Przygotowanie ostrych wycinków hipokampa od szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidu

Wycinki hipokampa gryzoni są często wykorzystywane w badaniach funkcji synaptycznych i plastyczności ssaków. Tutaj demonstrujemy protokół uzyskiwania i badania plasterków od starszych szczurów i myszy, które mają grubsze czaszki i twardszą tkankę łączną niż młodsze szczury i myszy. Cechy te mogą opóźniać ekstrakcję i / lub sekcję mózgu, a w konsekwencji negować lub wyolbrzymiać rzeczywiste różnice wiekowe w funkcji synaptycznej i plastyczności.

Ponadto starzenie się i patologia amyloidu mogą nasilać uszkodzenia hipokampa odniesione podczas procedury sekcji, co dodatkowo komplikuje wszelkie wnioski wynikające z oceny fizjologicznej. W tej demonstracji omawiamy kroki podejmowane podczas procedur ekstrakcji i sekcji w celu zminimalizowania tych problemów. Po pierwsze, mózg jest szybko ekstrahowany i umieszczany w lodowatym, zimnym, ubogim w wapń, sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym.

Hipopotamy campi są następnie delikatnie usuwane na lodowatym etapie preparacji, a plastry hipokampa są przygotowywane za pomocą vibrato i inkubowane w natlenionym wapniu zawierającym A CSF. Wreszcie, potencjały i prądy synaptyczne są wywoływane w wielu subregionach hipokampa i rejestrowane, a uzyskane wyniki pokazują wpływ starzenia się i/lub patologii podobnej do choroby Alzheimera na funkcję synaps i plastyczność. Właściwe zastosowanie tej techniki ma wpływ na związane z wiekiem pogorszenie funkcji poznawczych i demencję spowodowaną chorobą Alzheimera.

Dzieje się tak, ponieważ dysfunkcja synaps jest jednym z najwcześniejszych biomarkerów tych objawów klinicznych wskazujących na tę procedurę. Dzisiaj będzie dr Chris Norris, kierownik laboratorium obok dużego zlewu. Przygotuj obszar sekcji do usunięcia mózgu i rozwarstwienia hipokampa.

Dołącz złożony ręcznik papierowy, ostrze skalpela numer 11, nożyczki BB, kości i narzędzie do hipokampa, specjalistyczną podwójną szpatułkę z drobnego narzędzia chirurgicznego. Umieść również małe nożyczki chirurgiczne, cienką szpatułkę, plastikową pipetę do peor, bibułę filtracyjną watmana, 100-milimetrową szklaną szalkę Petriego wypełnioną lodem, plastikową łyżkę i zlewkę z częściowo rozmrożonym wapniem. Płyn mózgowo-rdzeniowy pokryty parametrem.

Po ścięciu głowy szczurowi. Mózg powinien zostać usunięty tak szybko, jak to możliwe. Połóż głowę na ręczniku papierowym za pomocą skalpela, szybko wykonaj nacięcie na środku skóry głowy od kości nosowej do kości potylicznej.

Pamiętaj, aby całkowicie przeciąć mięsień skóry, całkowicie odsłaniając szwy czaszki. Mocno przytrzymaj głowę i przetnij płytki potyliczne, ciemieniowe i czołowe wzdłuż szwu linii środkowej. Upewnij się, że dolne nożyce mocno przylegają do wewnętrznej powierzchni czaszki i trzymają się z dala od mózgu.

Ma to kluczowe znaczenie, aby zapobiec niezamierzonemu żłobieniu. Następny slajd. Jurorzy Ron znajdują się pod lewą płytką ciemieniową i ściskają szczęki razem, zwijając się w górę i do przodu, aby odciągnąć płytki ciemieniowe i potyliczne.

Jeśli to konieczne, użyj jurorów Ron, aby usunąć również lewą przednią płytę. Powtórz dla drugiej półkuli. Po przemieszczeniu płytek użyj ławników lub nożyczek Ron, aby delikatnie odciągnąć lub odciąć oponę twardą, która może być przyczepiona do płytek skroniowych i rozciągnięta na powierzchni mózgu.

Teraz wsuń ławników Rona między mózg a prawą płytkę skroniową, utrzymując nacisk w kierunku czaszki i z dala od mózgu. Ściśnij i przekręć płytkę skroniową, aż usłyszysz lub poczujesz chrupnięcie. Powtórz dla lewej strony.

Przesuń szeroką szpatułkę przed narzędziem hipokampa między brzuszną powierzchnią mózgu a dolną płytką czaszki, aż znajdzie się całkowicie pod mózgiem. Przesuń go na boki z boku na bok oraz kilka razy do przodu i do tyłu, aby przeciąć nienaruszone nerwy czaszkowe za pomocą narzędzia hipokampa. Wyjmij mózg i zanurz go w bezwapniowym płynie mózgowo-rdzeniowym A przykryj perfumami i pozwól mu ostygnąć przez około minutę.

Aby wydobyć hipopotama campi, użyj łyżki, aby pobrać mózg z płynu mózgowo-rdzeniowego A i umieść go na zwilżonym płynie mózgowo-rdzeniowym na pokrywie lodowatej szalki Petriego. Za pomocą ostrza skalpela usuń móżdżek i około jednej czwartej rostralnych płatów czołowych. Teraz przetnij szczelinę wewnątrz półkuli, aby całkowicie oddzielić dwie półkule.

Umieść jedną półkulę z powrotem w błocie pośniegowym A CSF, a drugą postaw na etapie preparowania tak, aby płaszczyzna koronalna płata czołowego była skierowana w dół, biały pień mózgu i śródmózgowie powinny być łatwe do odróżnienia od różowej lub szarawej kory pokrywającej. Zlokalizuj kalus na śródmózgowiu. Będą one wyglądać jak dwie białe gałki i będą znajdować się w górnej części mózgu.

W tej orientacji delikatnie przytrzymaj śródmózgowie nożyczkami i wsuń szpatułkę między kalusy a korę. Następnie delikatnie odciągnij pień mózgu, śródmózgowie i wzgórze. Tkanka łączna lub naczynia krwionośne mogą wymagać przecięcia nożyczkami.

Użyj ostrej krawędzi szpatułki, aby odciąć sklepienie. Wiązka białych włókien znajdująca się w przedniej grzbietowej części hipokampa. Nożyczkami delikatnie kontynuuj odciąganie pnia mózgu, śródmózgowia i wzgórza, nie odcinając go całkowicie od reszty mózgu.

Białe fi włókien, które tworzą płytką hiperbolę na dnie hipokampa, powinny być teraz widoczne w tej orientacji. Za pomocą pipety transferowej delikatnie wstrzyknij trochę płynu mózgowo-rdzeniowego A w szczelinę pod FIA, aby pomóc oddzielić hipokamp od kory mózgowej. Delikatnie wsuń szpatułkę w tę szczelinę i trzymając mocno nożyczkami pień mózgu, śródmózgowie i wzgórze, delikatnie odsuń hipokamp, delikatnie przytnij pozostałą korę, naczynia krwionośne i istotę białą z dala od hipokampa.

Dous z kilkoma mililitrami płynu mózgowo-rdzeniowego. Za pomocą pipety transferowej utrzymuj tkankę mokrą i zimną z płynem płynu mózgowo-rdzeniowego. Następnie usuń drugą półkulę i powtórz sekcję, aby przeciąć hipopotama szczura Campi.

Napełnij zbiornik vibrato lodowatym, wolnym od wapnia płynem CSF, tak aby stopień cięcia i ostrze były całkowicie zanurzone. Użyj skalpela, aby odciąć końcówki rostralne i rozpieszczone każdego hipokampa i ustaw je razem na powierzchniach rostralnych z zakrętem zębatym każdego hipokampa skierowanym do siebie. Przyklej tkankę mózgową do bloku montażowego i przenieś ją do etapu cięcia vibrato.

Do eksperymentów z fizjologią synaptyczną zalecane są skrawki 400 mikrometrów. Za pomocą pipety do przenoszenia z szeroką szyjką przenieś plastry na małą szalkę Petriego zawierającą lodowaty wapń. Płyn CSF.

Po zakończeniu krojenia plastry przenosi się do komory przetrzymywania, wypełnionej utlenionym wapniem zawierającym A CSF. Stopniowo zwiększaj temperaturę komory od 27 stopni do 32 stopni Celsjusza, aby wykonać podstawowe nagrania zewnątrzkomórkowe. W ostrych warstwach komora rejestracyjna jest umieszczona na stoliku mikroskopu w taki sposób, że przedwojenny płyn mózgowo-rdzeniowy A jest grawitacyjnie podawany przez regulator przepływu i usuwany przez centralną linię próżniową.

Za pomocą małego pędzla przenieś plasterek do komory nagrywającej tak, aby był zanurzony w płynie mózgowo-rdzeniowym A i spoczywał na włożonej siatce. Pozwól plasterkowi zaaklimatyzować się przez 10 do 15 minut. Podczas aklimatyzacji wycinka włącz stymulator lub izolator bodźca i zmniejsz moc wyjściową do zera.

Następnie umieść elektrodę stymulującą nad warstwą w obszarze atomu promieni warstwy ca dwa w pobliżu granicy około trzech. Opuść elektrodę rejestrującą do około jednego atomu promienia warstwy, łamiąc powierzchnię plasterka. Zwiększ tutaj moc wyjściową stymulatora do umiarkowanego poziomu.

Izolator bodźca jest ustawiony na około 150 mikroamperów. Powoli opuszczaj elektrodę stymulującą w małych odstępach czasu, aż zostanie zarejestrowany artefakt bodźca. W ciągu jednego kontynuuj powolne obniżanie zarówno elektrod stymulujących, jak i rejestrujących w odstępach czasu, jednocześnie uzyskując odpowiedzi CA one.

Dopóki salwa włókien i pobudzające amplitudy potencjału postsynaptycznego nie osiągną maksymalnego poziomu za pomocą programu do akwizycji oprogramowania, takiego jak zacisk X, ustal krzywą siły synaptycznej. Następnie użyj oprogramowania, aby dostarczyć bodźce o różnej intensywności i zarejestrować odpowiednią aktywność w ciągu jednego dnia. Zakres i liczba użytych poziomów intensywności bodźca powinny być wystarczające do wygenerowania krzywej sigmoidalnej, gdy są wykreślane w stosunku do wartości FV lub EPSP.

Następnie, aby zbadać plastyczność synaptyczną, zresetuj intensywność bodźca dla każdego wycinka, tak aby wywołać odpowiedź o wartości jednego miliwolta. Rozpocznij stymulację wyjściową z częstotliwością 0,033 Hz EPSP. Wartości nachylenia powinny być stabilne przez co najmniej 20 minut przed indukcją długotrwałego nasilenia LTP lub długotrwałej depresji LTD.

Aby zarejestrować okres linii bazowej, użyj pliku parametrów clampy X do stymulacji i nagrywania co 30 sekund. Obok indukcji LTP otwórz osobny plik parametrów indukuj LTP za pomocą jednosekundowego ciągu stymulacji 100 Hz lub wielu krótkich serii stymulacji 200 Hz podawanych co 200 milisekund dla indukcji LTD. Dostarcz 900 impulsów bodźcowych z częstotliwością jednego herca.

Po tym, jak bodźce pociągi przełącz się z powrotem do pliku parametrów linii bazowej i zbieraj odpowiedzi synaptyczne przez 60 minut lub dłużej. Porównaj wartości nachylenia EPSP uzyskane przed i 60 minut po stymulacji o wysokiej niskiej częstotliwości, aby określić obecność LTP wskazywaną przez wzrost siły synaptycznej lub LTD wskazywaną przez spadek siły synaptycznej. Powszechnie uważa się, że oba procesy odzwierciedlają krytyczne mechanizmy uczenia się i pamięci.

Tutaj reprezentatywne krzywe siły synaptycznej z dwóch różnych wycinków hipokampa z dwóch A PP PS. Pokazana jest jedna mysz. Jedna mysz była leczona nowym przeciwzapalnym odczynnikiem wirusowym związanym z adenowirusem. Drugi był leczony kontrolowanym odczynnikiem wirusowym.

Jak można zaobserwować, gdy podobna liczba włókien presynaptycznych jest aktywowana w różnych warunkach leczenia. Gdy grupy wykazują podobne amplitudy FV, jak wskazano na osi x, krzywa warstwy odczynnika a jest przesunięta w lewo, co wskazuje na większe amplitudy EPSP. Dane te pokazują, że podstawowa siła synaptyczna jest większa w odczynniku, który pokazano w wycinku poddanym działaniu środka.

Oto wyniki eksperymentów LTP przeprowadzonych na tych samych wycinkach. Należy zauważyć, że wartości nachylenia EPSP w odczynniku A są znacznie większe w stosunku do warstwy kontrolnej w ciągu jednej godziny po dostarczeniu stymulacji 100 Hz, co wskazuje, że LTP był obecny w odczynniku w warstwie, ale nie w wycinku kontrolnym. Ten rysunek pokazuje, jak wyglądały kształty fal EPSP w odczynniku A i kontrolnych wycinkach myszy przed i 60 minut po dostarczeniu stymulacji 100 Hz.

Wzrost nachylenia EPSP w okresie po 100 hercach jest bardzo wyraźny w odczynniku, a wycinek wskazujący na LTP razem. Eksperymenty na przedstawionych do tej pory rysunkach wskazują, że odczynnik A zwiększa siłę synaptyczną i łagodzi deficyty LTP. U myszy PP PS podobne eksperymenty przeprowadzono na LACS w hipokampie od starszych szczurów.

Tutaj pokazano krzywe siły synaptycznej z dwóch różnych wycinków hipokampa od szczura leczonego nowym lekiem przeciwzapalnym i innego szczura leczonego odczynnikiem kontrolnym. Należy zauważyć, że krzywe te są bardzo podobne dla dwóch wycinków, co wskazuje, że lek A ma niewielki wpływ na podstawową siłę synaptyczną. Ten rysunek przedstawia wyniki eksperymentów LTD przeprowadzonych na tych samych wycinkach.

Należy zauważyć, że typowe dla starszych szczurów wartości nachylenia EPSP w wycinku poddanym działaniu nośnika są obniżone w ciągu jednej godziny bazowej po dostarczeniu jednej z jej stymulacji. Jednak wartości nachylenia EPSP w wycinku leku wykazują niewielką lub żadną depresję, co wskazuje na brak LTD, pokazane tutaj są przebiegi EPSP z plastrów leku A i szczura nośnego przed i 60 minut po dostarczeniu stymulacji jednym hercem. Spadek nachylenia EPSP w okresie po jednym hercu jest bardzo widoczny w warstwie nośnika, ale nie w leku kawałek razem.

Wyniki przedstawione na tych rysunkach pokazują, że lek A łagodzi różnice plastyczności u starszych szczurów blokujących indukcję LTD, ale nie wpływa na podstawową funkcję synaptyczną. Dane te pokazują, że wiele parametrów funkcji synaptycznej i plastyczności u starszych szczurów i myszy modelowych z chorobą Alzheimera może być modulowanych przez eksperymentalne terapie i podkreślają przydatność ostrych wycinków hipokampa do badania potencjału nootropowego i/lub neuroprotekcyjnego eksperymentalnych nowych leków i odczynników. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o zrównoważeniu prędkości i ekstrakcji mózgu z precyzją i delikatnością oraz preparowaniu, krojeniu i obchodzeniu się z hipokampem w celu pomiaru elektrofizjologicznego.