu, aby wysunąć embrion, a następnie ściskamy nienacięty koniec, by wypchnąć endospermę i oddzielić ją od łupiny nasiona (Kinoshita et al., 204). Embrion oraz endospermę umieszczamy w oddzielnych mikroprobówkach w ciekłym azocie. Proces ten powtarzamy, aż zgromadzimy embriony lub endospermę z 10-15 łuszczek, a następnie przechowujemy probówki w zamrażarce w temperaturze -80°C. W niektórych przypadkach nie ma konieczności oddzielania endospermy od łupiny nasiona, tzn. do analizy imprinting-u genów można izolować całkowite RNA z mieszaniny endospermy i łupiny nasiona.
III. Sekwencjonowanie z bisulfitem
1. Wymagane odczynniki
Cetylotrimetylammonyk bromek (CTAB) do przygotowania genomowego DNA, enzymy restrykcyjne, 3 M NaOH (świeżo przygotowany), 6,42 M mocznik/4 M pirosiarczyn sodu (2 M pirosiarczyn sodu, Sigma-Aldrich, S90, Na2S2O5, masa cząsteczkowa: 190), 10 mM hydrochinon, zestaw do oczyszczania DNA (Promega Wizard DNA Clean-up System, kat. nr A7280), bufor TE, 6,3 M NaOH (świeżo przygotowany), 10 M NH4OAc, 20 μg/μL tRNA oraz 100% etanol.
2. Szczegóły protokołu traktowania pirosyryczanem
<ol>
	<li>Wyizolować genomowy DNA z endospermy lub zarodka za pomocą procedury z użyciem CTAB (Rogers i Bendich, 198).</li>
	<li>Trawienie 100 ng - 2 μg kwasu DNA genomowego w 20 μL do 100 μL całkowita objętość z enzymami restrykcyjnymi, które tną poza obszarem poddanym analizie. W przypadku promotora MEA stosujemy XhoI, NdeI oraz PstI lub HindIII.</li>
	<li>Zdenaturuj enzymy restrykcyjne, gotując DNA przez pięć minut, a następnie schłodź próbkę na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 1/9 objętości (2.2 μL dla 20 μL strawionego DNA) 3 M NaOH i inkubować w 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieś roztwór do 250 μL probówka do PCR</li>
	<li>Rozpuścić 7,5 g mocznika w 10 ml sterylnej wody destylowanej; powoli dodawać 7,6 g pirosiarczynu sodu w ciągu 1–2 godzin (podgrzewanie zazwyczaj wspomaga rozpuszczanie); dostosować pH do wartości 5 przy użyciu świeżo przygotowanego 10 M NaOH; dopełnić objętość do 20 ml sterylną wodą destylowaną. Otrzymany roztwór to 6,24 M mocznika/4 M pirosiarczynu sodu.</li>
	<li>Dodać roztwór mocznika (6,24 M) i pirosiarczynu sodu (4 M) do stężeń końcowych odpowiednio 5,36 M i 3,4 M (Paulin i wsp., 198). Na przykład dodać 208 μL roztworu mocznika (6,42 M)/pirosiarczynu sodu (4 M) do powyższego 22.2 μL z denaturowanego DNA genomicznego (Xiao i wsp., 2003).</li>
	<li>Dodaj hydrochinon o stężeniu 10 mM do DNA, tak aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 mM (12 μL dla 20 μL trawienie).</li>
	<li>Przeprowadzenie konwersji pirosulfatowej w termocyklerze: 30 cykli 55 °C przez 15 minut, a następnie 95 °C przez 30 sekund.</li>
	<li>Przeprowadź odsolenie DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej za pomocą systemu Wizard DNA Clean-Up System firmy Promega, postępując zgodnie z protokołem (Jacobsen it al., 2000).</li>
	<li>Zmierz dokładną objętość buforu TE odzyskanego z kolumny po odsoleniu i dodaj NaOH o stężeniu 6,3 M do uzyskania stężenia końcowego 0,3 M. Inkubuj w 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 10 M NH4OH4OAc (pH 7,0) do stężenia końcowego 3 M, 2 μL z 20 μg/μL tRNA, a następnie dodać 3 objętości 10% etanolu i wymieszać. Wirować przez 15 minut przy 14 0 obr./min.</li>
	<li>Przemyj osad raz 70-procentowym etanolem, przeprowadź krótkie wirowanie i usuń nadmiar etanolu.</li>
	<li>Osusz pellet w wirówce odparowującej (speedvac) przez 5–10 minut, a następnie resuspenduj w 25 µl 100 μL bufor TE w zależności od początkowej ilości DNA. DNA poddane działaniu pirosyrczynanu sodu jest teraz gotowe do analizy PCR.</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Ponieważ niezmetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, trudna jest amplifikacja dużego fragmentu przy użyciu DNA poddanego działaniu pirosyfitu jako matrycy. Dlatego zazwyczaj projektujemy startery tak, aby amplifikowany produkt nie przekraczał 50 bp. W celu zsekwencjonowania 4-kb promotora MEA zaprojektowaliśmy wiele zestawów starterów i amplifikowaliśmy 14 nakładających się fragmentów, aby objąć cały ten region (Xiao et al., 203). </li>
	<li>Aby zsekwencjonować nić górną, projektując starter forward: I) wybieramy region bogaty w G (guaninę), aby uzyskać wyższą temperaturę anelowania bez konieczności wydłużania starterów; II) zamieniamy C (cytozynę) na Y (pirymidynę) w kontekstach CG i CNG, a pozostałe C zamieniamy na T (tyminę). Projektując starter reverse: I) wybieramy region bogaty w C; II) zamieniamy G na R (purynę) w kontekstach CG i CNG, a pozostałe G zamieniamy na A (adeninę). </li>
	<li>Aby zsekwencjonować nić dolną, projektując starter forward: I) wybieramy region bogaty w C; II) zamieniamy G na R w kontekstach CG i CNG, a pozostałe G zamieniamy na A. Projektując starter reverse: I) wybieramy region bogaty w G; II) zamieniamy C na Y (pirymidynę) w kontekstach CG i CNG, a pozostałe C zamieniamy na T. </li>
	<li>Zazwyczaj używamy 1-2 μL DNA poddanego działaniu pirosyfitu sodu jako matrycy dla każdej amplifikacji PCR (Xiao et al., 203). Produkt PCR musi zostać przeanalizowany za pomocą elektroforezy żelowej w celu potwierdzenia prawidłowej wielkości fragmentu, a następnie oczyszczony z żelu i sklonowany jako wkład do wektora klonującego TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen). Wybieramy i hodujemy pojedynczą kolonię, a następnie ekstrahujemy DNA plazmidowe i przesyłamy je do sekwencjonowania.</li>
</ol>
4. Analiza sekwencji
Zasada sekwencjonowania z bisulfitem polega na tym, że niezmetylowana cytozyna zostaje przekształcona w uracyl w wyniku deaminacji hydrolitycznej wywołanej wysokim stężeniem pirosyrczynanu sodu przy pH5.0, co w produkcie PCR objawia się jako tymina; natomiast 5-metylocytozyna nie ulega modyfikacji przez pirosyrczynan sodu i po amplifikacji PCR pozostaje cytozyną (Clark et al., 194; Frommer et al., 192). Po uzyskaniu wyniku sekwencjonowania porównujemy go z matrycą specyficzną dla nici użytej do amplifikacji PCR. Jeśli reszta cytozyny w matrycy jest odczytana jako tymina w wyniku sekwencjonowania, wskazuje to, że cytozyna nie była zmetylowana. Jeśli reszta cytozyny w matryce pozostaje cytozyną w sekwencjonowaniu, oznacza to, że cytozyna jest zmetylowana.
IV. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="Schemat stanu metylacji macierzyńskiego allelu MEA w endospermie i embrionie krzyżówki Col gl x RLD, miejsca CpG." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1 /">Rysunek 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Oddzielenie zarodka od endospermy i łupiny nasienia jest stosunkowo łatwe, jednak oddzielenie endospermy od łupiny nasienia jest żmudne, szczególnie w przypadku nasion wczesnej lub środkowej fazy torpedowatej embriogenezy. Ponieważ łupina nasienia dostarcza bardzo niewielką ilość tkanki, w przypadku niektórych genów, np. MEA i FWA, nie ma konieczności oddzielania endospermy od łupiny nasienia. Oznacza to, że możemy izolować RNA z mieszaniny tkanek endospermy i łupiny nasienia, sprawdzać ekspresję alleli...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Materiały i odczynniki&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Mikroskop stereoskopowy&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Nożyczki&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Pęseta z cienkimi końcówkami&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Etykieta jubilerska&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Paliki do roślin&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Sznurek lub wiązania drutowe&lt;/li&gt; &lt;li&gt;4&quot; X 2&quot; X 8&quot; Worki polietylenowe&lt;/li&gt; &lt;li&gt;3&quot; X 1&quot; szkiełka przedmiotowe do mikroskopu o grubości 1,0 mm&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Azot ciekły&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Zbiorniki na ciekły azot&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Blok grzejny&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Probówki do PCR&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Termocykler&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Probówki do mikrocentrifugowania&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikrowirówka&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Zaplecze do elektroforezy żelowej&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Arabidopsis thaliana&lt;/em&gt; Rośliny Columbia-0&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;em&gt;Arabidopsis thaliana&lt;/em&gt; Rośliny *Landsbergia erecta*&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Odczynniki&lt;/p&gt;&lt;ul&gt; &lt;li&gt;70% etanol&lt;/li&gt; &lt;li&gt;95% etanol&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100% etanol&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,3 M sorbitolu i 5 mM MES-pH 5,7&lt;/li&gt; &lt;li&gt;bromek cetylotrimetylammonium (CTAB)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100% etanol&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Chloroform&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Enzymy restrykcyjne&lt;/li&gt; &lt;li&gt;3 M NaOH&lt;/li&gt; &lt;li&gt;6,3 M NaOH&lt;/li&gt; &lt;li&gt;6,24 M mocznika/ 4 M pirosiarczynu sodu&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Sterylna woda destylowana H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10 mM hydrochinonu&lt;/li&gt; &lt;li&gt;System oczyszczania DNA Wizard DNA Clean-Up System (Promega)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10 M NH₄OH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OAc&lt;/li&gt; &lt;li&gt;20 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;tRNA L&lt;/li&gt; &lt;li&gt;bufor TE&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Zestaw TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

wyznaczanie metylacji dna genów imprintowanych w endospermie arabidopsis

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana jest doskonałym organizmem modelowym do badania mechanizmów epigenetycznych. Jednym z powodów jest fakt, że mutanty null z utratą funkcji metylotransferaz DNA są żywotne, co zapewnia system do badania, w jaki sposób utrata metylacji DNA w genomie wpływa na wzrost i rozwój. Imprinting odnosi się do różnicowej ekspresji alleli matczynych i ojcowskich i odgrywa istotną rolę w rozwoju rozrodczym zarówno u ssaków, jak i u roślin. Metylacja DNA jest kluczowa dla określenia, czy allele matczyne lub ojcowskie genu podlegającego imprintingowi są ekspresowane, czy wyciszone. U roślin kwitnących w procesie rozmnażania dochodzi do podwójnego zapłodnienia: jedna komórka plemnika zapładnia komórkę jajową, tworząc zarodek, a drugi plemnik łączy się z komórką centralną, dając początek endospermowi. Endosperm jest tkanką, w której u roślin zachodzi imprinting. MEDEA, gen grupy Polycomb z domeną SET, oraz FWA, czynnik transkrypcyjny regulujący kwitnienie, to dwa pierwsze geny, w których wykazano imprinting w endospermie, a ich ekspresja jest kontrolowana przez metylację i demetylację DNA w roślinach. Aby określić status imprintingowy genu i wzorzec metylacji w endospermie, musimy najpierw potrafić go wyizolować. Ponieważ nasiona Arabidopsis są bardzo małe, izolacja endospermu Arabidopsis i badanie jego metylacji pozostają wyzwaniem. W niniejszym protokole wideo opisujemy, jak przeprowadzić krzyżówkę genetyczną, wyizolować tkankę endospermu z nasion oraz określić stan metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

*Arabidopsis thaliana* jest doskonałym organizmem modelowym do badania mechanizmów epigenetycznych. Jednym z powodów jest obecność null mutantów z utratą funkcji DNA...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie statusu metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności emaskulacji rodzica żeńskiego. Następnie rodzic żeński jest zapylany pyłkiem rodzica męskiego.Następnie z zapylonego krzyżowo nasiona wypreparowuje się endosperm. Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie sekwencjonowania DNA endospermu metodą pirosiarczynową. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące status metylacji DNA allelu macierzystego lub ojcowskiego genu zaimprintowanego poprzez analizę polimorfizmu sekwencjonowania DNA w różnych ekotypach oraz sekwencjonowanie pirosiarczynowe.Dzień dobry, jestem dr Yang Shaw z Katedry Biologii na Uniwersytecie w St. Louis. Dzień dobry, jestem Matthew Ray z laboratorium dr. J i Katedry Biologii na Uniwersytecie w St. Louis. Jestem Diman Panu z laboratorium dr. J.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę sekcjowania rugby officer oraz określania statusu metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania sulf-FAR. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania imprintingu genowego regulowanego przez metylację i demetylację DNA. Zapraszamy do oglądania.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wybrać dwa różne ekotypy Arabidopsis, które będą służyć jako rodzice żeński i męski, co pozwoli na rozróżnienie alleli matczynych i ojcowskich dzięki polimorfizmowi sekwencji DNA. W tym przypadku jako rodzice żeński i męski wybrano odpowiednio Columbia zero oraz Landsberg Erecta. Należy zadbać o wybór młodych i zdrowych roślin.Przeprowadź kastrację rośliny żeńskiej przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Zlokalizuj kwiaty w stadium 12 i usuń wszystkie kwiaty lub LIC znajdujące się powyżej i poniżej nich, odcinając nożyczkami podstawę szypułki. Sterylizuj pęsetę, delikatnie zanurzając końcówkę w zlewce z 95%ethanol.Dzięki temu zostaną usunięte wszelkie ziarna pyłku z pęsety i nastąpi ich neutralizacja. Delikatnie rozdziel pąki kwiatowe za pomocą pęsety i ostrożnie usuń cztery przysułki, cztery płatki oraz sześć pręcików, pozostawiając słupek odsłonięty i nienaruszony. Podczas tego procesu należy starać się nie uszkodzić zalążni.Kolejnym krokiem jest wybór dawcy pyłku i przeprowadzenie zapylenia. Najlepszymi dawcami pyłku są kwiaty otwarte w stadium 14, z płatkami rozpostartymi pod kątem 90 stopni względem słupka, w których następuje obfite uwalnianie pyłku. Chwyć kwiat u nasady, tuż nad stopką, co spowoduje pełne otwarcie się kwiatu. Omieć znamię przygotowanego słupka pręcikiem.Po zapyleniu znamię zostanie pokryte żółtym pyłkiem, co można łatwo zaobserwować pod mikroskopem. Po zapyleniu wszystkich wykastrowanych słupków u rośliny, oznacz krzyżówkę za pomocą etykiety jubilerskiej. Uwzględnij datę oraz informacje o rodzicach żeńskim i męskim.Umieść palik w glebie w pobliżu rośliny. Użyj sznurka, aby przywiązać łodygę rośliny do palika, a następnie przykryj zapylone słupki plastikową torebką. Siedem lub osiem dni po zapyleniu (DAP) nasiona powinny być gotowe do zbioru w fazie od środkowej do późnej torpedy embriogenezy i do przeprowadzenia sekcji.W celu pobrania endosperm i zarodka, umieść salic w 8. dniu po zapyleniu (DAP) pod mikroskopem stereologicznym. Za pomocą pęsety przytrzymaj komórkę EK P i użyj końcówki drugiej pęsety, aby rozsunąć otwór na brzegu, w miejscu połączenia dwóch carpali. Użyj pęsety BPS, aby pobrać jedno nasiono i umieścić je na szkiełku przedmiotowym.Następnie wykonaj małe nacięcie na końcu mikropyle, aby wysunąć embrion. Ściśnij nienacięty koniec, aby wypchnąć endosperm i oddzielić go od łuski nasiona. Następnie umieść embrion i endosperm w oddzielnych mikroprobówkach i w ciekłym azocie.Kontynuuj tę czynność, aż z 10 do 15 CLIC zostanie zgromadzona wystarczająca ilość zarodka lub endospermy. Następnie przechowuj probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia traktowania pirosiarczynem. Wyizoluj genomiczne DNA endospermy lub zarodka, stosując procedurę z użyciem bromku trimetyloamoniowego (CTAB).Po wyizolowaniu genomowego DNA endospermy, należy poddać trawieniu 100 nanogramów DNA w reakcji o całkowitej objętości 20 mikrolitrów za pomocą enzymów restrykcyjnych, które tną poza obszarem poddawanym analizie. W przypadku promotora ME stosuje się enzymy restrykcyjne xh, O one ND one oraz PST one. Następnie należy zdenaturować enzymy restrykcyjne poprzez gotowanie DNA przez pięć minut.Następnie zatrzymaj reakcję w lodzie. Dodaj jedną dziewiątą objętości, czyli 2,2 µL wodorotlenku sodu o stężeniu 3 M, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po inkubacji przenieś roztwór do probówki PCR o pojemności 250 µL.Następnie przygotuj 6,24 M roztwór mocznika i 4 M roztwór pirosiarczynu sodu, rozpuszczając 7,5 g mocznika w 10 ml sterylnej wody destylowanej, powoli dodając 7,6 g pirosiarczynu sodu w ciągu jednej do dwóch godzin podczas podgrzewania i mieszania roztworu. Po rozpuszczeniu dostosuj pH do poziomu 5 za pomocą świeżo przygotowanego 10 M wodorotlenku sodu.Dodać sterylną wodę destylowaną do uzyskania objętości końcowej 20 milliliters. Przenieść 208 microliters tego roztworu do 22.2 microliters zdenaturowanego genomowego DNA endospermy. Następnie dodać 12 microliters świeżo przygotowanej hydrochinonu o stężeniu 10 millimolar do DNA.Przeprowadzić konwersję pirosiarczynową w termocyklerze, stosując 30 cykli: 55°C przez 15 minut, a następnie 95°C przez 30 sekund. Następnie odsolić DNA poddane konwersji pirosiarczynowej, używając systemu oczyszczania DNA Wizard z firmy Promega. Zgodnie z instrukcją producenta, zmierzyć dokładną objętość buforu TE odzyskanego z kolumny po odsoleniu.Następnie dodaj wodorotlenek sodu 6,3 M do uzyskania stężenia końcowego 0,3 M. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po inkubacji dodaj octan amonu 10 M do stężenia końcowego 3 M, 2 µL tRNA o stężeniu 20 µg/µL oraz trzy objętości 100% etanolu.Wymieszaj próbkę i wiruj przez 15 minut przy 14 000 RPM. Przemyj osad raz 70% ethanol, a następnie krótko wiruj, aby usunąć nadmiar etanolu. Na koniec wysusz osad w SpeedVac przez pięć minut i resuspenduj w 25 µL buforu TE.DNA traktowany cyjankiem sodu jest teraz gotowy do analizy PCR. Aby zsekwencjonować czterokilobazowy promotor Madea, zaprojektowano wiele zestawów starterów i namnożono 14 fragmentów nakładających się, aby pokryć cały ten region. Należy rozpocząć od zaprojektowania starteru forward do sekwencjonowania nici górnej.Najpierw należy wybrać region bogaty w guaninę, aby uzyskać wyższą temperaturę prażania bez konieczności stosowania nadmiernie długich nukleotydów w starterach. Następnie należy zamienić cytozynę na periynę w kontekstach CG i CN G. Potem należy zamienić każdą pozostałą cytozynę na tyminę.Projektując primer odwrotny, należy wybrać region bogaty w cytozynę. Zamień guaninę na purynę w kontekście CG i CNG oraz każdą inną guaninę na adeninę. Aby ponownie zsekwencjonować nić dolną, rozpocznij od zaprojektowania primera bezpośredniego.Wybierz region bogaty w cytozynę i zamień guaninę na purynę w kontekstach CG i CNG. Pozostałe guaniny zamień na adeninę. Projektując primer odwrotny, wybierz region bogaty w AINE.Zastąp cytozynę parydyną w kontekstach CG i CNG, a pozostałe cytozyny zamień na tyminę. Po zaprojektowaniu starterów przygotuj reakcję PCR, wykorzystując 2 µL DNA poddanego działaniu pirosiarczynu sodu jako matrycy dla każdej amplifikacji PCR. Przeprowadź reakcję PCR i przeanalizuj produkt za pomocą elektroforezy w żelu, aby potwierdzić prawidłową wielkość fragmentu.Kolejny żel. Produkt PCR należy oczyścić i sklonować do wektora klonującego Invitrogen topo TA PCR 2.1. Jako wstawkę i sekwenowanie poszczególnych klonów, zasada sekwenowania pirosiarczynowego polega na tym, że niezmetylowana cytozyna zostanie przekształcona w uracyl w wynikuy deaminacji hydrolitycznej pod wpływem wysokiego stężenia pirosiarczynu sodu przy pH 5,0.Z kolei 5-metylocytozyna nie zostanie zmodyfikowana przez siarczyn sodu. Uracyl zostanie powielony jako tymina w produkcie PCR, natomiast zmetylowana cytozyna pozostanie cytozyną po amplifikacji PCR. Po uzyskaniu wyniku sekwencjonowania należy porównać go z matrycą specyficzną dla nici, która została użyta do amplifikacji PCR.Jeśli reszta cytozyny w matrycy odczytana jest jako tymina w wyniku sekwencjonowania, wskazuje to, że cytozyna nie jest zmetylowana. Jeśli reszta cytozyny w matrycy pozostaje cytozyną w wyniku sekwencjonowania, oznacza to, że cytozyna jest zmetylowana. Przedstawiono status metylacji macierzyńskiego allelu MEA w regionie minus 500 par zasad promotora MEA dla pięciu zmetylowanych miejsc CpG w sekwencjonowanych klonach endospermy krzyżówki Columbia, g Clarus z RLD; zmetylowane cytozyny zaznaczono czarnymi wypełnionymi kółkami, a niezmetylowane cytozyny białymi pustymi kółkami. Analogicznie przedstawiono status metylacji macierzyńskiego allelu Madea w zarodku krzyżówki Columbia, Gladys z RLD.Właśnie pokazaliśmy, jak izolować endosperm i przeprowadzać sekwencjonowanie siarczynowe podczas realizacji tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o prawidłowym przestrzeganiu protokołu. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w Arabidopsis bielma

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA jest metodą opartą na przeciwciałach, używaną do wzbogacania metylowanych fragmentów RNA. W połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem prowadzi to do identyfikacji transkryptów przenoszących modyfikację m5C.

Test immunoprecypitacji metylowanego RNA do badania modyfikacji m5C u Arabidopsis

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Poznaj metodę oznaczania metylacji DNA genów wdrukowanych w bielmie Arabidopsis thaliana. Protokół obejmuje izolację bielma, sekwencjonowanie bisulfitowe i analizę statusu metylacji alleli.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów