Name: Przygotowanie ostrych wycinków hipokampa od szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Poznaj metodę przygotowania ostrych wycinków hipokampa od starych szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace wspierane przez grant NIH AG027297, nagrodę z Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust oraz darowiznę z Kleberg Foundation.

<ol><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase%2Fphosphatase+activities+parallel+reduced+synaptic+strength+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging.</a> J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+and+long-term+potentiation+reversal+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging.</a> J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).</li>
<li>Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+%27zipper%27+slice+studies+reveal+a+necessary+role+for+calcineurin+in+the+increased+activity+of+L-type+Ca%282%2B%29+channels+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging.</a> Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).</li>
<li>Burke, S. N., Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+synapses+and+hippocampal+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics.</a> Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+and+modulation+of+synaptic+plasticity+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain.</a> Aging Cell. 6, 319-325 (2007).</li>
<li>Foster, T. C., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+Ca%282%2B%29-dependent+processes%3A+relation+to+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity.</a> Hippocampus. 7, 602-612 (1997).</li>
<li>Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+calcium+hypothesis+of+brain+aging+and+Alzheimer%27s+disease%3A+minding+the+store%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store.</a> Aging Cell. 6, 307-317 (2007).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+amyloid+toxicity+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease.</a> J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).</li>
<li>Green, K. N., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+calcium+to+Abeta+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease.</a> Neuron. 59, 190-194 (2008).</li>
<li>Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+effects+on+the+limits+and+stability+of+long-term+synaptic+potentiation+and+depression+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1.</a> J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+age-related+alterations+in+synaptic+plasticity+by+blockade+of+L-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+afferent+function+and+synaptic+strength+in+hippocampal+CA1+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury.</a> J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).</li>
<li>Sama, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-dependent+signaling+between+astrocytes+and+neurons+depends+critically+on+astrocytic+calcineurin%2FNFAT+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity.</a> J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).</li>
<li>Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+large-conductance+Ca%282%2B%29-activated+K%28%2B%29+channels+depresses+basal+synaptic+transmission+in+the+hippocampal+CA1+area+in+APP+%28swe%2Find%29+TgCRND8+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice.</a> Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).</li>
<li>Bear, M. F., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity%3A+LTP+and+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity: LTP and LTD.</a> Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+hippocampal+synaptic+plasticity+in+age-related+memory+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline.</a> Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).</li>
<li>Foster, T. C., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+is+associated+with+impaired+memory+in+aged+Fischer+344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats.</a> Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).</li>
<li>Hsu, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase+and+phosphatase+activities+and+age-related+impairments+of+synaptic+transmission+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation.</a> Hippocampus. 12, 787-802 (2002).</li>
<li>Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+suppresses+expression+of+long-term+depression+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats.</a> Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).</li>
<li>Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFATs+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">NFATs and Alzheimer's Disease.</a> Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).</li>
<li>Abdul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+is+associated+with+selective+changes+in+calcineurin%2FNFAT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling.</a> J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).</li>
<li>Anantharaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+mediated+nitration+of+manganese+superoxide+dismutase%3A+implication+for+oxidative+stress+in+a+APPNLH%2FNLH+X+PS-1P264L%2FP264L+double+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).</li>
<li>Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+a+APP%2FPS1+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease+is+impaired+in+old+but+not+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice.</a> PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).</li>
<li>Stringer, J. L., Lothman, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+extracellular+calcium+concentrations+on+hippocampal+pyramidal+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses.</a> Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).</li>
<li>Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+high+Mg2%2B-to-Ca2%2B+ratios+on+frequency+potentiation+in+hippocampal+slices+of+young+and+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats.</a> J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NA%2C+K%2C+CA%2C+MG%2C+AND+C1+CONCENTRATIONS+IN+CHOROID+PLEXUS+FLUID+AND+CISTERNAL+FLUID+COMPARED+WITH+PLASMA+ULTRAFILTRATE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE.</a> J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).</li>
<li>Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+simultaneous+emergence+of+multiple+hippocampal+biomarkers+of+aging+is+mediated+by+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).</li>
<li>Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+postsynaptic+%5BCa2%2B%5Di+and+L-type+calcium+channel+activity+in+aged+hippocampal+neurons%3A+relationship+to+impaired+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity.</a> J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).</li>
<li>Thibault, O., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+single+L-type+calcium+channels+in+hippocampal+neurons+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging.</a> Science. 272, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+IP3+signaling+in+cortical+neurons+of+knock-in+mice+expressing+an+Alzheimer%27s-linked+mutation+in+presenilin1+results+in+exaggerated+Ca2%2B+signals+and+altered+membrane+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability.</a> J Neurosci. 24, 508-513 (2004).</li>
<li>Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ryanodine+receptor+recruitment+contributes+to+Ca2%2B+disruptions+in+young%2C+adult%2C+and+aged+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).</li>
<li>Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-independent+long-term+depression+correlates+with+successful+aging+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats.</a> Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).</li>
<li>McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+enhancement+in+fascia+dentata%3A+cooperativity+among+coactive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents.</a> Brain Res. 157, 277-293 (1978).</li>
</ol>

Produkcja tego artykułu wideo została sponsorowana przez Leica Microsystems.

Kroki opisane w niniejszym protokole pomogą zapewnić, że sekcje mózgu będą przeprowadzane co najmniej tak szybko i efektywnie u szczurów starych, jak i u młodych osobników dorosłych. Przedstawiamy również wystarczającą liczbę szczegółów, aby początkujący badacz mógł samodzielnie przygotować badania skrawków w zakresie LTP i LTD. Jeśli jednym z Państwa celów jest dalsze badanie procesów starzenia oraz zmian w chorobie Alzheimera (AD) w zakresie funkcji i plastyczności synaptycznej, istnieją co najmniej dwa inne problemy metodologiczne, wspomniane powyżej, które zasługują na dalsze rozważenie. Po pierwsze, kilka laboratoriów wykazało, że stosunek Ca2+:Mg2+ w stosowanym podczas rejestracji ACSF może mieć wyraźny wpływ na indukcję plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa2,10,24,25. W płynie mózgowo-rdzeniowym ssaków stosunek Ca2+:Mg2+ wynosi w przybliżeniu jeden (np. patrz 26). Jednak w badaniach funkcji i plastyczności synaptycznej na skrawkach powszechnie stosuje się stosunki Ca2+:Mg2+ w ACSF bliższe wartości 2. W wczesnych badaniach praktyka ta została prawdopodobnie wprowadzona w celu optymalizacji indukcji LTP, a następnie stała się rutynowa dla wszystkich badań plastyczności. Może to być jednak problematyczne w badaniach nad starzeniem i AD ze względu na dobrze opisane różnice w neuronalnej regulacji Ca2+. W szczególności, napływ Ca2+ i/lub indukowane przez Ca2+ uwalnianie Ca2+ jest zwiększone u starych szczurów i/lub myszy w modelach AD podczas aktywacji neuronalnej3,27-31. Indukcja LTD jest szczególnie wrażliwa na subtelne zmiany poziomu Ca2+ w ACSF. Nasz protokół, w którym zastosowano 2mM Ca2+ i 2mM Mg2+, zazwyczaj prowadzi do wystąpienia LTD u zwierząt starych, ale nie u młodych osobników dorosłych2, podczas gdy w badaniach przy stosunku Ca2+:Mg2+ bliższym dwóm obserwowano silne LTD u osobników dorosłych bez różnic związanych z wiekiem2,10 lub przy jednoczesnym zmniejszeniu LTD u starych szczurów32. Obserwacje te podkreślają konieczność uważnego rozważenia poziomów Ca2+ i Mg2+ w ACSF podczas porównywania plastyczności zależnej od Ca2+ u zwierząt starych i młodych osobników dorosłych.
Drugi problem metodologiczny dotyczy silnej zależności LTP od depolaryzacji postsynaptycznej33 oraz możliwych różnic w sile synaptycznej wynikających z wieku lub genotypu. W typowym eksperymencie LTP intensywność stymulacji bazowej oraz stymulacji LTP jest zazwyczaj dostosowywana tak, aby uzyskać połowiczną (lub trzyczwartową) maksymalną amplitudę EPSP. Potencjalnym problemem jest to, że stare szczury oraz myszy APP/PS1 zazwyczaj wykazują zmniejszoną siłę synaptyczną w porównaniu z młodszymi i/lub dzikimi odpowiednikami, co oznacza, że wartości bazowe EPSP będą również niższe u starych szczurów i myszy APP/PS1. Mniejsze EPSP mogą przekładać się na słabszą depolaryzację podczas stymulacji LTP, co skutkuje zmniejszoną prawdopodobieństwem wywołania LTP33. Ze względu na ten potencjalny czynnik zakłócający trudno jest ustalić, czy zwierzęta te wykazują deficyt przepustowości, deficyt plastyczności, czy obie te cechy. Oznacza to, że mechanizmy indukcji LTP u starych i/lub myszy APP/PS1 mogą być funkcjonalnie sprawne (brak deficytu plastyczności), ale niewystarczająco stymulowane (deficyt przepustowości) w tych warunkach. Rozróżnienie to jest krytyczne, ponieważ mechanizmy przepustowości i mechanizmy plastyczności mogą reagować w bardzo różny sposób na konkretne leczenie farmakologiczne. Staramy się zminimalizować wpływ zmniejszonej przepustowości na indukcję LTP poprzez normalizację amplitudy EPSP do tego samego poziomu (np. 1 mV) we wszystkich skrawkach przed stymulacją LTP. Skuteczne mogą być również inne strategie (np. zastosowanie zacisku napięcia lub prądu w celu wyrównania potencjału błonowego między grupami podczas stymulacji LTP), które należy rozważyć podczas badania LTP w tych modelach zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (jednodstawkowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (dwuwodzian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; (dekstroza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Wymagane odczynniki</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000 FB-500-1000</td><td></td></tr><tr><td>Napowietrzacz akwariowy</td><td></td><td></td><td>Służy do napowietrzania pożywek. Dostępny w większości sklepów zoologicznych</td></tr><tr><td>Szklany zlewka 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540G</td><td>Do przechowywania mózgu w ACSF</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Gilotyna do małych zwierząt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>DCAP-M</td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel chirurgiczny Feather #11</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td></td></tr><tr><td>Nożyce kostne Beebee</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki Lempert Rongeurs</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-8321</td><td>Stosować dla szczurów</td></tr><tr><td>Kleszczyki Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16020-14</td><td>Stosować dla myszy lub szczurów</td></tr><tr><td>Narzędzie do hipokampa</td><td>Fine Science Tools</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka</td><td></td><td></td><td>Wystarczy plastikowa łyżeczka</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>Szpatułka</td></tr><tr><td>Chirurgiczne nożyczki irydowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-43</td><td></td></tr><tr><td>papier filtracyjny Whatman 110 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805E</td><td>Whatman kat. 1001-110</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.leica-microsystems.com/products/total-histology/sectioning/vibrating-blade-microtomes/">Manualny mikrotom wibrotom Leica VT1000P&lt;/a&gt;</td><td>Wibrotom</td><td>VT1000P</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze Feather S FA-10 0,1 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-9</td><td>Ostrze Feather S FA-10 0,1 mm</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura z borokrzemianu (z gumową gruszką)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Do przenoszenia skrawków: końcówka jest odłamywana i wypalana w celu powiększenia otworu</td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka hodowlana 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Używana do zbierania skrawków po sekcji</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Narzędzia i materiały do sekcji</td></tr><tr><td>Komora utrzymująca</td><td>Wykonana na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horyzontalny wyciągacz pipet P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Wykonana na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka aspiracyjna Pyrex z bocznym wylotem na dole</td><td>Corning</td><td>1220-1L</td><td></td></tr><tr><td>Grawitacyjny zestaw do infuzji IV z regulatorem</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>2C8891</td><td></td></tr><tr><td>Centralna linia próżniowa</td><td></td><td></td><td>Dostępna w większości nowoczesnych laboratoriów</td></tr><tr><td>Mieszanina gazowa 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott-Gross Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody laboratoryjne TygonTM do podawania O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Nietoksyczne, nieutleniające, dostępne w różnych rozmiarach.</td></tr><tr><td>Mikroskop Eclipse E600FN</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>z obiektywami 10x i 40x, filtrem bliskiej podczerwieni oraz filtrami GFP i DS-Red2</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera Cool Snap ES</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Cyfrowa kamera Cool Snap ES</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny iluminator X-Cite</td><td>EXFO</td><td></td><td>Fluorescencyjny iluminator X-Cite</td></tr><tr><td>Platforma mikroskopowa</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td>Złożona na zamówienie</td></tr><tr><td>Zanurzalna komora rejestracyjna RC-22</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0228</td><td>Wymaga platformy P-1 i adaptera stolika (Produkt nr 64-0277 firmy Warner)</td></tr><tr><td>Kontroler temperatury TC2BIP 2/3Ch</td><td>Cell Microcontrols</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-osiowy manualny manipulator miniaturowy</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowo-irydowy (0,002 in)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PTT0203</td><td></td></tr><tr><td>Izolator bodźców A365</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>A365 Stimulus Isolator</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Multiclamp 700b</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik A/C Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie PClamp</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komputer osobisty (Pentium 4)</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Sprzęt i materiały do elektrofizjologii</td></tr></tbody></table>

przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Przygotowanie preparatu skrawka hipokampa gryzoni jest prawdopodobnie najszerzej stosowanym narzędziem do badania funkcji i plastyczności synaptycznej ssaków. Hipokamp można szybko i łatwo wyizolować z organizmów szczurów i myszy, a skrawki pozostają żywotne przez wiele godzin w natlenionym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym. Ponadto podstawowe techniki elektrofizjologiczne są łatwo stosowalne w badaniach funkcji synaptycznej w skrawkach hipokampa i dostarczyły jednych z najlepszych biomarkerów upośledzenia funkcji poznawczych. Skrawki hipokampa są szczególnie popularne w badaniu mechanizmów plastyczności synaptycznej zaangażowanych w uczenie się i pamięć. Zmiany w indukcji długotrwałego wzmocnienia i osłabienia (LTP i LTD) wydajności synaptycznej w skrawkach hipokampa (lub ich brak) są często wykorzystywane do opisu fenotypu neurologicznego zwierząt z upośledzeniem poznawczym i/lub do oceny mechanizmu działania związków nootropowych. Niniejszy artykuł opisuje procedury wykorzystywane przez nas do przygotowania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i chorobą Alzheimera (AD)1-3. Stosowanie starych szczurów i myszy będących modelami AD może stawiać przed badaczami, przyzwyczajonymi do pracy z młodszymi szczurami i/lub myszami, zestaw specyficznych wyzwań. Starsze szczury mają grubsze czaszki i twardszą tkankę łączną niż młodsze szczury i myszy, co może opóźnić ekstrakcję i/lub sekcję mózgu, a w konsekwencji zniwelować lub wyolbrzymić rzeczywiste różnice wiekowe w funkcji i plastyczności synaptycznej. Starzenie się oraz patologia amyloidowa mogą również nasilać uszkodzenia hipokampa powstałe podczas procedury sekcji, co ponownie komplikuje wnioski wyciągane z oceny fizjologicznej. W niniejszej pracy omawiamy kroki podjęte podczas procedury sekcji w celu zminimalizowania tych problemów. Przedstawiono przykłady odpowiedzi synaptycznych uzyskanych w skrawkach „zdrowych” i „chorych” szczurów oraz myszy, a także reprezentatywne eksperymenty dotyczące plastyczności synaptycznej. Omówiono również możliwy wpływ innych czynników metodologicznych na funkcję synaptyczną w tych modelach zwierzęcych (np. skład roztworu rejestracyjnego, parametry stymulacji). Choć głównym tematem artykułu jest wykorzystanie starych szczurów i myszy transgenicznych, osoby początkujące w fizjologii skrawków powinny znaleźć tutaj wystarczająco dużo szczegółów, aby rozpocząć własne badania z wykorzystaniem różnych modeli gryzoni.

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Przygotowanie skrawków hipokampa gryzoni jest prawdopodobnie najszerzej stosowanym narzędziem do badania funkcji i plastyczności synaptycznej u ssaków. ...

Przekroje hipokampa gryzoni są często wykorzystywane w badaniach nad funkcją i plastycznością synaptyczną ssaków. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół pozyskiwania i badania przekrojów od starszych szczurów i myszy, które charakteryzują się grubszą czaszką i twardszą tkanką łączną niż młodsze osobniki. Cechy te mogą opóźnić proces wyjęcia i lub sekcji mózgu, co w konsekwencji może zniwelować lub wyolbrzymić rzeczywiste różnice wiekowe w funkcji i plastyczności synaptycznej.Ponadto starzenie się oraz patologia amyloidowa mogą nasilać uszkodzenia hipokampa powstałe podczas procedury sekcji, co dodatkowo utrudnia wyciąganie wniosków z oceny fizjologicznej. W niniejszej demonstracji omawiamy kroki podjęte podczas procedur ekstrakcji i sekcji w celu zminimalizowania tych problemów. Po pierwsze, mózg jest szybko ekstrahowany i umieszczany w schłodzonym, sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym o niskiej zawartości wapnia.Następnie pola hipokampa są delikatnie usuwane na chłodzonej lodem platformie do sekcji, a skrawki hipokampa są przygotowywane przy użyciu wibrotomu i inkubowane w natlenionym płynie A CSF zawierającym wapń. Na koniec wywołuje się potencjały i prądy synaptyczne w wielu podregionach hipokampa i rejestruje; uzyskane wyniki wykazują wpływ starzenia się i/lub patologii typu alzheimerowskiego na funkcję i plastyczność synaptyczną. Właściwe zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla zrozumienia związanego z wiekiem pogorszenia funkcji poznawczych oraz otępienia spowodowanego chorobą Alzheimera.Dzieje się tak, ponieważ dysfunkcja synaptyczna należy do jednych z najwcześniejszych biomarkerów tych objawów klinicznych, co demonstruje niniejsza procedura. Dziś wystąpi dr Chris Norris, kierownik laboratorium, stojąc obok dużego zlewu. Przygotuj obszar sekcyjny do usunięcia mózgu i wyizolowania hipokampa.Przygotuj złożony ręcznik papierowy, ostrze skalpela nr 11, nożyczki BB, kleszczyki kostne oraz narzędzie do hipokampa, będące specjalistyczną podwójną szpatułką z zestawu precyzyjnych narzędzi chirurgicznych. Umieść również małe nożyczki chirurgiczne, cienką szpatułkę, plastikową pipetę Pasteura, papier filtracyjny Watman, szklaną szalkę Petriego o średnicy 100 mm wypełnioną lodem, plastikową łyżeczkę oraz zlewkę z częściowo rozmrożonym roztworem bezwapniowym. Płyn CSF przykryty param.Po zdekapitowaniu szczura mózg należy wyciąć tak szybko, jak to możliwe. Umieść głowę na ręczniku papierowym i za pomocą skalpela wykonaj szybkie nacięcie na środku skóry głowy, od kości nosowej do kości potylicznej.Należy upewnić się, że mięśnie skórne zostały przecięte całkowicie, aby w pełni odsłonić szwy czaszki. Mocno przytrzymaj głowę i przetnij kości potyliczne, ciemieniowe i czołowe wzdłuż szwu pośrodkowego. Pamiętaj, aby trzymać dolne ostrze nożyc ściśle przy wewnętrznej powierzchni czaszki, z dala od mózgu.Jest to kluczowe, aby zapobiec przypadkowemu wyrwaniu tkanki. Następny slajd. Wsuń szczypce Ron pod lewą płytkę ciemieniową i zaciśnij szczęki, obracając je w górę i do przodu, aby odsunąć płytki ciemieniową i potyliczną.W razie potrzeby użyć kleszczyków Rona, aby usunąć również lewą płytkę czołową. Powtórzyć czynność dla drugiej półkuli. Po odsunięciu płytek użyć kleszczyków Rona lub nożyczek, aby delikatnie odciągnąć lub odciąć wszelką oponę twardą, która może być przytwierdzona do płytek skroniowych i rozciągnięta na powierzchni mózgu.Następnie wsuń rurki Ron pomiędzy mózg a prawą płytkę skroniową, wywierając nacisk w kierunku czaszki, z dala od mózgu. Ściśnij i odkręć płytkę skroniową, aż do momentu usłyszenia lub wyczucia trzasku. Powtórz czynność po lewej stronie.Wsuń szeroką szpatułkę przed narzędzie do hipokampa pomiędzy powierzchnię brzuszną mózgu a dolne płytki czaszki, aż znajdzie się ona całkowicie pod mózgiem. Przesuwaj ją bocznie od strony do strony oraz do przodu i do tyłu kilka razy, aby przeciąć nienaruszone nerwy czaszkowe, posługując się narzędziem do hipokampa. Wyjmij mózg i zanurz go w bezwapniowym płynie A CSF, przykrywając go Parafilmem, i pozostaw do schłodzenia przez około jedną minutę.Aby wypreparować hipokampy, należy za pomocą łyżeczki wyjąć mózg z płynu CSF, a następnie umieścić go na zwilżonym płynem CSF papierze Watman na pokrywie lodowatej szalki Petriego. Używając ostrza skalpela, usuń móżdżek oraz około jednej czwartej rostralnych płatów czołowych. Następnie przetnij szczelinę wewnątrzhemisferyczną, aby całkowicie rozdzielić obie półkule.Umieść jedną półkulę z powrotem w zawiesinie A CSF, a drugą ustaw pionowo na stole sekcyjnym tak, aby płaszczyzna wieńcowa płata czołowego była skierowana w dół; biały pień mózgu i śródmózowie powinny być łatwo odróżnialne od różowej lub szarej kory nadległej. Zlokalizuj wzgórza w śródmózowiu. Będą one wyglądać jak dwa białe guzki znajdujące się w górnej części mózgu.W tej orientacji delikatnie przytrzymaj śródmózowie nożyczkami i wsuń szpatułkę pomiędzy kalosy a korę. Następnie ostrożnie odsuń pień mózgu, śródmózowie i wzgórze. Może być konieczne przecięcie tkanki łącznej lub naczyń krwionośnych za pomocą nożyczek.Użyj ostrej krawędzi szpatułki, aby przeciąć forging (fornix) – biały pęczek włókien znajdujący się w przednio-grzbietowej części hipokampa. Następnie, używając nożyczek, delikatnie odsuń pień mózgu, śródmózgowie i wzgórze, nie oddzielając ich całkowicie od reszty mózgu.W tej orientacji powinny być teraz widoczne białe pasma włókien, które tworzą płytką hiperbolę u podstawy hipokampa. Za pomocą pipety transferowej delikatnie wpuść nieco A CSF w szczelinę pod FIA, aby ułatwić oddzielenie hipokampa od kory. Delikatnie wsuń szpatułkę w tę szczelinę i, trzymając mocno nożyczkami pień mózgu, śródmózowie i wzgórze, delikatnie odroluj hipokamp, a następnie ostrożnie odetnij pozostałą korę, naczynia krwionośne i białą substancję z obszaru hipokampa.Przepłucz kilkoma mililitrami A CSF. Używając pipety transferowej, utrzymuj tkankę w stanie wilgotnym i chłodnym, stosując zawiesinę CSF (CSF slushy). Następnie usuń drugą półkulę i powtórz sekcję, aby wyciąć przekroje hipokampa szczura.Napełnij zbiornik vibratomu lodowatym, wolnym od wapnia A CSF w taki sposób, aby platforma tnąca i ostrze były całkowicie zanurzone. Użyj skalpela, aby odciąć przednią i tylną końcówkę każdego hipokampa, a następnie ustaw je razem powierzchniami przednimi tak, aby zakręty zębate każdego z hipokampów były skierowane ku sobie. Przyklej tkankę mózgową do bloku montażowego i przenieś ją na platformę tnącą vibratomu.W przypadku eksperymentów z fizjologii synaptycznej zaleca się stosowanie przekrojów o grubości 400 mikrometrów. Używając pipety transferowej z szerokim otworem, przenieś skrawki do małej szalki Petriego zawierającej lodowaty, wolny od wapnia płyn CSF.Po zakończeniu krojenia plastry przenosi się do komory przechowawczej wypełnionej natlenionym A CSF zawierającym wapń. Stopniowo podnosi się temperaturę w komorze z 27°C do 32°C w celu przeprowadzenia podstawowych rejestracji zewnątrzkomórkowych. W przypadku plastrów ostrych komorę rejestrującą ustawia się na stoliku mikroskopu w taki sposób, aby podgrzany A CSF był doprowadzany grawitacyjnie przez regulator przepływu i odprowadzany centralną linią próżniową.Za pomocą małego pędzla przenieś skrawek do komory rejestracyjnej w taki sposób, aby był zanurzony w A CSF i spoczywał na włożonej siatce. Pozostaw skrawek do aklimatyzacji na 10 do 15 minut. Podczas aklimatyzacji skrawka włącz stymulator lub izolator bodźców i ustaw wyjście na zero.Następnie umieść elektrodę stymulującą nad skrawkiem w obszarze stratum radiatum ca2, w pobliżu granicy z ca3. Opuść elektrodę rejestrującą do stratum radiatum ca1, tak aby zaledwie przebiła powierzchnię skrawka. Ustaw wyjście stymulatora na umiarkowany poziom.Izolator bodźca ustawia się na około 150 µA. Powoli opuszczaj elektrodę stymulującą w niewielkich odstępach, aż do momentu zarejestrowania artefaktu bodźca. W obszarze CA1 kontynuuj powolne opuszczanie obu elektrod — stymulującej i rejestrującej — w odstępach, jednocześnie rejestrując odpowiedzi z obszaru CA1.Ustal krzywą siły synaptycznej, korzystając z programu do akwizycji danych, takiego jak clamp X, aż amplitudy salwy włókien oraz pobudzeniowego potencjału postsynaptycznego osiągną wartości maksymalne. Następnie użyj oprogramowania do dostarczenia bodźców o różnych intensywnościach i zarejestruj odpowiadającą im aktywność w ca one. Zakres i liczba poziomów intensywności bodźców powinny być wystarczające do wygenerowania krzywej sygmoidalnej po naniesieniu ich na wykres w odniesieniu do wartości FV lub EPSP.Następnie, aby zbadać plastyczność synaptyczną, należy dostosować natężenie bodźca dla każdego skrawka tak, aby wywołać odpowiedź o wartości jednego milivolta. Rozpocznij stymulację bazową z częstotliwością 0,033 hertz EPSP. Wartości nachylenia powinny być stabilne przez co najmniej 20 minut przed indukcją długotrwałego wzmocnienia synaptycznego LTP lub długotrwałego osłabienia synaptycznego LTD.Aby zarejestrować okres bazowy, należy użyć pliku parametrów clamp X, aby stymulować i rejestrować sygnał co 30 sekund. Następnie, aby wywołać LTP, należy otworzyć osobny plik parametrów i zastosować stymulację w postaci serii 100 Hz trwającej jedną sekundę lub dla indukcji LTD – wielokrotne krótkie serie stymulacji 200 Hz podawane co 200 milisekund. Należy podać 900 impulsów stymulujących z częstotliwością 1 Hz.Po serii stymulacji powróć do pliku parametrów bazowych i rejestruj odpowiedzi synaptyczne przez 60 minut lub dłużej. Porównaj wartości nachylenia EPSP uzyskane przed i 60 minut po stymulacji wysoką i niską częstotliwością, aby stwierdzić obecność LTP, objawiającej się wzrostem siły synaptycznej, lub LTD, objawiającej się jej spadkiem. Powszechnie uważa się, że oba procesy odzwierciedlają kluczowe mechanizmy uczenia się i pamięci.Poniżej przedstawiono reprezentatywne krzywe siły synaptycznej z dwóch różnych przekrojów hipokampa pobranych od dwóch myszy A PP PS.One. Jedna mysz została potraktowana nowym przeciwzapalnym reagentem w postaci wirusa towarzyszącego adenowirusom. Druga została potraktowana kontrolnym reagentem wirusowym.Można to zaobserwować, gdy w różnych warunkach doświadczalnych aktywowane jest podobne number włókien presynaptycznych. Gdy grupy wykazują podobne amplitudy FV, co zaznaczono na osi x, krzywa dla skrawka traktowanego odczynnikiem a jest przesunięta w lewo, co wskazuje na większe amplitudy EPSP. Dane te dowodzą, że bazowa siła synaptyczna jest większa w prezentowanym skrawku traktowanym odczynnikiem a.Poniżej przedstawiono wyniki eksperymentów LTP przeprowadzonych na tych samych przekrojach. Należy zauważyć, że wartości nachylenia EPSP w przekroju z odczynnikiem a są znacznie większe w stosunku do przekroju kontrolnego podczas jednej godziny pomiaru bazowego po zastosowaniu stymulacji o częstotliwości 100 hertz, co wskazuje na obecność LTP w przekroju z odczynnikiem a, a nie w przekroju kontrolnym. Rysunek ten pokazuje kształt fal EPSP w przekrojach mysich z odczynnikiem A i kontrolnych przed oraz 60 minut po zastosowaniu stymulacji o częstotliwości 100 hertz.Zwiększenie nachylenia EPSP w okresie po stymulacji 100 Hz jest bardzo wyraźne w skrawku z odczynnikiem a, co wskazuje na wystąpienie LTP. Eksperymenty przedstawione na dotychczasowych rycinach wskazują, że odczynnik A zwiększa siłę synaptyczną i łagodzi deficyty LTP. W przypadku myszy PP PS one podobne eksperymenty przeprowadzono na LACS hipokampa starszych szczurów.Tutaj przedstawiono krzywe siły synaptycznej z dwóch różnych przekrojów hipokampa szczura traktowanego nowym lekiem przeciwzapalnym oraz innego szczura traktowanego kontrolnym odczynnikiem nośnikiem. Należy zauważyć, że krzywe te są bardzo podobne dla obu przekrojów, co wskazuje, że lek A ma niewielki wpływ na podstawową siłę synaptyczną. Rysunek ten przedstawia wyniki eksperymentów LTD przeprowadzonych na tych samych przekrojach.Należy zauważyć, że typowe dla starszych szczurów wartości nachylenia EPSP w skrawku traktowanym nośnikiem są obniżone w trakcie godzinnej linii bazowej po podaniu stymulacji o częstotliwości 1 Hz. Jednakże wartości nachylenia EPSP w skrawku z lekiem A wykazują niewielką lub żadną depresję, co wskazuje na brak LTD. Przedstawiono tutaj przebiegi EPSP ze skrawków szczurzych z leku A oraz nośnika przed i 60 minut po podaniu stymulacji o częstotliwości 1 Hz. Zmniejszenie nachylenia EPSP w okresie po stymulacji 1 Hz jest bardzo wyraźne w skrawku z nośnikiem, ale nie w skrawku z lekiem A.Wyniki przedstawione na tych rysunkach wykazują, że lek a niweluje różnice w plastyczności u starszych szczurów poprzez blokowanie indukcji LTD, lecz nie wpływa na podstawową funkcję synaptyczną. Dane te pokazują, że wiele parametrów funkcji synaptycznej i plastyczności u starszych szczurów oraz myszy w modelu choroby Alzheimera może być modulowanych poprzez zastosowanie eksperymentalnych terapii, co podkreśla użyteczność ostrych skrawków hipokampa w badaniu potencjału nootropowego i/lub neuroprotekcyjnego nowych leków i reagentów eksperymentalnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować równowagę między szybkością wypreparowania mózgu a precyzją i delikatnością podczas dyssekcji, krojenia i manipulowania hipokampem na potrzeby pomiarów elektrofizjologicznych.

preparation-acute-hippocampal-slices-from-rats-transgenic-mice-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie ostrych kroków hipokampu u szczurów i transgenicznych myszy w celu badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowych

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metodę przygotowania ostrych wycinków hipokampa od starych szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidu.

Przygotowanie ostrych wycinków hipokampa od szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidu (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Przeglądaj więcej filmów